우리는 그녀의 기술 도움 Bettine 깁스를 인정 하 고 싶습니다.

이 프로토콜에서 모든 절차를 수행 하는 동안 항상 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 유리를 착용. 용기/튜브 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약만 인증된 후드, 그리고 지정 된 컨테이너에 페 놀 폐기물의 처분에 열려 있는지 확인 합니다. 무 균 튜브 DNAse/RNAse 무료, 팁, 그리고 시 약을 사용 합니다.
1. 세포 배양
<ol><li>헬러 세포 선 및 두 정지 맨 틀 세포 림프 종 셀 라인, Granta-519 및 Jeko-1, 10% 포함 된 DMEM 성장 FBS와 37 ° c.에 5% CO2 습도 인큐베이터에서 100 U/mL 페니실린/스 셀 1시 10분 희석 및 입자 카운터14를 사용 하 여.</li>
	<li>RNA 추출, 셀/잘 6 잘 플레이트 (잘 당 2 mL 미디어)에 50만 플레이트. 24 h에 대 한 보육, 후 세포에서 RNA를 수집 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>세포를 수확 참고: 원심 분리 단계를 제외 하 고 불 임을 유지 하기 위해 조직 문화 후드에 나열 된 모든 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>현 탁 액 셀 (Jeko-1 및 Granta-519):<ol>
<li>15 mL 튜브를 (함께 미디어의 2 개 mL) 셀을 전송 하 고 5 분 Aspirate는 미디어에 대 한 1,725 x g에서 원심 튜브의 아래쪽에 셀 펠 릿을 두고.</li>
			<li>1 인산 염 Buffered 식 염 수 (PBS) x 50 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 각 샘플 1.5 mL microcentrifuge 관에서 monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 500 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 두고 5 분 동안 실내 온도 (RT) microcentrifuge 튜브를 반전 하는 동안 모든 1 분.</li>
		</ol>
</li>
		<li>부착 세포 (HeLa)에 대 한:<ol>
<li>각 우물에서 세포 배양 발음 각 잘 씻어 파편을 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 각 잘 500 µ L monophasic 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약의 추가.</li>
			<li>부드러운 락으로 5 분 동안 RT에서 품 어. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 세포의 용 해<ol>
<li>1 시간 동안-20 ° C에서 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합물을 고정 합니다. 참고: 필요한 때까지 또는-20 ° C 하룻밤에 믹스를 남아 있을 수 있습니다.</li>
		<li>페 놀 및 guanidine isothiocyanate 셀 혼합 얼음에 녹여 PCR 후드에서 microcentrifuge 튜브에 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 혼합물까지 10-15 s에 대 한 샘플은 핑크와 불투명. (4 ° C)에서 15 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
		<li>원심 20,800 x g와 4 ° C에서 15 분에 대 한 샘플 위 무색 수성 단계를 조심 스럽게 제거 (~ 200 µ L) 및 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 강 수<ol>
<li>각 샘플에 소 프로 파 놀의 동일한 볼륨을 추가 합니다. Coprecipitant의 1 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각각 샘플링 하는 RNA에 대 한 캐리어로 고 이후 단계에서 RNA를 시각화 하는 데 도움이. 적어도 4 h-80 ° C에서 샘플을 품 어. 최상의 결과 얻으려면 밤새-80 ° c.에 품 어</li>
		<li>냉각된 원심 분리기 샘플 전송. 35 분 20,800 x g에서 원심 분리기 / 4 ° C; RNA는 튜브의 하단에 푸른 반점으로 나타납니다. 조심 스럽게 샘플에서는 소 프로 파 놀을 제거. 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 간단히 3 vortexing에 의해 펠 릿 resuspend s.</li>
		<li>원심 분리기 샘플 RT에서 20,800 x g에서 5 분에 대 한 샘플에서 모든 에탄올을 제거 합니다. 하자 샘플 약 10 분 Resuspend 샘플 RNAse 무료 물 35 µ L에 대 한 건조. RNA가 완전히 솔루션을 보장 하기 위해 5 분 동안 열 블록 (65 ° C)에 배치 하 고 즉시 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>앞에서 설명한, 1 µ L15대신 RNA 샘플의 1.5 µ L를 사용 하 여 제외 하 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 전체 RNA의 농도 결정 합니다. 필요에 따라 RNA 무결성을 확인 하는 1 %agarose 젤에 총 RNA의 1 µ g를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase 치료
<ol><li>RNA의 정량화, 후 어떤 genomic DNA 저하 총 RNA에 DNAse 치료를 수행 합니다. 각 샘플에 대 한 별도 microcentrifuge 튜브에서 믹스 20 µ L 총 반응 수 있도록 RNAse 무료 DNAse 키트에서 다음과 같은 시 약을 추가:<ol>
<li>믹스 2 µ L DNase 10의 반응 버퍼 X 총 RNA의 4.4 µ g. 물으로 14 µ L의 총을가지고.</li>
		<li>2 µ L의 RNase 무료 DNAse 추가 합니다. (반전 전사 Kit)에서 RNase 억제제의 2 µ L의 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>열 블록 DNAse 효소 비활성화를 70 ° C에서 10 분 동안에 중지 솔루션 및 열 2 µ L를 추가 합니다. 참고: DNAse 치료 선택 사항입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. cDNA 합성
50 µ L의 최종 반응 볼륨:
<ol><li>50 µ L의 최종 반응 볼륨: 전송 22 µ L는 DNase의 새로운 튜브, 또는 전송 4 µ g 새 튜브를 22 µ L의 총 볼륨에 추가 된 물 총 RNA의 RNA 취급. 10 µ M 뇌관 솔루션에서 T7 올리고 dT25 뇌관의 2 µ L를 추가 합니다. T7 올리고 dT25 뇌관을 위한 순서는 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>반전 녹음 방송에서 키트 RNase 억제제 (20 U / µ L)의 2 µ L, 5 배 반응 버퍼의 8 µ L, 10 mM dNTPs의 4 µ L 및 역전사 (200 U / µ L)의 2 µ L를 추가 합니다. 주: 부정적인 컨트롤 역할 없이 역전사 반응을 설정.</li>
