이 연구는 NIH 교부 금 HL66299 TS, RB, 및 SL, TS에 HL60024 및 HL136869 mf에 의해 부품에 투자 되었다.

모든 동물 절차 검토 했다 기관 동물 관리 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학에 의해 승인 하 고 모든 연방, 주, 및 현지 규정에 따라 수행 했다. 쥐 폐 microvascular 내 피 세포 (PMVECs)의 기본 문화 폐 생물학의 사우스 알라바 마 대학의 센터에서 셀 문화 핵심 시설에서 얻은 했다. 셀 앞에서 설명한 절차16를 사용 하 여 준비 되었다.
1입니다. 세포 독성 Supernatants의 세대
참고: 여기, 우리가 피 녹 농 균의 두 가지 변종이 사용: PA103 그대로 유형 III 분 비 시스템이 감염, 및 ∆PcrV는 유형 III 분 비 체계 부족 하는 동안 대상 셀에 ExoU 및 ExoT exoenzymes를 전송할 수 있는 접종을 다음 대상 셀에 exoenzymes 전송의 능력이.
<ol><li>보 글 보 너 (VB) 한 천 격판덮개17 에 박테리아를 행진 하 고 37 ° c.에 하룻밤 성장<ol>
<li>접시를 준비 하려면 확인 다음 재고 솔루션 (보 글 보 너 염; 10 x 주식): 2 세대 MgSO4, 20 g 구 연산 (자유로운 산), 100 g K2포4및 35 g NaH2포4측정. 1 L와 느린 배기 15 분 압력솥 ddH2O를 추가 합니다.</li>
		<li>450 mL ddH2O 한 천 7.5 g와 압력솥 위와 같이 배치 합니다.</li>
		<li>압력가 마로 소독, 다음 두 솔루션을 50 ° C 물 목욕으로 놓습니다.</li>
		<li>천 하 10 x VB 재고 소금 솔루션 50 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>400 µ g/l (사용 중인 피 녹 농 균 의 변종)에 carbenicillin를 추가 하 고 플라스 크를 소용돌이로 잘 섞어.</li>
		<li>장소 5 mL 개별 멸 균 문화 요리에 VB agar 솔루션의 응고, 및 다음 세균성 시드의 날 때까지 4 ° C에서 저장 한을 수 있습니다.</li>
		<li>세균성 시드 날, 미리 37 ° C에 접시를 따뜻하게 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 격판덮개에 박테리아를 행진 합니다. 장소는 37 ° C 배양 기에서 접시 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 Griffonia simplicifolia 와 긍정적인 얼룩에 의해 PMVEC 순도 확인 lectin 및 형광으로 부정적인 얼룩이 지기 나선 pomatia lectin (동맥 내 피 세포에 대 한 표식). Aliquot 세포와 동결에 액체 질소입니다.</li>
	<li>실험, 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10% 태아 둔감 한 혈 청, 보충을 유지 하 고 5% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 세포 성장. 세포를 사용 하 여 구절 5-15에서.<ol>
<li>세포 독성 supernatants의 생성, 2 x 106 셀 개별 150 cm 요리에 접시 및 합류 달성 될 때까지 3-4 일에 대 한 성장. 실험 (아래 참조) 당 두 접시를 사용 합니다.</li>
		<li>세포 독성 supernatants의 분석, 대 한 6-잘의 개별 우물으로 플레이트 1 x 105 셀 접시 하 고 4 일 합류 달성 될 때까지 성장 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상쾌한 생산, 세척 단계 1.3.1 인산 염 버퍼 염 분에서에서 PMVECs의 두 150 cm 요리 중 하나, trypsinize, 및 다음 셀 계산 (우리는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라; 테이블의 자료를 참조). PMVECs와 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 다른 접시를 세척 하 고 중 긴장 20: 1의 감염 (MOI)의 다양성에 피 녹 농 균 의 감염. 이것은 다음과 같이 얻을 수 있습니다:<ol>
<li>P. 녹 농 균,540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL 명이. 이 희석을 준비 하려면 1 mL HBSS 1 mL 일회용 cuvette을 추가 합니다. 0.25의 OD540 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 달성 될 때까지 단계 1.1에서에서 준비 된 접시의 충분 한 박테리아를 다쳤어요. 다음 단계는 박테리아를 필요 합니다 얼마나 많은 계산을 제공할 것입니다.</li>
		<li>문화 접시에 있는 PMVECs의 수 결정 되 면 (1.4 위의 단계), 박테리아는 PMVECs를 포함 하는 두 번째, 비 trypsinized 문화 접시에 추가 수 수 확인. 예를 들어 결정 되는 PMVECs의 문화 접시 107 셀 x 1.3를 포함 다음 준비 107 셀 x 20 박테리아/셀 x 1 mL/2 x 108 CFUs x 1.3 = 1.3 mL 박테리아.</li>
		<li>희석 박테리아의 1.3 mL HBSS로 20 mL의 최종 볼륨을 150 cm 접시의 전체 표면 액체, 커버 될 수 있다 다음 PMVECs의 접시에 희석된 박테리아를 추가.</li>
		<li>PMVECs 간격 셀 단층에 형성 하는 접시를 현미경으로 관찰 하면 볼 수 있습니다 때까지 4-5 시간, 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 박테리아와 주사 (참조 그림 1 갭 형성의 적절 한 수준에 대 한)를 품 어.</li>
		<li>상쾌한, 수집 다음 세포 파편을 제거 하는 탁상 원심 분리기에서 2000 x g에서 10 분 원심. 참고: 모든 탁상용 원심 분리기 생성 충분 한 g 수 강제 작은 unlysed 세포와 큰 세포 파편이이 단계에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>박테리아를 제거 하는 필터에 통과 상쾌한 다음 그것의 끝에 연결 된 0.2 µ m 필터 주사기에는 상쾌한 하 거 라.</li>
