이 작품은 NSF 경력 수상 1553023 및 NIH/NIAID 상 R01AI103369에 의해 지원 되었다.

1입니다. 녹 농 균 식민지 Biofilms의 성장
<ol><li>매체-Bilayer 접시의 준비<ol>
<li>10 g/L tryptone, 한 천 10 g/L를 준비 이온 물에서 ( 재료의 표참조) 솔루션.</li>
		<li>20 분 50-60 ° C에 시원한 물 욕조에 대 한 오토 클레이 브.</li>
		<li>100 mm x 100 mm 정사각형 접시에 agar tryptone 솔루션의 45 mL를 붓고 ( 재료의 표참조) 50 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여. 공고히 한 천 수 (20 ~ 30 분). 두 번째, 15 mL 레이어의 첫 번째 레이어 위에 붓는 다. 밤새 공고히 하자, 보풀 티슈로 닦아 하 여 필요한 경우 뚜껑에서 결로 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식민지 Biofilms 안보<ol>
<li>관심 종자 파운드 한 천 격판덮개13 에 냉장고 주식에서 행진 하 고 37 ° C와 80-100% 상대 습도에서 12-16 h에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>각 스트레인 또는 복제에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 2 개 mL를 접종 하 여 37 ° C에서 12-16 h 250 rpm 동요에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>서브 1: 100 파운드 신선 하 고 37 ° C에서 2.5-3 h 250 rpm에서 진동에 대 한 어둠 속에서 잠복기에 diluting 하 여 문화.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 하 고 살 균 파운드는 OD와 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 조정500 nm ~ 0.5의.</li>
		<li>원하는 서식 지에 따라 다릅니다 피펫으로 2.5-10 µ L (단계 1.1에서에서 준비) 매체 bilayer 플레이트에 셀 서 스 펜 션의 크기 하 고 자리 ~ 20 분 페 트리 뚜껑 열린 불꽃 근처 열려 떠나 건조 용이 하 게 수에 대 한 건조를 허용.</li>
		<li>최대 4 일 동안 어둠 속에서 25 ° C 및 80-100% 상대 습도에서 자리 식민지를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 통 솔루션의 준비
<ol><li>샘플 수확의 날에 통 솔루션을 준비 합니다. 1 x 4%의 최종 농도에 PBS에 37% 포름알데히드 (FA)를 희석 FA. 주의: FA은 휘발성과 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용 하 고 통풍이 잘되는 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>즉시 사용 하기 전에 분해 4% 염 산 L-리 신 FA 50mm L 리 진 HCl의 최종 농도를 실 온에서 (단계 2.1에서에서 준비).</li>
</ol>3. [옵션] 식민지 Biofilm에 정착 액의 응용 프로그램을 직접
참고: 우리는 biofilm 형태학 agar 오버레이 고정 하기 전에 추가 될 때 가장 잘 유지 되는 발견 했다. 그러나,이 단계는 또한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건에 변화를 구성 합니다. 따라서 여기에 설명 된 대로 있는 고정 단계는 실시 한 오버레이 추가 하기 전에 별도 프로토콜을 사용 하 여 형광 기자 식 패턴에 확인 한다.