	<li>1 헤 얼음에 직접 전송에 대 한 42 ° C에서 품 어. 5 분 동안 75 ° C에 튜브가 열 하 고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
</ol>5. 뇌관 융합 유전자 사본에 대 한 검색
<ol><li>
뇌관 디자인
	<ol>
<li>앙상블 게놈 브라우저 (ENST00000360839.6/NM_017747)에서 cDNA 순서를 다운로드 하 고 대상 (ANKHD1) 상류의 사본 정지 codon의 ORF 내의 영역을 식별. 복사 및 붙여넣기 뇌관 디자인 소프트웨어의 시퀀스 항목 영역으로 정지 codon의 상류 시퀀스를 포함 하는 전체 지역 (최대 700 뉴클레오티드) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>표시 사용자 지정 디자인 옵션을 선택 하 고 선택 뇌관의 수에 대 한 10 시스템 (반환 결과)를 생성 한다 고 모든 다른 매개 변수를 기본값으로 설정.</li>
		<li>5 앞으로 프라이 머와 오버랩 되지 않는 2 개의 반전 뇌관을 선택 합니다. 뇌관을 주문 하 고 10 µ M의 최종 농도에 RNAse/DNAse 무료 물으로 다시 구성 하기. PCR 위한 뇌관 일반적인 디자인에 대 한 자세한 내용은 다른 덮여 있다16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
후속 3' 경주에 사용에 대 한 잠재적인 뇌관을 식별 하는 PCR 참고: 반응에 사용 하 여 마지막 앞으로 뇌관을 확인 하려면 일반 PCR PCR 후드에 대 한 정방향 및 역방향 뇌관의 다른 조합을 설정 하 여 설계 된 뇌관을 테스트 합니다.<ol>
<li>신선한 0.5 mL PCR 튜브에 cDNA (2 µ L)를 전송 합니다. 앞으로 뇌관의 1 µ L (10 mM 뇌관 솔루션)에서 역방향 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. Nuclease 무료 물 8.5 µ L을 추가 하 여 최대 12.5 µ L를 확인 합니다. 젤에 PCR 주인 혼합 x 2의 12.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>다음 PCR 열 사이클링 조건을 사용: 95 ° C 30에 대 한 29 주기 뒤에 2 분 동안 95 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 7 분 동안 68 ° C에서 최종 주기를 설정 1 분에 72 ° C.</li>
		<li>PCR, 후 ethidium 평범한 사람으로 물 1 %agarose 젤에는 제품을 실행 합니다. 전기 이동 법의 세부 사항은 이전 몇 가지 수정17설명 합니다.<ol>
<li>Agarose 250 mL 플라스 크에 트리 아세테이트 (태) 버퍼의 100 ml에서의 1 g을 분해. 전자 레인지에 끓인 다.</li>
			<li>1 분 동안 냉각 하 고 증기 두건에서 7.5 µ L ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL 주식)의 추가를 떠나. 플라스 크를 소용돌이로 잘 혼합 하 고 수평 젤 기구에 부 어. 응고를 젤 수 있도록 30 분 이상 증기 두건에서 RT에 둡니다.</li>
			<li>1 x TAE 버퍼와 젤을 커버 하 고 DNA 분자량 사다리의 3-5 µ L 함께 agarose 젤에 PCR 제품의 10 µ L를 로드 합니다. 10 분 시각화는 영상 장치를 사용 하 여 제품에 대 한 175 V에서 실행 하 고 추가 제품의 분리가 필요한 경우, 추가 5-10 분에 대 한 젤을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3' 레이스에 대 한 중첩 된 뇌관의 선택
	<ol>
<li>PCR agarose 젤 별개, 강한, 단일 PCR 밴드 프라이 머 선택의 결과 분석 합니다. 5'-대부분 뇌관을 사용 하 여 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') 실행 하는 첫 번째 PCR에 T7 oligodT25 입문서와 함께.</li>
		<li>첫 번째 뇌관의 하류에 있는 중첩 된 뇌관을 선택 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), T7 뇌관으로 그것을 사용 하 여 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR 반응의 두 번째 세트에서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 최적화 3' 3' UTR 두 개의 서로 다른 효소를 사용 하 여 지도를 경주
참고: 계속 있다 DNA polymerases PCR;에 대 한 사용의 다양성 증가 따라서, 우리는 3' 경주 PCR 반응에 대 한 다른 효소를 사용 하는 경우에 적용 될 수 있는 표준 조건을 확인 싶 었 어 요. 어떤 사본에 대 한 역방향 뇌관; 일정 하 게 유지 됩니다. 유일한 변화는 중첩된 앞으로 뇌관 대상 성적에 대 한 관련 된에 있습니다.
<ol><li>
1: 3 프로토콜 ' Pyrococcus furiosus (Pfu) 에서 수정 된 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 경주
	<ol>
<li>첫 번째 PCR<ol>
<li>PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송 하 고 10 x Pfu 반응 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다. (10 m m 솔루션)에서 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L, T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 40 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 1에 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 PCR<ol>
<li>첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송 하 고 5 µ L 10 x Pfu울트라 II 반응 버퍼의 혼합. 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L, T7 뇌관의 1 µ L 및 dNTPs (10 m m 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 39 µ L을 추가 하 여 최대 49 µ L 총 반응 볼륨을 확인 합니다. Pfu DNA 중 합 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 1)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2: 3 프로토콜 '는 공상 DNA 중 합 효소 Pyrococcus를 융합 하는 DNA 바인딩 도메인의 구성을 사용 하 여 경주-중 합 효소는 PCR 마스터 믹스 교정 처럼
	<ol>
<li>첫 번째 PCR<ol>
