Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

우리 기술 지원에 대 한 레이첼 B. Chanin와 알 레 한 드 야 노스 Chea 감사합니다. 우리가이 연구에 사용 된 긴장에 대 한 앤서니 T. Maurelli, 브라이언 P. 헐리, 알 레 파 사노, 브렛 E. Swierczewski, 그리고 바비 Cherayil 감사 합니다. 이 작품은 알레르기의 국가 학회 및 감염 질환 그랜트 K22AI104755 (C.S.F.)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

1입니다. 시 약의 준비
<ol><li>담 즙 염 매체: 준비 하려면 tryptic 간장 국물 (TSB) 0.4% 담 즙 염 (무게/볼륨)를 포함, 50 mL에 담 즙 염의 200 mg resuspend 압력가 TSB. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 매주 신선한 매체를 확인 합니다. 참고: 정기적으로 사용 하는 담 즙 염 나트륨 cholate와 나트륨 deoxycholate 양 및 소 gallbladders에서 고립의 1:1 혼합물 이다. 같이 이전4, 포도의 존재 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 위해 필요 했다. TSB은 Luria Bertani (파운드) 국물; 상대적으로 포도 당을 추가 했습니다. 따라서, 이질균 및 다른 장 병원 체 분석에 biofilm 형성을 유발 하기에 충분 했다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도 당 농도 또는 다른 설탕 요구 사항이 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>0.5 물에 %w / v 크리스탈 바이올렛: 2.5 g 크리스탈 바이올렛 500ml 소 주 물에의 해산. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독.</li>
	<li>Fluorescein isothiocyanate (FITC)에 활용 된 Concanavalin A (ConA): 1 x PBS에 재고를 다시 구성 하기. 25 µ g/mL의 최종 농도에 1 x PBS의 400 μ와 10 mg 집중 재고 희석 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.</li>
	<li>PBS + 포도 당: 10 mL 1 x PBS (마지막 2 %w / v 포도) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>PBS + 담 즙 소금: 10 mL 1 x PBS에서 40 mg을 분해 (0.4 %w / v 담 즙 염 최종). 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>PBS + 포도 당 및 담 즙 소금: 40 mg 담 즙 염과 10 mL 1 x PBS (0.4 %w / v 담 즙 염과 포도 당 2 %w / v 최종) 포도 당 0.2 g을 분해. 필터는 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 사용 당일 신선한 확인 합니다.</li>
	<li>파운드 한 천 배지를 준비 합니다.</li>
	<li>포름알데히드/글 수정: 추가 810 µ L 포름알데히드 (37% 재고 솔루션, 최종 농도 3%)와 14 mL 1 x PBS 125 µ L도 (25% 재고 솔루션, 0.25% 최종 농도). 철저 하 게 혼합 하 고 4 ° c.에 저장 수정 프로그램은 적절 한 사용에 대 한 감기 이어야 한다. 주의: 수정 유독 하 고 유해 폐기물 처리를 요구 한다.</li>
	<li>Antifade mountant 솔루션: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 포함 하는 antifade mountant 솔루션을 사용 하 여 붙일 박테리아의 DNA를 착 색 하는 동안 immunofluorescent 현미경 샘플의 photobleaching를 억제.</li>
</ol>2입니다. 박테리아의 준비
<ol><li>메 마른 문화 관에서 단일, 잘 고립 된 식민지와 TSB의 3 mL를 접종 하 여 테스트할 세균성 긴장의 숙박 문화를 성장. 야간 보육 (16-24 h)에 대 한 225 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어. 참고: 긴장 해야 될 restreaked 냉장고 주식에서 매 2 4 주, 그리고 유지에 접시를 더 2 주 이상.</li>
</ol>3. 고체 상 준수 분석 결과
참고:이 분석 결과 96 잘 접시 메서드를 사용 하 여 부착 박테리아 단정. 박테리아는 편평한 바닥 접시에서 정적으로 성장 된다. 세탁 비 점착 박테리아를 제거 하 수행 되 고 부착 박테리아 크리스탈 바이올렛으로 얼룩이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 박테리아 세포 벽에 peptidoglycan 한다 에탄올을 사용 하 여 solubilized 될 수 있습니다. 부착 박테리아의 수는 크리스탈 바이올렛 보존에 따라 결정 됩니다.
<ol><li>두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + 담 즙 염 (BS)와 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).</li>
	<li>살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 3 제어 웰 스 (TSB와 TSB + 학사) 테스트를 각 미디어 유형에 대 한 설정.</li>
	<li>3 웰 스로 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.</li>
	<li>37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.</li>
	<li>플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세600 값을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>배양 접시를 부드럽게 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 매체를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 세균성 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다. 경우 EPS 매트릭스 인큐베이션 기간 동안 제작 되었다, 매트릭스 흰색 침전으로 구상 될 것입니다. EPS 매트릭스를 방해 하지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게 세척 한 번 200 µ L 살 균 PBS와 우물. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.</li>
	<li>접시 건조를 반전. 건조 20 분의 최소를 허용 합니다. 참고: 때문에 biofilm 얼룩이 지기 전에 철저 하 게 건조 해야 합니다, 프로토콜 수 있습니다 몇 시간 동안이 단계에서 일시 중지 된 또는 심지어 하룻밤. 추가 건조 시간 동안 결과 재현성의 정량화에 영향을 미칠 것입니다 불완전 한 건조 얼룩 절차를 변경 되지 않습니다.</li>
	<li>150 µ L의 0.5% 크리스탈 바이올렛 각 실험 하 고 제어를 잘 추가 합니다.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>400 µ L의 증류수와 한 번 웰 스 워시. 추가 볼륨 우물의 측면에서 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 제거 하는 데 도움이 됩니다. 진공 라인 세척을 제거 합니다.</li>
	<li>5 번 증류수 200 µ L로 웰 스 워시. 진공 라인 세척을 제거 합니다. 참고: 철저 한 세척이 정량화에 대 한 중요 합니다. 때 빈 우물에 증류수에서 어떤 잔여 크리스탈 바이올렛 얼룩을 포함 하지 않습니다, 다음 단계로 진행 합니다.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 건조, 접시에 반전. 위에 언급 된 대로 접시의 완전 한 건조 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>95% 에탄올의 200 µ L로 웰 스 destain 30 분 동안 통에 접시를 품 어. 특히 높은 온도에서 증발을 피하기 위해 4 ° c.에이 단계를 수행</li>
	<li>플레이트 리더를 사용 하 여, OD540기록 합니다. 참고: 크리스탈 바이올렛의 최대 흡 광도 파장은 590 근처 nm. 문학에서 OD540 -OD5954,13,14,,1516 크리스탈 바이올렛 흡 광도;에 대 한 범위를 보고 따라서 파장 사용 가능한 플레이트 리더에 따라 선택 합니다.</li>
</ol>4. EPS 매트릭스 검색
참고:이 무료 분석 계량 하 고 EPS를 시각화. 모두에서 EPS 류 바인딩하는 lectin를 사용 하 여 검색 됩니다. 붙일 활용 된 단백질에는 정량화 (4.1 단계) 또는 시각화 (4.2 단계) 수 있습니다.
<ol><li>EPS의 반 정량적 검출<ol>
<li>두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.</li>
		<li>각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분 희석).</li>
		<li>살 균, 블랙, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다. 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.</li>
		<li>37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.</li>
		<li>피 펫, 이상적으로 멀티 채널 피 펫과 명확한 96 잘 접시에 문화 매체를 전송. 부착 인구 및 플라스틱 표면에 있는 EPS를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 하도록 주의 해야 합니다. 따로 설정 합니다.</li>
		<li>1 x PBS에 포름알데히드/글의 200 µ L/우물을 사용 하 여 실시간에 15 분 동안 검은 접시를 수정.</li>
		<li>부착 인구를 수정 하는 동안 단계 4.1.6에서에서 표면에 뜨는 부분을 평가 합니다. 플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 제어 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험.<ol>
<li>또는, 전체 분석 결과 검은 분명 바닥판에서 수행할 수 있습니다. 그 상황에서 OD600 값은 기록 될 수 하 고 문화 중간 이후에 4.1.7 단계로 진행 하기 전에 삭제 될 수 있습니다. OD600 값 정규화 데이터를 사용할 수 있는 경우에 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.</li>
		<li>부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 부드럽게 접시를 기울이기 및 우물의 아래쪽 가장자리에 워시를 천천히 발음 하 여 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.</li>
		<li>150 µ L/25 µ g/ml ConA FITC, 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>부드럽게 PBS의 200 µ L 두 번 씻어.</li>
		<li>각 우물에 PBS의 150 µ L를 추가 합니다. 488에서 형광 기록 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EPS 생산 및 biofilm 두께의 계산의 confocal 현미경 시각화<ol>
<li>두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.</li>
		<li>각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).</li>
		<li>라운드 유리 coverslips 살 균 멸 균 24-잘 접시 12 m m를 설정 합니다. 3 웰 스 빈 컨트롤 역할을 uninoculated 제어 미디어의 400 µ L/잘 추가 합니다. 테스트할 각 매체 형식에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.</li>
		<li>중복, 웰 스에 접종 문화의 400 µ L을 추가 하 고 모든 실험 조건 도금 될 때까지 반복.</li>
		<li>37 ° C에서 4-24 h에 대 한 정적으로 품 어.</li>
		<li>시각적으로 TSB 조건, 성장 및 EPS 침전 (흰색)는 TSB에 + 학사 조건, 성장 그리고 어떠한 성장/살 균 제어 우물에 흰 침전 또는 확인 합니다. supernatants 제거 합니다.</li>
		<li>1 x PBS에 포름알데히드/도 솔루션의 200 µ L/잘을 사용 하 여 실시간에 15 분에 대 한 수정.</li>
		<li>수정 프로그램을 제거 하 고 유해 폐기물 처분.</li>
		<li>부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.</li>
		<li>150 µ L/25 µ g/mL ConA FITC의 잘 추가 하 고 실시간에 15 분 동안 품 어</li>
		<li>부드럽게 PBS의 200 µ L/잘 두 번 씻어.</li>
		<li>DAPI antifade mountant 솔루션을 탑재 합니다. 참고: 솔루션 DAPI 하면서 동시에 counterstain으로 시각화를 위한 세균성 세포에서 DNA를 얼룩이 지기 형광 라벨을 보존 하기를 위한 포함 된 기성 품, 글리세롤 기반 마운트 솔루션이입니다. 이미징 샘플 전에 부 화 시간에 대 한 키트의 지침 및 권장 사항을 따릅니다. 절차를 얼룩 DAPI DAPI를 포함 하지 않는 antifade mountant 솔루션을 적용 하기 전에 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>Confocal 현미경 검사 법으로 평가 합니다. Confocal 현미경에 레이저 495 nm/519 nm 여기/방출 FITC 시각화에 대 한 설정. 두 번째 레이저 360 nm/460 nm 여기/방출 DAPI 시각화를 설정 합니다. DAPI 채널에 초점을 맞춤 으로써는 biofilm를 찾습니다. DAPI와 FITC 채널을 사용 하 여 전체 두께 결정 하 고 상단을 설정 하 고 낮은 테두리를 이미징. 기록 전체 두께 Z 스택 이미지 이미지를 포착 하 여 모든 0.25 µ m z-스택의 위아래에 경계를 설정 후. 에 대 한 자세한 내용은 confocal 현미경 검사 법를 참조 하십시오 게시에 의해 목장 외. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>ImageJ 전체 biofilm 형성을 시각화 하 고 계산 하는 biofilm 두께 (https://imagej.nih.gov/ij/)에서 3D 이미지를 재구성 합니다. S. flexneri 담 즙 소금 유도 biofilms 취득 평균 두께 14 µ m4이었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 분산 분석 결과
참고:이 분석 결과에서 세균 분산 통해 biofilm의 분해는 감지 됩니다. 여기, 성숙한 biofilms는 설립 하 고 이후 (보통 다음날), 미디어 PBS로 대체 또는 보완 PBS. 표면에 뜨는 구성 요소는 다음에 biofilm에서 해리는 박테리아의 수를 quantitate에 평가 됩니다.
<ol><li>두 개의 1.5 mL 튜브를 설정 합니다. TSB 또는 TSB + BS 레이블.</li>
	<li>각 관에 TSB 또는 TSB + BS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브의 숙박 문화 20 µ L 접종 (1시 50분에 희석).</li>
	<li>살 균, 분명, 플랫, 조직 문화 취급 96 잘 접시에서 130 µ L/잘 uninoculated 제어 미디어의 빈 컨트롤 역할을 3 개의 우물을 추가 합니다. 테스트할 각 미디어 유형에 대 한 3 개의 제어 웰 스를 설정 합니다.</li>
	<li>3 웰 스, 접종 문화의 130 µ L/잘 추가 하 고 모든 실험 조건은 3 중에서 도금 될 때까지 반복.</li>
	<li>37 ° C에서 4-24 h에 대 한 접시를 정적으로 품 어.</li>
	<li>계속 하기 전에 따뜻한 PBS, PBS + 포도 당, PBS + 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + 포도 당 37 ° c 이 시 약의 신선한 매일을 준비 합니다.</li>
	<li>플레이트 리더를 사용 하 여 세600기록 합니다. '텅 빈'으로 제어 웰 스를 설정 확인 하는 매체와 탁도의 증거가 분명 하다. 어떤 탁도 발견 되 면 폐기 실험. 세균성 긴장 사이 성장 율에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화 하 세600 값을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>진공 라인을 사용 하 여 문화 매체를 제거 합니다. 플라스틱 표면에 부착 인구를 방해 하지 않고 모든 문화 매체를 수집 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 세척 살 균 PBS의 200 µ L/우물으로 두 번 웰 스. 진공 라인을 사용 하 여 PBS 세척을 제거 합니다.</li>
	<li>3 우물에 다음의 130 µ L/잘 씻어 바꿉니다: PBS, PBS 포도 당, PBS 담 즙 염, 그리고 PBS + 담 즙 염 + + 포도 당. 이 시 약 37 ° c에 미리 데워 되어야 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 동안 접시를 품 어</li>
	<li>37 ° C 배양 기에서 접시를 조심 스럽게 제거. 신선 하 고 살 균 96 잘 접시는 supernatants 전송.</li>
	<li>10 배 준비 96 잘 접시 또는 희석 블록을 사용 하 여 (1:10) 살 균 PBS에는 상쾌한의 직렬 희석. 참고: 희석 시리즈 undiluted에서 테스트할 세균성 긴장에 따라 10-6 다양 해야 합니다. 파일럿 실험 최적의 희석 범위를 결정 하기 위해 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트 5 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 파운드 agar에 각 희석의 자리. 37 ° C에서 밤새 품 어. 복구 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 결정할 때 다음 날, 희석 비율에 대 한 계정에 식민지를 계산. X (100% 설정) PBS 제어 1 기준으로 백분율 분산을 계산 하려면 각 치료 조건에서 1 x PBS 컨트롤 샘플에서 CFU 복구에 의해 복구 CFU 나눕니다. 참고: 루틴 미디어 판 관심의 세균성 긴장에 대 한 사용할 수도 있습니다. 예를 들어 Shigella 콩고 레드 플레이트에 도금 될 수 있습니다. 플레이트는 적절 한 자리-도금 기술에 대 한 건조를 확인 하십시오.</li>
</ol>

저자 아무 공개 있다.

Biofilm 형성 분석 biofilms 그리고 긴장, 재료, 실험실, 및 분석 실험 사이 가변성의 동적 특성으로 인해 도전 이다. 여기 몇 가지 전략 biofilm 형성 재현성을 홍보를 제공 하는 실험적인 통찰력으로 담 즙 염 노출 다음 장 병원 체에서를 확인 하 되 게 됩니다. 재현성을 보장 하기 위해 추가 고려 사항이 있습니다. 맨먼저, 각각 관찰과 발생할 수 있는 변이 때문에 통계적 의미를 확인 하려면 기술 triplicate...

Biofilm 형성은 가혹한 환경 조건 동안 유도 하는 중요 한 세균 생존 전략 이다. 살 균 화합물에 노출 항생제 또는 영양소의 변화 또는 biofilm 형성을 통해 완화 될 수 있다 박테리아에 스트레스 상태를 유도 하는 산소 가용성. biofilm 표면 또는 다른 박테리아에 세균성 부착 특징은 고 류1,2,3의 주로 구성 된 EPS 매트릭스의 분 비를 동반 된다. Biofilm 형성 있는 이벤트의 성숙한 부착 세균성 지역 사회1,2,3의 형성에서 절정 동적 과정 이다. 박테리아 생성 adhesins adhesin 유전자 식 프로필 강화 biofilm 성숙 하는 동안 첨부 파일을 이동 하는 동안 초기 연결을 촉진 하기 위하여. 동시에, EPS 생산 코트 초기 스트레스 로부터 세포를 보호 하기 위해 행렬에서 세균성 지역 사회에 발생 합니다. 박테리아는 biofilm에 포함 된는 느린 성장; 따라서, 대부분의 항생제 효과 렌더링. 또한, 느린 성장 조건 세균성 성장1,2,3를 바꿀 때까지 에너지를 절약 합니다. 가혹한 조건, 통과 후 박테리아는 biofilm를 분산 하 고 planktonic 라이프 스타일1,2,3을 다시 시작. 전통적으로, biofilms 표면에 관찰 하 고 감염 저수지 카 테 터 및 주거에 장치1,2,3에 따른 지속적인 임상 도전 대표.
Biofilm 형성 했다 최근 몇 장 병원 체;에 대 한 설명 작은 창 자 또는 결 장4감염 박테리아. Shigella 종의, 에 대 한 감염 위장의 대부분을 통해 환승 후 인간의 콜론에서 발생합니다. Shigella 담 즙;에 노출 되는 동안 작은 창 자 샛길, 동시에 대부분 박테리아5를 죽이 동안 지질 소화 촉진을 소장으로 분 비 지질 저하 세제. 장 병원 체 담 즙6의 살 균 효과 저항 하는 독특한 능력을가지고. 비보에우리의 최근 분석 활용-포도 당 및 S. flexneri 에서 강력한 biofilm 형성을 설명 하기 위해 담 즙 염의 조합 뿐만 아니라 이질균, 병원 성 대장균및 의 다른 종 처럼 살 모 넬 라4. 이전, 살 모 넬 라 enterica serovar 이다 만성 감염7,,89, 중 담 낭의 독특한 식민지 인 담 즙 유도 biofilm를 표시 했다 10. 브리11및 Campylobacter12 사전 연구 biofilm 형성 담 즙에 대 한 응답에서을 설명 하는 또한. 따라서, 분석 담 즙 유도 biofilm 형성 관찰 다른 병원 체를 확장 하 고 담 즙을 보존된 장 병원 체 응답의 데모를 설치 하는 데 도움이. 달리 만성 biofilms는 세균 유전자 전사 제한 되며 세포 노화1,2,3발생할 수 있습니다, 우리는 장의 담 즙 유도 biofilm 더 자연에 과도 제안 합니다. 이 과도 악성 biofilm (로 분산 분석 결과에 본) 급속 한 분해에 의해 hallmarked 고 독성 유전자 발현 biofilm 인구4,6에서 관찰. 
Biofilm 형성은 다각적인 동적 프로세스와 담 즙 염의 사용 시작 요소가 최근 가장 장 병원 체에 대 한 설명 되었습니다만, 도구와 기술을 사용 하는 전통적인 방법의 독특하고 창의적인 응용 프로그램. 따라서, 여기에 제시 된 담 즙 소금 유도 biofilm 형성, 세균 부착, EPS 매트릭스의 생산 및 실행 가능한 박테리아의 분산은 biofilm에서를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 특성을 계량 3 무료 전략 있습니다. 이 기술은 주로 이질균;와 연구에 대 한 이용 되었습니다. 그리고 따라서 다른 장 병원 체의 평가 최적화 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 3 개의 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 식별을 지원 하 고 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 위한 재현 가능한 프로토콜 설정.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biofilm 형성 박테리아 가혹한 환경 조건 또는 스트레스의 시간에에서 발생 하는 동적, 다단계 프로세스입니다. 장 병원 체에 대 한 상당한 스트레스 응답 위장 운송 중 고 노출 되 면 담 즙, 인간의 소화의 정상적인 구성 요소 유도 된다. 담 즙의 살 균 효과 극복 하기 위해 많은 장 병원 체는 소장을 통해 환승 하는 때 생존을 허용 하도록 가상 biofilm을 형성 합니다. 여기 우리가 고체 상 준수 분석으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 매트릭스 감지 및 시각화를 통해 biofilm 형성을 정의 하는 방법론을 제시. 또한, biofilm 분산 평가 감염 과정에서 박테리아의 릴리스를 실행 하는 이벤트의 분석을 모방 하기 위해 제공 됩니다. 크리스탈 바이올렛 얼룩 높은 처리량 96 잘 접시 준수 분석 결과에서 부착 박테리아를 검출 하는 데 사용 됩니다. EPS 생산 평가 즉 두 분석 실험에 의해 결정 됩니다 현미경 EPS 매트릭스와 붙일 활용 된 다 당 류 바인딩 lectin과 반 정량 분석의 얼룩. 마지막으로, biofilm 분산 식민지 및 도금을 통해 측정 된다. 여러 분석 실험에서 긍정적인 데이터 biofilms의 특성화를 지원 하 고 다른 세균성 긴장에 담 즙 소금 유도 biofilm 형성을 식별 하기 위해 이용 될 수 있다.

그림 1, biofilm 형성 성장의 대부분 6 장 병원 체 테스트 된 다음 담 즙 염을 포함 하는 미디어에서에서 유도 된다. 담 즙 염 노출은 거의 모든 긴장에서 관찰 후 부착 박테리아에 상당한 증가 테스트 합니다. 예외는 enteroaggregative 대장균 (EAEC); 그러나 , Δ4aaf 돌연변이 유발된 관찰 주의. 결과 표시 추가 부착 메커니?...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K 조회수.  Massachusetts General Hospital. 이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

비디오: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

결장 상피세포의 Shigella 감염을 분석하기 위한 프로토콜

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

저자 스포트라이트: Shigella 감염에 대한 이해 및 퇴치의 발전

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

생물학

아시네토박터 생물막 형성 평가 및 생물막의 특성화

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

저자 스포트라이트: Acinetobacter Biofilm 정량화, 평가 및 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

요약

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구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis Biofilms

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

유학을위한 방법론

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략