<ol><li>고정, 그리고 환기가 증기 두건에서 한 일에 식민지의 가장자리, 그것은 그것을 잠수 없이 식민지의 주변에 도달 수 있도록 주위 agar 표면에 직접 2 단계에서 준비 하는 정착 제 플라스틱. 약 500 µ L. 허용 식민지 및 주변 agar에 확산 정착 액으로 많은 정착 액 만큼은 완전히 식민지를 둘러싸고에 적용 됩니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 식민지 및 주변 미디어, 약 20-30 분에 완전히 흡수 되었으며 잔여 FA는 더 이상 접시에 표시, 단계 3.1을 반복 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액을 허용 합니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 완전히 식민지로 흡수 되었으며 주변 미디어 반복 단계 3.1, 식민지의 표면에 직접 고정 제를 적용 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액, 진행 단계 4에만 모든 후 통 흡수 되었으며 더 이상 접시에 볼 수 없습니다.</li>
</ol>4. 오버레이 Agar와 식민지
<ol><li>고정 일에는 10 g/L 이온된 물과 분해에 10-20 분 압력솥에 한 솔루션 준비. 50 ˚C에 물 욕조에 멋진.</li>
	<li>부드럽게 붓는 다 15 mL agar 솔루션의 성장 매체 및 식민지. 5 분 (그림 1B)에 대 한 실 온에서 젤을 형성 하기 위하여 한을 수 있습니다.</li>
	<li>날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 최고 2 개의 층 사이 적 층 하는 식민지와 정사각형, 3 층 척을. 여러 샘플을 준비, 각 척 비슷한 크기로 잘라는 확인 합니다.</li>
	<li>부드럽게 식민지 포함 된 척에서 과도 한을 제거 합니다.</li>
	<li>척 (그림 1C)의 아래쪽 계층에서 agar (식민지 포함)의 2 개의 상위 계층을 해제, PBS 또는 물 1 주걱의 플랫 머리 젖은 하 고 부드럽게 위쪽 및 아래쪽 레이어 사이 삽입 합니다. 적 층된 식민지 아래 계층에서 분리 해야 합니다. 조심 하지 왜곡 하거나 그것의 기초에서 그것을 해제 하는 때 적 층된 식민지를 벤드 합니다.</li>
</ol>5입니다. 고정
<ol><li>적 층된 식민지 (즉, 2 층 척) 포함 카세트로 전송 즉시 환기가 연기 후드, 작업 ( 재료의 표참조), 화학 방지 마킹 펜으로 표시. 유리 슬라이드 우편물 포함 카세트를 넣습니다 (재료의 표 참조) 포함 하는 준비 단계 2.1-2.2에서에서 정착 액. 없음 기포 포함 카세트 안에 갇혀 있다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 어둠 속에서에서 정착 액에 샘플을 품 어.</li>
</ol>6. 샘플 처리: 버퍼 세척, 탈수, 개간, 및 침투
<ol><li>야간 고정 후 샘플 1 h 1 x PBS에 두 번 세척. 최상의 결과 얻으려면 시 균질 스핀을 사용 하 여 자동화 기능 자동 조직 프로세서의 낮은 설정으로 설정 (자료의 표 참조). 없는 프로세서를 사용할 수 있는 경우 처리는 수동으로 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h 각 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%)에서 에탄올 (EtOH) 희석의 등급된 시리즈를 통해 탈수로 버퍼 세척을 따릅니다.</li>
	<li>100%의 3 개의 세척 탈수 EtOH 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>100% 오렌지 오일 기반 개간 에이전트의 세 가지 세척 탈수 샘플 취소 (재료의 표 참조) 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>침투 지운된 샘플 두 번와 녹은 파라핀 왁 스 ( 재료의 표참조), 55˚C, 2 h에 대 한가 열.</li>
</ol>7. 샘플 포함