<li>PCR 튜브에 cDNA의 1 µ L를 전송. 첫 번째 중첩된 앞으로 뇌관의 1 µ L T7 oligodT25 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다. 물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다.</li>
			<li>PCR 마스터 믹스 x 2의 25 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 표 2에 설명 된 PCR 순환 상태를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>두 번째 PCR<ol>
<li>첫 번째 PCR에서 새로운 PCR 튜브 제품의 2 µ L를 전송. T7 역방향 뇌관의 1 µ L 함께 두 번째 중첩 된 PCR 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>물 22 µ L을 추가 하 여 최대 25 µ L를 확인 합니다. PCR 주인 혼합 X 2의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 PCR 설치 (표 2)로 같은 PCR 프로 파일을 사용 하 여 PCR을 실행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 3' 경주의 두 번째 PCR 제품을 확인 하십시오.
<ol><li>받아 5-10 µ L의는 두 번째 PCR 제품 (PCRs 사본을 풍부 하 게 표현 하는 경우의 첫 번째 라운드에서 제품) 고는 agarose 젤에 실행 합니다. 젤 고 앞에서 설명한 전기 (5.2.3.1 5.2.3.3 단계)를 실행 합니다. 영상에 결과 시각화 한다.</li>
</ol>8. 제품 정화 및 시퀀싱
<ol><li>젤 PCR 파편 DNA 청소 시스템을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 두 번째 PCR에서 젤 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>수행 생어 시퀀싱 (또는 젤 정화 PCR 제품 샘플 및 시퀀싱 실험실에 적절 한 시퀀싱 뇌관 보낼). 후 생어 시퀀싱 데이터 분석 순서.</li>
	<li>시퀀스 분석 소프트웨어 다운로드 ( 재료의 표참조) 소프트웨어에 추적 파일을 가져옵니다. 개별 순수 베이스 QVs (품질 값) 기지를 사용 하 여 전화 정보18. 보기에 대 한 높은 품질 추적으로 크로마 다운로드. 선택 사항: 젤 정화 제품 수 복제 될 적절 한 복제 키트와 격리 된 클론 생어에 대 한 전송 사용 하 여 연속.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+mRNA+processing:+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease.">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals.">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+3&#8242;+cDNA+ends+(3&#8242;-RACE).">Rapid amplification of 3&#8242; cDNA ends (3&#8242;-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function.">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li><li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Biology+in+Medicine:+The+polymerase+chain+reaction:+the+revolution+within.">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li><li>Bertioli, D., White, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends.">Rapid amplification of cDNA ends.</a> PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).</li><li>Freeman, L. A., Freeman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5'+and+3'+RACE.">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).</li><li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1/MRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma.">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li><li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma.">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li><li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+conjoined+genes:+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes.">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).</li><li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer.">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters.">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data.">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li><li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+better+probes:+Effect+of+probe+size,+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays.">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li><li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays.">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li><li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hairpin+structure+on+PCR+amplification+efficiency.">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li><li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-template+polymerase+chain+reaction.">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