		<li>메 마른 상쾌한의 약 수를 사용 하 여 세포 독성 시험 (2.1 참조) 나중에 사용-80 ° C에서 상쾌한의 나머지 부분을 고정 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 세포 독성 Supernatants의 분석
<ol><li>세포 독성 분석 실험<ol>
<li>6 잘 요리에서 PMVECs 합류까지 성장. 워시 우물 한번 HBSS, 다음 추가할 필터 소독 상쾌한 (어느 PA103 또는 ∆PcrV 주사 셀에서 수집)의 1.5 mL 개별 웰 스. 부정적인 통제로 또 다른 우물을 메 마른 HBSS를 추가 합니다.</li>
		<li>21-24 h에 대 한 CO2 인큐베이터에 접시에 놓은 다음 셀 살인/세포 독성에 대 한 관찰 (다음 단계 참조). 추가 실험에 대 한 세포 독성을 전시 supernatants 사용 하 고 그 셀 죽이 표시 되지 않는 삭제.</li>
		<li>셀 죽의 정량<ol>
<li>상용 LDH 시험 키트와 제조 업체의 사용 하 여 죽은 세포에서 측정 젖 산 효소 (LDH) 릴리스 절차를 권장 합니다.</li>
			<li>또는, 계량 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 현미경으로 세포 살해. 이 위해, 미세한 이미지와 그대로 셀을 포함 하는 문화 접시의 영역 기록 다음 셀 (지표는 단층에 세포 죽음의) 부족 한 영역을 계량 사용자 지정 ImageJ (국립 보건원) 매크로 (참조 보충 코딩 파일을 사용 하 여 ). 원하는 경우 매크로 단계 다음과 같이 수동으로 수행:<ol>
<li>매크로에 이미지 (RGB 또는 Tiff 형식)을 입력 하 고 15% 포화 픽셀 대비를 조정 합니다. 대비 조정 이미지를 복제 하 보기의 필드 내에서 세포와 간격 영역의 높은 콘트라스트 이미지를 "배경 빼기" 명령을 수행 합니다.</li>
				<li>이 이미지는 원래 이미지에서 빼기 하 고 이미지 계산기 "AND" 함수를 사용 하 여 원본 이미지와 결과 이미지를 결합. 블랙 (간격) 및 임계값 기능 (최소 0, 최대 5 개), 화이트 (셀) 마스크 결과 이미지를 변환 하 고 "이진 침식" 함수를 사용 하 여 이미지에서 노이즈를 제거.</li>
				<li>"지역 분수" 측정을 사용 하 여 결과 이미지에서 흰색 픽셀을 검정의 비율을 측정 합니다. 줄거리와 각 치료 시간에 대 한 익스프레스 소수 지역 최대 간격 영역의 % 포인트.</li>
				<li>계산 방법 및 Tukey의 포스트 hoc 테스트, p 값이 0.05 중요 하 게 고려 보다 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 비교 합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>문화 supernatants에 아 밀 로이드, oligomeric 타우, 및 Aβ의 존재를 확립 immunoblot 분석을 사용 합니다. Immunoblot 분석 표준 절차10,11,12, 전기 이동 법 전에 적어도 10 문화 supernatants 집중 제외를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>상쾌한 집중, 상쾌한의 1-2 mL 인 막 10 kDa의 분자량 컷오프는 원심 필터 단위에 배치 합니다. 그런 다음 필터 단위 배치 탁상용 원심 분리기 및 원심 분리기 2000 x g 필요한 정도의 농도가 될 때까지 (보통 45-60 분)를 달성.</li>
			<li>집중 되어 표면에 뜨는11 에서 단백질의 양을 결정 하 고 젤의 개별 우물으로 동일한 양의 샘플을 로드 합니다.</li>
			<li>니트로, 단백질 전송 다음 A11 안티 아 밀 로이드 항 체, T22 안티 oligomeric 타우 항 체, 또는 뒤에 적절 한 2 차 항 체는 MOAB2 안티-Aβ 항 체도 말 프로브 젤을 실행 합니다. 개발 표준 화학 절차를 사용 하 여도 말.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thioflavin T 시험을 하기 위해 계량 supernatants에서 amyloids thioflavin T 형광 (ThT)를 사용 합니다. 이러한 측정 supernatants 살 균 하는 필터를 사용 합니다.<ol>
<li>10 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 8 mg thioflavin T (ThT)를 일시 중단 하 여 재고 솔루션 (50 x) thioflavin T 준비 합니다. 혼합 후, 0.22 μ m 필터 입자 제거를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
			<li>측정을 위해 1 mL 분 광 광도 계 베트에 PBS의 1 mL를 ThT 주식의 20 µ L를 추가 합니다. 장소는 spectrofluorimeter로 희석된 샘플입니다.</li>
			<li>측정 기준 형광 방출 425 nm 여기를 사용 하 여 및 2 nm 단위로 450-575 nm에서 형광 방출 스캔 합니다.</li>
			<li>425 nm 여기를 사용 하 여 시간 경과 검사 수행 및 482 nm 방출, 데이터 취득 모든 0.2의 60에 대 한 s.</li>
			<li>초기 20 시간 경과 검사의 측정 빈 베트에 형광. 20 s, 검사를 일시 중지 하 고는 베트에 필터 살 균 상쾌한의 10 µ L를 추가. 반전으로는 베트를 혼합 하 고는 spectrofluorimeter로 다시 다음 장소.</li>
			<li>최종 40 획득 시간을 기준으로 검색을 다시 시작 데이터의 s.</li>
			<li>완료 되 면 시간 경과 스캔, 2.1.5.3에 같이 동일한 설정을 사용 하 여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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보고서에 없음입니다.