<ol><li>55 ˚C를가 열 하는 녹은 파라핀 왁 스 왁 스 몰드를 채우십시오. 온수, 편평한 주걱을 사용 하 여 신속 하 게 포함 카세트의 침투 척 물림 쇠 병렬 형의 기지에 달려 있도록 왁 스 금형에 전송. 물림 쇠에 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 왁 스 금형 사용자 지정 3 차원 인쇄 될 수 있습니다 또는 상용 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>4 ˚C에서 하룻밤을 강화 하기 위해 왁 스를 수 있습니다. 고체 왁 스 몰드 샘플 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>왁 스가 고형화 되 면 금형에서 샘플을 삭제할 고 면도날으로 샘플 주위에서 과잉 왁 스 손질. 두고 과잉 왁 스 샘플, 단면, 평면에 평행한의 한쪽 끝에서 연장는 톰으로 클램프 하는 데 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 또한 샘플 주위 왁 스, 약 1 m m 두께의 칼 집 두고 그 얼굴을 부드럽게.</li>
</ol>8. 단면
<ol><li>42 ˚C에 물 목욕을 열. 잎의 가장자리에 수직으로 동쪽으로 향하게 하는 식민지의 표면으로 톰으로 샘플을 클램프 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>식민지의 원하는 평면 섹션을 수집 된 것입니다 도달 했습니다 때까지 샘플 50 µ m 간격으로 잘라.</li>
	<li>10 µ m 두께 섹션 75-80 rpm의 단면 속도 6-10˚의 허가 각도를 설정 하는 톰을 사용 하 여 원하는 수의 리본을 잘라. 뾰족한 붓을 사용 하 여 잎에서 리본을 분리.</li>
	<li>부드럽게 전송 파스퇴르 피 펫 (선호) 또는 집게의 끝에 물 한 방울을 사용 하 여, 물 목욕 리본. 섹션에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>즉시 물 욕조에 슬라이드를 삽입 하 고 45˚에서 리본 메뉴 아래에 위치.</li>
	<li>슬라이드 반투명된 레이블 바로 아래에 리본의 좁은 가장자리를 터치 합니다. 리본을 준수 해야 합니다.</li>
	<li>물 목욕, 물, 표면에 수직이 되도록 각도 조정 하 고 그것의 길이 따라 슬라이드에 대 한 평면을 리본 허용에서 슬라이드를 당겨. 리본 메뉴 아래 초과 물을 트래핑 하지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게 서는 흡수 성 보풀 조직, 섹션에서 초과 물을 wicking에 슬라이드.</li>
	<li>종이 타월에 슬라이드를 어둠 속에서 하룻밤 실 온에서 건조 그것을 허용. 슬라이드는 어둠 속에서 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 열 고정, 재, 및 장착
<ol><li>45 ˚C를 수준별된 핫 플레이트를 열. 30-60 분에 대 한 슬라이드를 열. 왁 스 것 이다 될 세미-녹은 평평 하 게 슬라이드에 대 한.</li>
	<li>부드럽게 핫 플레이트에서 슬라이드를 올리고 누워 부드러운, 수준별, 실내 온도 표면에 평면 녹은 왁 스 왁 스 굳은 (~ 1 분) 때까지 슬라이드의 어느 사이드를 당겨 하지 않습니다 보장 하기 위해 관리 사용 하 여.</li>
	<li>세척 사이 솔루션을 제거 하는 Büchner 흡 인기를 사용 하 여 각, 5 분에 대 한 에이전트를 비운의 4 개의 세척 슬라이드 왁 스 드 유리 슬라이드 메일러를 사용 하 여.</li>
	<li>100%에 슬라이드 세 번 씻어 EtOH 1 분.</li>
	<li>각 1 x PBS에이 분 세척 뒤 1 분 (95%, 70%, 50% 및 25%)를 처리 하는 역 순서에서 에탄올의 등급 시리즈에서 슬라이드 리하이드레이션</li>
	<li>즉시 Tris 버퍼 장착 매체에 섹션을 탑재 ( 재료의 표참조) 기포의 도입을 방지 하는 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에서 유해를 장착 중간을 수 있습니다.</li>
	<li>일단 생산, 투명 매니큐어를 사용 하 여 슬라이드에 coverslip 인감. 봉인 된 슬라이드 4 ˚C에서 어둠 속에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