대규모 병렬 시퀀싱 기술, 유전자에 의해 유전자 기준의 출현에도 불구 하 고 3' 경주 여전히 남아 있다 파 및 많은 꼬리에 인접 한 뉴클레오티드를 식별 하기 위해 쉽고 가장 경제적인 방법. 여기에 설명 된 적응을 증폭 ORF, 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR ANKHD1 mRNA 사본 중의 일부를 포함 하는 시퀀스를 지도 3' 레이스 사용 하 여 확장 합니다. 3' 경주의 주요 이점은 그 몇 가지 사소한 조정으로...

3' 끝의 형성은 사전-mRNA의 하류 ~ 250 untemplated adenines 많은 꼬리1,2를 구성 하는 추가 다음 파의 분열을 구성 하는 mRNA 성숙에 중요 한 단계입니다. 많은 의무적인 단백질 (PABP) 많은 꼬리를 한다이 저하에서 mRNA 사본 보호 하 고 번역1을 용이 하 게 한다.
현재 견적 인간 유전자의 70% 여러 패스, 따라서 여러 3' 끝3인 양자 택일 polyadenylation 받아야 좋습니다. 따라서, 많은 꼬리의 3' UTR, 나머지 연결 식별 어떤 주어진된 대 본에서 사용 하는 파를 식별 하는 것이 중요 하다. 차세대 시퀀싱의 출현 Utr 및 유전자의 수천의 패스의 3' 동시 식별에 결과 있다. 시퀀싱 기능에 있는이 증가 bioinformatic 3' 끝의 양자 택일 polyadenylation 관련 데이터를 분석 하는 알고리즘의 개발을 요구 했다. 드 노 보 탐지 또는 유효성 검사는 파의 및 그러므로 대규모 시퀀싱 데이터에서 개별 유전자의 3' 끝의 매핑, 3' 경주 남아 선택4,5의 방법. 3' 경주의 cDNA 제품에 일반적으로 포함 하는 시퀀스의 3' UTR 많은 꼬리, 분열 사이트, 우선권, 및 상류는 파의 순서에 있는 부분에만 포함 됩니다. 디자인 및 유전자 특정 앞으로 역 뇌관의 사용 필요, PCR와 달리 3' 레이스만 요구 한다 2 개의 유전자 특정 중첩된 앞으로 뇌관을. 따라서, PCR 증폭된4,6되 고 유전자의 큰 영역의 뉴클레오티드 순서의 더 상세한 지식이 필요 합니다. 3' 레이스 사용 같은 뇌관 그 목표는 많은 모든 polyadenylated RNA 사본에 대 한 꼬리, 앞으로 뇌관 될 필요가 유전자 특정, 따라서,만 요구 하는 mRNA의 크게 작은 영역의 지식 역. 그 시퀀스는 완전히 특징이4,7영역의 확대 수 있습니다. 이 수 있다 3' 경주 뿐만 아니라, 유전자의 3' 끝을 결정 하지만 또한 결정 하 고 큰 지역 상류의 3' UTR 상당 부분을 형성 하는 파의 특성 사용. 5'는 수정 3' 3' UTR의 큰 부분 및 측면에 서 지구를 포함 하는 레이스와 레이스를 결합 함으로써 완전히 순서 또는 그것의 3' 끝85' 끝에서 한 전체 mRNA 사본 복제 가능 하다.
이 응용 프로그램의 수정 3' 레이스의 예는 소설 CCND1 MRCK 융합 유전자 사본 맨 틀 세포 림프 종 세포 선 암 환자에서의 최근 id입니다. 3' UTR CCND1 및 MRCK 유전자에서 시퀀스의 구성 그리고 미르 규정9완강히 저항 했다. 두 개의 중첩 된 CCND1 특정 앞으로 뇌관 즉시 인접 하 고 CCND1 정지 codon의 하류 지역에 보완 했다. 금융 자원 또는 수 있도록 bioinformatic 전문 많은 연구소 있습니다 부족 특정 bioinformatic 도구 함께 전체 transcriptome 시퀀싱 3' UTR10유전자 융해를 감지 사용할 수 있습니다, 있지만이 기술의 사용. 따라서, 3' 레이스 드 노 보 식별 및 소설 퓨전 유전자 포함 3' UTR의 유효성 검사에 대 한 대안 이다. 고려는 과감 한 보고 융합 유전자의 수에 있는 증가 뿐 아니라 성적 증명서를 통해 읽기, 3' 경주 되고있다 유전자 시퀀스11,12특성화에 강력한 도구. 또한, 최근 연구의 3' UTR 길이 뿐 아니라 3' UTR에서 서로 다른 시퀀스를 영향을 미칠 수 mRNA 사본 안정성, 현지화, translatability, 및 기능13나타났습니다. 때문에 부분 관심 증가 transcriptome 매핑, 실험실에서 사용 하기 위해 개발 되 고 다른 DNA polymerases의 증가 되었습니다. 그것은 어떤 유형의 수정 할 수 있다 3 ' 경주 프로토콜에서 DNA polymerases 사용할 수 있는 레 퍼 토리를 활용 하기 위해서는 결정 해야 합니다.
이 작품 보고 적응 3' 경주에 매핑하는 전체 3' UTR, 우선권, 및 3' 끝 분열의 사이트를 사용 하 여 ANKHD1 사본 중첩 사본 및 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 ANKHD1 섹션에서 뇌관.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

진 핵 mRNAs의 성숙 3' 끝 형성을, 많은 꼬리의 추가 포함 하는 포함 한다. 유전자의 3' 끝, 지도 하기 위하여 선택의 전통적인 방법은 cDNA 끝 (3' 경주)의 3' 급속 한 확대 이다. 3' 레이스에 대 한 프로토콜 설계 및 관심의 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역 (3' UTR) 내에서 중첩 된 뇌관의 선택을 요구 한다. 그러나, 몇 가지 수정 프로토콜 포함 전체 3' UTR 및 ORF와 3' UTR 사이의 관계의 더 포괄적인 그림을 제공 하는 열려있는 독서 프레임 (ORF), 내에서 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 이것은 기존의 3' 경쟁에서 제공 하는 분열 polyadenylation 사이트 뿐만 아니라 polyadenylation 신호 (PA)의 외 이다. 특이 한 3' Utr, 3' UTR, 내 유전자 융해를 포함 하 여 검색할 수 있습니다 확장 된 3' 경주 그리고 시퀀스 정보 잠재적인 미르 바인딩 사이트 뿐만 아니라, 누구나 풍부한 사본의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요소를 불안정을 예측에 사용할 수 있습니다.

중첩 된 앞으로 뇌관 검색:
Agarose 젤에서 그림 1 에서는 두 가지 PCR 젤 제품 (1, 2 차선)는 사용 같은 전달 하지만 다른 역방향 뇌관 뇌관. 레인 3 뚜렷한 PCR 제품 고 뚜렷한 정방향 및 역방향 뇌관을 있다. 기반으로 하는 PCR 반응에 사용할 이상적인 뇌관은 하나의 뚜렷한 PCR 제품 (3 차선) 하는 그. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

12.2K 조회수.  Butler University. CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

비디오: Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

연구

암 연구학

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

단일 셀 Transcriptome 분석

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

신경과학

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

생물학

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

의학

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' 끝 시퀀싱 A seq2 라이브러리 준비

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

cDNA 말단의 신속 증폭

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
...