여기 방법 간단한 체 외에 유기 체를 일으키는 폐 렴으로 감염 시 세포 독성 amyloids의 세대의 데모를 허용 하는 설명 되어 있습니다. 이러한 방법에는 세포 배양 세포 독성 분석 실험, immunoblotting, 소설 현미경 방법 및 ThT 바인딩을 사용 하 여 죽이 세포의 정량 포함 됩니다. 그들은 자연 (그림 2 및 그림 4)에서 아 밀 로이드 이며 전시 ...

폐 렴 생존 하는 환자의 병원 방전1,을 따르는 달에서 사망률 높은2,,34,,56. 대부분의 경우, 죽음은 치기5,6뿐만 아니라 최종 기관 실패 신장, 폐, 심장, 또는 간 이벤트의 어떤 종류에 의해 발생 합니다. 이 환자 인구에 있는 높은 사망 율을 위한 이유는 결코 설립 되었습니다.
폐 렴으로 인수 되 고 중 커뮤니티-분류 또는 병원 인수 (nosocomial), 그리고 폐 렴을 일으킬 수 있는 에이전트 포함 박테리아, 바이러스, 버섯, 그리고 화학 제품. 병원내 폐 렴의 주요 원인 중 하나는 녹 농 균박테리아입니다. P. 농 균 exoenzymes 대상 셀7,8의 세포질에 직접 되 나 다양 한 이펙터 분자 전송 유형 III 분 비 시스템을 사용 하는 그램 음성 유기 체 이다. 폐 내 피 세포의 감염, 동안에 exoenzymes 대상 microtubule 관련 단백질 타우9,,1011,12의 내 피 형태를 포함 하 여 다양 한 세포내 단백질 , 폐 기능 그리고, 때때로, 죽음 감소 심각한 폐 부 증의 결과로 내 피 장벽 붕괴에 지도.
앞에서 설명 했 듯이, 초기 폐 렴을 생존 하는 환자의 병원 방전에 따라 첫 12 개월에 사망률 높은 있다. 이 현상을 설명 하는 잠재적인 메커니즘은 빈약한 장기 결과 리드 초기 감염 시 생성 되는 장 독 소의 일부 형식을. 두 가지 관찰이이 가능성을 지원합니다. 첫째, 교양 폐 내 피 세포 처음 P. 농 균 으로 취급 되는 박테리아는 항생제13에 의해 사망 후 주일 대에 실패 합니다. 둘째, 수명이 긴 prions 및 에이전트 프리온 특성을 가진 다양 한 인간과 동물 질환, 신 경계14,15와 관련 된 질병 특히 입증 되었습니다.
폐 감염 시 수명이 긴 세포 독성 대리인의 잠재적인 생산을 조사 하기 위한 방법 적 설명 했습니다. 일련의 간단한 체 외에서 분석 설명 되어 있습니다 여기 cytotoxin 생산 및 사용 하는 일반적인 폐 렴 원인이 에이전트, P. 녹 농 균감염 다음 활동 조사를 위해 사용할 수 있습니다. 이 분석 실험 조사 가능한 cytotoxin 유도 감염 원인이 폐 렴, 다른 에이전트를 사용 하 여 다음에 쉽게 적응할 수 있어야 하 고 또한 생성 된 supernatants 전체에서 cytotoxins의 효과 조사 하는 데 유용 해야 기관 또는 동물입니다. 마지막으로,는 여기에 설명 된 가능성이 가장 분석 실험 동물 및 인간의 생물 학적 체액 폐 렴 중 cytotoxins의 생산을 위한 테스트에 적응할 수 있을 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amyloid oligomer antibody</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomer antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat antirabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Strains PA103 and &amp;Delta;PcrV</td><td></td><td></td><td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Type 2 collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium salt</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium phosphate heptahydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

누가 살아남을 폐 렴 환자 병원 방전을 따르는 달에서 사망률 높은 있다. 그것은 폐 렴 중 폐 조직의 감염 이후의 끝 기관 실패를 이끌어 낼 수 있는 오래 된 cytotoxins의 생산에 결과 가설 되었습니다. 생체 외에서 분석 실험 폐 감염 시 cytotoxins 생산 가설 테스트를 개발 했습니다. 고립 된 쥐 폐 동맥 내 피 세포 및 박테리아 녹 농 균 모델 시스템으로 사용 되 고 cytoxins 내 피 세포의 감염 박테리아에 의해 다음의 생산 세포 배양 뒤를 사용 하 여 설명 된다 젖 산 효소 분석 실험 및 ImageJ 기술을 활용 하 여 새로운 미세한 메서드를 사용 하 여 직접 정량. 이러한 cytotoxins의 녹말 체 자연 및 immunoblotting 및 A11 안티 아 밀 로이드 항 체를 사용 하 여 immunodepletion thioflavin T 바인딩 분석 실험에 의해 입증 되었다. Immunoblotting를 사용 하 여 추가 분석 oligomeric 타우와 Aβ 생산 했 고 피 녹 농 균에 의해 감염에 따라 내 피 세포에 의해 발표는 설명 했다. 이러한 방법은 인간의 임상 샘플의 분석에 쉽게 적응할 수 있어야 합니다.

간단한 생체 외에서 시험 셀 박테리아 P. 녹 농 균감염의 supernatants에 cytotoxins의 존재에 대 한 분석 결과를 개발 되었습니다. 기본적으로, 감염 된 세포에서 배양 후 세균 또한 4 h 수집, 박테리아의 표면에 뜨는, 문화 살 균 필터에 의해 제거 되 고 살 균 상쾌한 셀의 새로운 인구에 추가 됩니다. 셀은 다음 상쾌한의 추가 후에 21-24 h를 관찰 하 고 셀 죽이 정량....

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K 조회수.  University of South Alabama. 간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

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Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

연구

생화학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

면역학 및 감염병학

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes susceptibility to bacterial infections in the respiratory system. However, the effects of cigarette smoking on bacterial infections in human lung epithelial cells have yet to be thoroughly studied. Described here is a detailed protocol for the preparation of cigarette smoking extracts (CSE), treatment of human lung epithelial cells with CSE, and bacterial infection and infection determination. CSE was prepared with a conventional method. Lung epithelial cells were treated with 4% CSE for 3 h. CSE-treated cells were, then, infected with Pseudomonas at a multiplicity of infection (MOI) of 10. Bacterial loads of the cells were determined by three different methods. The results showed that CSE increased Pseudomonas load in lung epithelial cells. This protocol, therefore, provides a simple and reproducible approach to study the effect of cigarette smoke on bacterial infections in lung epithelial cells.

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Described here is a protocol to study how cigarette smoke extract affects bacterial colonization in lung epithelial cells.

폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...