파라핀 포함 및 얇은 단면 조직 샘플은 고전적인 조직학 기술 마이크로 형태 구조의 이미징 수 있도록 진 핵 조직에 일반적으로 사용 되 고 약간의 성공을 함께 미생물 샘플8에 적용 된 ,9. Cryoembedding 생 및 immunofluorescent 신호의 강한 보존에 대 한 수, 파라핀 포함 바람직합니다 일반적으로 형태학16의 더 나은 보존을 제공 합니다. 이 방?...

대부분 미생물 형태 biofilms 용량을가지고, 셀의 지역 사회 자체 제작된 행렬에 의해 함께 개최. Biofilms는 영양소와 기판의 다양 한 정권으로 물리적 설정의 많은 종류에 성장 될 수 있다. Biofilm 형성에 대 한 구체적인 분석 재현성 다세포 구조, 항복 하는 경향이 그리고 일반적인 아키텍처 phylogenetically 다양 한 종 지역 사회 또는 거시적인 수준에서 관찰 된다. 미생물 고체 매체는 대기권의 밑에 식민지로 재배 되 고, 거시적인 형태학 매트릭스 생산 용량에 대 한 정보를 전달 하 고 종종 다른 특성 1,2,3와 상관 관계가. 미생물 식민지의 내부 아키텍처 biofilm 특정 화학 및 생리학에 대 한 단서를 제공할 수도 있습니다 하지만 특성화 하는 어려운 되었습니다. 세균성 식민지를 cryoembedding 및 cryosectioning 기술의 최근 응용 프로그램 이미징 및 시각화 전례 없는 해상도 4,,56에서 특정 기능을 활성화 했습니다. 그러나, 동물 조직으로 연구는 파라핀 포함 형태 cryoembedding 7 에 비해 뛰어난 보존 하며 조직을 8,9에서 박테리아를 시각화 하는 데 사용 되었습니다 나타났습니다. 우리는 따라서 기정, 파라핀 포함, 그리고 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면에 대 한 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 녹 농 균 PA14 식민지 biofilm 얇은 섹션 10,11, 준비 설명 합니다 하지만 우리 박테리아에 의해 형성 된 biofilms에 또한 성공적으로이 기술을 적용 된 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae12.
파라핀 포함 및 얇은 단면 biofilms의 과정에는 간단한 논리를 다음과 같습니다. 먼저,는 biofilms는 처리 하는 동안 형태를 보존 하는 agar의 레이어 쌌 다. 둘째, 쌌 다 biofilms crosslink 고분자에는 정착 액에 잠긴, micromorphology를 유지. 이 알코올 탈수 한 다음, 더 비 극 지 용 매로 지워지고 액체 파라핀 왁 스와 함께 침투. 침투, 일단 샘플 단면에 대 한 왁 스 블록에 포함 됩니다. 섹션은, 슬라이드에 잘라내어 다음 그들을 원래의 상태로 돌아가도록 rehydrated. 이 시점에서 그들은 수 수 스테인드 또는 현미경 분석에 대 한 설치 매체에서.
이 프로토콜 조직학 분석을 위한 적합 한 미생물 biofilms의 얇은 섹션을 생성합니다. 이 메서드를 사용 하 여 준비 하는 얇은 단면도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 군데 식민지 biofilm 콘텐츠의 표시 됩니다. Biofilms 또한 개별 기능에 대 한 특정 미디어 포함 형광 얼룩에 성장 하거나 재 단계 장착 (9.5-9.6 단계) 직전에서 스테인드 수 있습니다. 마지막으로, 미생물이 지역이 사회 내에서 셀 배포 또는 유전자 표현의 보고 제자리에 있도록 제정 또는 레 귤 레이트 된 패션에 형광 단백질을 생산 하기 위해 설계 될 수 있다. 식민지 biofilm 깊이, 셀 유통, 매트릭스 유통, 성장 패턴 및 spatiotemporal 유전자 발현을 확인 하기 위해 이러한 방법을 사용 했습니다.

<table><tbody><tr><td>5 3/4&quot; Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chemically-resistant Marking Pen</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Manufacturer: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Manufacturer: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Manufacturer: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D printed in-house</td></tr><tr><td>Embedding Mold (commercial)&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&amp;nbsp;</td><td>2701</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped Brush</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought, paint brush</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slide mailer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Manufacturer: National Diagnostics&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Microtome Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Manufacturer: Sturkey&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipette Tips&amp;nbsp;</td><td>See comments section</td><td>See comments section</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffin wax)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Manufacturer: McCormick Scientific&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes Square 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&amp;nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals&amp;nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Razor Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide Warmer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histology Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Flotation Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatic Tissue Processor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Tissue Processor</td></tr><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

파라핀 포함 통해 단면 진 핵 시스템에는 광범위 하 게 설립된 기술입니다. 여기 제공 하는 고정 하는 방법 포함, 끼얹는다 파라핀 왁 스를 사용 하 여 그대로 미생물 식민지 biofilms의 단면. 식민지 biofilms에 사용 하기 위해이 메서드를 적용 하 우리 각 샘플의 성장 기판에 유지 하 고 agar overlayer와 코팅 기술을 개발 하 고 리 통 솔루션에 추가. 이러한 최적화는 샘플 보존 및 micromorphological 기능의 보존을 향상 시킵니다. 이 방식으로 준비 샘플 얇은 단면 및 빛, 형광, 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 이미징 의무가 있다. 우리는 녹 농 균, 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae식민지 biofilms에이 기술을 적용 했습니다. 세부 사항이이 메서드에 의해 생성 된 샘플에서 볼 수의 높은 수준의 결합 기자 스트레인 엔지니어링 또는 특정 염료를 사용 하 여 생리 및 미생물 지역 사회 개발에 대 한 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 메서드는 biofilm 얇은-섹션 점에서 뚜렷한 형태 기능 및 유전자 발현의 영역 DIC, 형광 현미경 검사 법, 그리고 가장 군데 될 수를 생성 합니다. DIC 이미징 기름 침수 목표 X 40을 사용 하 여 몇몇 형태학 상 특징 (그림 2E)를 표시 하기에 충분 한 수 있습니다, 우리는 발견 그 형광 현미경 constitutively 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 향상을 ?...

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Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K 조회수.  Columbia University. 우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

비디오: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

연구

공학

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

면역학 및 감염병학

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

효모 콜로니 임베딩 방법

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

생물학

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

생체공학

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

광학 현미경 검사를위한 조직 학적 샘플 준비

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

일반 실험실 기술

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 보존: 조직 형태학 연구 방법

Source: Nagaraj A.S., et al., Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018)
The ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Lung Cancer

Ex vivo study

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

Fixation and Sectioning

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation is the wet mount, in which the specimen is placed in a drop of liquid on the slide. A liquid specimen can be directly deposited on the slide using a dropper. Solid specimens, such as skin scraping, can be placed on the slide before adding a drop of liquid to prepare the wet mount. Sometimes the liquid is simply water, but stains are often added to enhance contrast. Once the liquid has been added to the slide, a coverslip is placed on top, and the specimen is ready for examination under the microscope.
The second method of preparing specimens for light microscopy is fixation. The &#8220;fixing&#8221; of a sample refers to the process of attaching cells to a slide. Fixation is often achieved by heating (heat fixing) or chemically treating the specimen. In addition to attaching the specimen to the slide, fixation also kills microorganisms in the specimen, stopping their movement and metabolism while preserving the integrity of their cellular components for observation.
To heat-fix a sample, a thin layer of the specimen is spread on the slide (called a smear), and the slide is then briefly heated over a heat source. Chemical fixatives are often preferable to heat for tissue specimens. Chemical agents such as acetic acid, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), and glutaraldehyde can denature proteins, stop biochemical reactions, and stabilize cell structures in tissue samples.
In addition to fixation, staining is almost always applied to color certain features of a specimen before examining it under a light microscope. Stains, or dyes, contain salts made up of a positive ion and a negative ion. Depending on the type of dye, the positive or the negative ion may be the chromophore (the colored ion); and the other uncolored ion is called the counterion. If the chromophore is the positively charged ion, the stain is classified as a basic dye; if the negative ion is the chromophore, the stain is considered an acidic dye.
Dyes are selected for staining based on the chemical properties of the dye and the specimen being observed, which determine how the dye will interact with the specimen. In most cases, it is preferable to use a positive stain, a dye that will be absorbed by the cells or organisms being observed, adding color to objects of interest to make them stand out against the background. However, there are scenarios where it is advantageous to use a negative stain absorbed by the background but not by the cells or organisms in the specimen. Negative staining produces an outline or silhouette of the organisms against a colorful background.
Because cells typically have negatively charged cell walls, the positive chromophores in basic dyes tend to stick to the cell walls, making them positive stains. Thus, basic dyes such as basic fuchsin, crystal violet, malachite green, methylene blue, and safranin typically serve as positive stains. On the other hand, the negatively charged chromophores in acidic dyes are repelled by negatively charged cell walls, making them negative stains. Commonly used acidic dyes include acid fuchsin, eosin, and rose bengal.
Some staining techniques involve the application of only one dye to the sample; others require more than one dye. In simple staining, a single dye is used to emphasize particular structures in the specimen. A simple stain will generally make all of the organisms in a sample appear the same color, even if the sample contains more than one type of organism. In contrast, differential staining distinguishes organisms based on their interactions with multiple stains. In other words, two organisms in a differentially stained sample may appear different colors. Differential staining techniques commonly used in clinical settings include Gram staining, acid-fast staining, endospore staining, flagella staining, and capsule staining.
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: </a><a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Staining microscopic specimens</a>

정착과 절편

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation ...