Name: three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks at JoVE.com

이 작품은 발달 장애 및 Placental 분석 LLC, 새로운 Rochelle, 뉴욕에 있는 뉴욕 주 사무실에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜 발달 장애 인간의 연구 윤리 위원회에서 기초 연구에 대 한 뉴욕 주 연구소의 지침을 따릅니다.
1. villous 트리 해 부
<ol><li>씻어 말린 고정 태 반 조직을 제거 하는 포 르 말린 고 페 트리 접시에 해 부 현미경의 스테이지에 buffed 인산 염 (PBS)14 . 메스와 미세 집게를 사용 하 여 태 반 조직을 떨어져 villous 나무 (흰 실 같은 분기 구조)를 찾으려고 애타게. 모 나무 (길이가 몇 mm)의 조각을 밖으로 dissect 그리고 조직 마이크로 튜브 포함 ~ 1 mL PBS에 전송.</li>
</ol>2. immunofluorescent 얼룩
<ol><li>피 펫, PBS를 제거 하 고 신선한 PBS를 바꿉니다. 가끔 소용돌이와 10 분 동안 서 보자. 한 번 더 반복 합니다. 참고:이 단계 및 모든 추가 단계 1 차적인 항 체 외피를 제외 하 고 실내 온도에서 수행 됩니다.</li>
	<li>제거 하 고 PBS 0.1 PBS 교체를 피 펫을 사용 하 여, 이차 항 체의 조직 및 블록 비 특정 바인딩 permeabilize 트리톤 X100% + 2% 염소 혈 청 (PBS-T-GS). 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>2% 염소 혈 청을 포함 하는 PBS PBS-T-GS 바꿉니다, 그리고 둘 다 단일 클로 널 안티-CK7 및 토끼 안티-CK7 마우스.<ol>
<li>4 ° c.에 하룻밤 조직을 품 어</li>
		<li>PBS-GS와 가끔 소용돌이와 10 분간 세척 하 여 남아 있는 항 체를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS-GS를 제거 하 고 두 염소 반대로 마우스 IgG 녹색 발광 결합을 포함 하는 PBS GS 바꿉니다 (520 nm) fluorophore 그리고 염소-토끼 IgG는 적외선 방출 (652 nm) fluorophore.</li>
		<li>2.1 단계를 반복 하 여 항 체를 제거 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 실 온에서 immunolabeled 조직을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 조직의 설명
<ol><li>10 분 간격 3 회 PBS와 함께 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>피 펫으로 PBS를 제거 하 고 50% 에탄올으로 대체 하 여 조직을 탈수 (메탄올 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라). 품 어 10 분에 대 한 신선한 50% 에탄올으로 대체 하 고 10 분 3 외피의 총에 대 한 이것을 한 번 더 반복 하는 동안 품 어. 70%와 외피를 반복 합니다. 그런 다음 100% 에탄올으로 대체 하 고 15 분 동안 품 어 (또는 메탄올 사용 될 수 있습니다).</li>
	<li>뾰족한 집게와 전송 조직 포함 하는 신선한 마이크로 튜브 ~ 4 h 1 mL 솔루션 1.</li>
	<li>뾰족한 집게와 신선한 마이크로 튜브 포함 솔루션-2에 대 한 조직의 전송 ~ 4 h. 참고: 어둠 속에 저장 하는 경우는 면역 형광은 실내 온도에 안정 6 개월 이상.</li>
	<li>지우고 잃은 것으로 어떤 수성 솔루션, (예: 설치 매체)와 혼용 하지 마십시오.</li>
</ol>4입니다. 장착입니다
<ol><li>부드럽고 쉽게 변형으로 조직 표준 유리 슬라이드와는 coverslip 간의 조직을 거치 하지 말라.</li>
	<li>그림 5B 를 참조 하십시오 및 다음과 같습니다; 사익스-무어 챔버에 조직 탑재<ol>
<li>뾰족한 집게 장소 25 m m 라운드 coverslip 챔버에 기본.</li>
		<li>뾰족한 집게는 coverslip에 베이스에 고무 가스 켓 장소.</li>
		<li>피 펫 드롭 (~ 40 µ L) 솔루션-2는 coverslip의 센터에 장소.</li>
		<li>뾰족한 집게 전송할 조각 조직 솔루션-2에서는 coverslip의 센터에 드롭.</li>
		<li>장소는 가스 켓 상단 두 번째 coverslip.</li>
		<li>회사까지 coverslips와 가스 켓을 압축 하는 베이스의 상단에 잠금 고리를 스레드. 참고: 조심-강화 또는 coverslip 깨지는 것 이다.</li>
		<li>기지에는 가스 켓을 통해 포트 22 게이지 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>3 mL 주사기와 함께 채우기 ~ 솔루션-2의 1.5 mL.</li>
		<li>주사기에 25 게이지 바늘을 탑재 합니다.</li>
		<li>반대 포트와 개 스를 통해 주사기 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>다른 25 게이지 바늘을 통해 약 실에 있는 공기 배기는 확인, 부드럽게 솔루션 2and 채우기 챔버를 주입.</li>
		<li>바늘과 주사기를 제거 하 고 confocal 현미경 무대에서 대형 유리 슬라이드에 챔버를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, PDMS 실리콘 시트에서 사용자 지정 웰 스 컷.<ol>
<li>가 위는 25.4 × 25.4 m m2 에서 조각을 PDMS 시트를 잘라.</li>
		<li>메스로 잘라 ~ 12.7 × 12.7 m m2 조각에서 잘.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 단단히 조각을 누릅니다.</li>
		<li>솔루션-2 상단에 잘 채워.</li>
		<li>마이크로 튜브의 조직 조각을 우물의 센터에 전송.</li>
		<li>뾰족한 집게 우물 위에 coverslip는 coverslip 하단 솔루션-2 유체는 그런 장소.</li>
		<li>Confocal 현미경 단계에 있는 조직으로 사익스 무어 챔버 어셈블리를 장착 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>10 배 목표와 초점으로 조직 챔버에 가져와.</li>
	<li>현미경 단계를 위아래로 조직 상하 간의 거리를 측정 하는 초점 비행기 이동 합니다.</li>
	<li>아래로 위에서 조직을 통해 이미지의 집합을 포함 하는 confocal 이미지 파일을 수집 하려면 2.5 µ m 단계에서 단계를 이동 합니다.</li>
</ol>6. 반전 청소
<ol><li>개간 조직 한 마이크로 튜브 포함 > 20 배 100% 에탄올의 볼륨을 전송 하 여 역방향. 1 h에서 간격은 70% 에탄올 50% 에탄올 및 PBS 바꿉니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 이제 단면화 및 조직학 표준 파라핀 포함, 조직 또는 면역 조직화 학적인 얼룩 처리 합니다.</li>
</ol>7입니다. deconvolution
참고: 다음 단계에 대 한 소프트웨어 명령, 탭 및 드롭 다운 메뉴는 이탤릭체.
<ol><li>Deconvolution 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 파일을 엽니다.</li>
	<li>'Summary' 창에 나열 된 매개 변수를 입력 합니다.<ol>
<li>에 대 한 '간격 여 복 입력 x, y, 및 z 치수 µ m에.</li>
		<li>각 색 채널에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 immunostaining에 대 한 사용 하는 형광 염료를 선택 합니다.</li>
		<li>에 '적임 ', Confocal 레이저 스캐닝 드롭-다운 메뉴에서 선택 합니다.</li>
		<li>에 '렌즈 ', 10 배 드롭-다운 메뉴에서 선택.</li>
		<li>에 '침수 매체 ', 드롭 다운 메뉴에서 선택 하는 공기.</li>
		<li>클릭은 '적용 ' 버튼.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Deconvolution' 탭을 클릭 하십시오.</li>
	<li>클릭 '3D Deconvolution' 드롭-다운 메뉴에서.</li>
	<li>에 '3D-Deconvolution' 창 설정이 보험: 1) 적응형 PSF 블라인드, 2) 이론적 PSF, 3) 사용 (기본 적응형 PSF, 10 반복, 중간 잡음), 4) 기본 이름.</li>
	<li>클릭은 '녹색 체크 버튼 ' 프로그램을 시작.</li>
	<li>완료 되 면 단계를 프로그램을 다시 시작 7.3-7.6을 반복 합니다. 완료 되 면 제 3의 그리고 마지막으로 그것을 다시 시작.</li>
	<li>에 '데이터 관리자 ' 창 클릭 파일 앞에 "10-10-10-".</li>
	<li>클릭은 '파일 ' 탭을 누른 다음 '다른 이름으로 저장 '.</li>
	<li>선택 'sA 저장'창에서 '8 비트 부호 없는 정수 ' 에서 '데이터 형식 ' 드롭-다운 메뉴를 클릭 저장.</li>
</ol>8. 이미지 처리
<ol><li>피지 소프트웨어를 시작 합니다.<ol>
<li>클릭 '파일 ', 클릭 '오픈 ' 와 Deconvolved 이미지 파일을 선택 하 고 클릭는 '오픈 ' 버튼에 '오픈 ' 창.</li>
		<li>클릭 '이미지/색상/분할 채널 단 하나의 색을 포함 3 개의 새로운 파일로 변환 3 색 이미지 파일. Immunolabeled villous 모 세관 이미지 집합을 포함 하는 빨간 이미지 파일을 저장 합니다. 녹색 및 파랑 이미지 파일을 삭제 합니다.</li>
		<li>빼기와 붉은 이미지 파일에서 배경 형광: '과정/빼기 배경 '.</li>
		<li>드롭-다운 메뉴에서 10 픽셀 롤링 볼 반지름을 설정합니다.</li>
		<li>4 메뉴 옵션을 둡니다 누른 '확인 '.</li>
		<li>클릭 '예 프로세스 스택 메뉴에.</li>
		<li>열어 고유의 조직 형광 (autofluorescence)를 제거는 '이미지/조정/밝기-대비 ' 메뉴와 최소, 최대, 밝기 및 대비 설정을 조정. 수 모 세관 면역 형광 검사 중 하나를 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
		<li>열어 없는 형광 남은 최소화는 '이미지/조정/임계값 ' 메뉴와 모 세관 면역 형광 강조 표시 된 슬라이더를 조정. 검사는 '어두운 배경 ' 상자와 클릭 '적용 '. 에 '변환 이진 드롭-다운 ' 메뉴 검사는 '블랙 배경 ' 상자와 클릭 '확인 '. 아래 분석에 대 한 흑인과 백인 (바이너리) 이미지 파일을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9입니다. 분석
<ol><li>개체를 계산 하 고 Skeletonization입니다.<ol>
<li>8.1.8 단계에서 생성 된 이진 이미지 파일을 선택 합니다.</li>
		<li>클릭 '분석/3D OC 옵션 ' 고 확인만 '볼륨 ' 와 '저장소 결과...' 상자에 드롭 다운 메뉴. 그는 '쇼 숫자' 확인란이 보험. 클릭은 '확인 ' 버튼.
</li>
		<li>Click에 '분석/3D 개체 카운터 '. 설정 드롭 다운 메뉴에서 '크기 필터: 분 ' 5000. 보장 하는 '가장자리에 개체 제외 상자 선택 하지 않으면. 확인 하는 '개체s통계 와 '요약 ' 상자 확인. 클릭은 '확인 ' 버튼. 참고:이 파일 크기 및 컴퓨터 구성에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>통계 표 및 개체 맵 파일을 저장 합니다.</li>
		<li>개체 맵 파일을 선택 합니다. 클릭 '플러그인/해골/Skeletonize 2D-3D' skeletonize 이진 파일에 있는 모 세관 네트워크를. 클릭 '파일/저장으로. 선택 'Tiff...' 드롭-다운 메뉴에서. TIFF 창에서 추가 "Skel-" 개체 맵 파일 이름 하 고 클릭는 '저장 ' 단추.
</li>
		<li>클릭 '분석/해골/분석 뼈대 2D-3D'. 드롭 다운 메뉴에서 기본 설정을 적용 하 고 클릭는 '확인 ' 버튼. 분기 '정보' 테이블을 저장은 '결과 테이블, 그리고 두 개의 출력 파일 (Skel 개체 표시-뼈대와 태그 골격).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+features+of+placental+programming.">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, 47-53 (2016).</li><li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years.">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li><li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. 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저자는 공개 없다.

제도적 검토 보드 electively 종료 임신에서 포 르 말린 고정을 위한 placental villous 조직의 컬렉션을 승인 했다. 의료 기록의 짧은 검토 지적 모성 연령, 패리티, 및 기본 의료 (예:고혈압, 당뇨병, 루 푸 스) 또는 태아 (구조 또는 염색체 이상이의 부재를 확인 절차를 수행 하기 전에 비정상적인 성장) 수행 되었다. 데이터 시트 및 모든 수집 된 표본은 표시만 연구. 따라서, 모든 표본 운영 스위트?...

개발 태 반 및 그것의 병 리에 대 한 우리의 이해는, 큰 측정에서 제한 된 인접 villi 조직학 섹션에서 파생 된 포함 된 모세 혈관 사이의 공간 관계를 유추. 이 연구에서 우리 모 세관 네트워크 기능 (예: 분기, 견고)의 분석에 대 한 적합 한 인간의 태 반 모 세관 네트워크의 3 차원 (3D) 렌더링을 생성 하는 수단을 개발 하 여이 문제를 해결 했습니다. 이렇게 하려면 우리는 두 상업 조직 청소 제품, Visikol-1 및 Visikol-2 (이라고 솔루션 1과 솔루션 2) immunofluorescent 얼룩 결합.
인간의 태 반 어머니의 intervillous 혈액 및 태아를 개발 사이의 인터페이스에 위치한 혈관의 광대 한 복합물 이다. 탯 chorionic 접시에 그것의 삽입에서 밖으로 확장, 동맥과 정 맥 ramify 정교한 혈관 네트워크 chorionic 표면을 커버 하는 네트워크로 분기 한다. 그들의 끝 다음 내부 또는 placental 디스크 그들은 몇 가지 더 분기 세대를 받아야 하 고 터미널 villi 및 그들의 포함 된 모 세관 네트워크, 가스, 영양소, 교류의 사이트에서 끝의 깊이에 아래로 침투 및 대사 태아와 모성 혈액 사이 낭비.
개발 하는 동안 태 반 모 세관 네트워크에 모욕 태아, 신생아 유아 및 응급 성인 1,2,3의 건강에 대 한 지속적인 결과 했습니다. 유산, 자궁내 성장 금지 등 임신 관련 pathologies에 비추어 사전 eclampsia 및 모성 당뇨병 4,,56 은 높은 가치 측정 방법 개발에 배치 하 고 placental villous 모 세관 네트워크 특성 주요 장애물은 태 반 혈관 네트워크 규모의 광범위 한 범위를 포함. 표면 혈관 네트워크는 직경에서 4-5 m m로 대단할 수 있다. 터미널 villous 모세 혈관 지름; 10-20 µ m의 순서는 태 반 혈관 7의 300 킬로미터 이상 포함 되어 있습니다. 현재, 선박 규모의 이러한 극단을 캡처할 수 있는 몇 가지 편리 하 고 빠른 기술이 있다. 날짜 하려면, villi 수가 적은 현미경으로 렌더링할 수 있습니다. 예를 들어 Jirkovska 외 에 초점을 맞춘 태 반 모에 용어, confocal 현미경 검사 법을 직렬 광학 섹션 120 µ m 두께 섹션;에서 얻은 1 µ m 간격 결합 공부 하는 샘플도 통계의 수에 데이터 8을 제공 했다. 모 세관 구조 확인 되었다 그리고 villi과 모세 혈관의 윤곽 내보낸 이미지 분석에 대 한 경시와 손으로 그린 했다. 저자, "성장 villous 혈관 네트워크"에 대 한 그들의 발견의 의미를 논의 하는 동안 같은 결론만 "용어" (36 + 주 임신 나이) 조직 공부 때 문제가 있습니다. 마찬가지로, 마요네즈 동부 표준시는l.과 피어스 외. 혈액 흐름과 산소 전송의 그들의 시뮬레이션에 대 한 같은 나이의 조직에 의존 하지만 그들의 분석만 몇 가지 용어, 터미널 villi 9,10 로 제한 되었다 . Stereology는 또한 villous 혈관의 구조 연구에 적용 되었다. 하지만 다시, 포커스는 일반적으로 하나 이상의 임신 합병증 11,12liveborn 유아를 제공 하는 이후 임신에.
최근까지, confocal 현미경 검사 법에 국한 되었다 조직 100-200 µ m의 깊이에 영상 여기의 흡수 및 형광의 방출 overlying 조직 13 . 삭제 하는 조직과 3D 조직학 널리 설명 되었습니다 문학에는 비록 많은 삭제 하는 조직에 대 한 수많은 방법을 적합 하지 않습니다 조직 사용 일반적으로, 그들은 돌이킬 수 없는 hyperhydration 통해 세포 형태학을 손상 단백질 또는 지질 제거. 따라서, 이러한 결과 조직 자체와 우리의 조직 삭제 과정은 가역 기술은 전통적인 조직학에 대 한 유효성을 검사할 수 있는 반면 처리 하지 유물을 나타내는 확인 수는 없습니다. 조직 개간은 일반적으로 세 가지 주요 방법의 한을 포함 한다: 1) 균일 한 일치 하는 조직 구성의 굴절률 (RI)의 연속으로 렌즈에서 발생 하는 누적 빛 산란을 제거 하는 RI 일치 솔루션, 침수 낮은 리 (cytosol) 및 높은 RI (단백질/지질) 성분을;의 변동 2) 하이드로 겔에 포함 및 지질 구성 요소; 제거 하 전기 이동 법/보급을 활용 하 여 지질 구성 요소 제거 3) 확장/변성 단백질 구조를 리 13의 균일성을 장려의 증가 침투를 허용. 이러한 이미지는 조직의 속성을 나타내는 경우 결정 하는 도전으로 이러한 3D 표현은 의심 임상 가치는 이러한 접근 수 조직 투명 렌더링 biomarkers의 3D 표현에 대 한 생성 될 수 있지만 또는 조직의 프로세스를 삭제. 다른 한편으로, 우리의 조직 삭제 가역 이므로 표준 조직학 및 immunohistochemistry 변경은 임상적으로 중요 한 여부를 평가 같은 조직에 적용할 수 있습니다.
이 연구는 9 월 23 일 완료 된 주 임신 및 두 개의 전체 기간 정상 배달 사이 23 임상 정상적이 고 electively 종료 임신의 총에서 얻은 47 원심 villous 샘플의 분석을 선물 한다. 면역 형광 라벨 trophoblast 및 endothelia의 변화 villous 혈관 네트워크 그리고 그들의 복잡성의 양적 및 자동화 된 분석 수 있었습니다.
이 프로토콜, 우리는 절연 하 고 터미널 villi 이전 규모 불가능 그들의 모 세관 네트워크 분석. 임신 villous 및 모 세관 네트워크 개발에 적용 하는 경우이 방법을 건강 한 아이의 탄생에 대 한 기초는 그 속성을 식별 합니다. 복잡 한 임신의 연구에 적용 될 때 또한 때 placental pathologies villous 나무와 그들은 칼 집, 모 세관 네트워크를 수정 하는 방법 및 이러한 태아 복지에 충돌 하는 방법을 명확히 것입니다.

<table><tbody><tr><td>10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic</td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tube (1.7 mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>disposable, 3ml transfer pipette</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Dilute to 0.1% from stock</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>Dilute to 2% in PBS solution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-CD31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>green emitting (520 nm) fluorochrome&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>infrared emitting (652 nm) fluorochrome</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Ethanol alcohol 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Dilute down to lower concentrations using PBS as needed</td></tr><tr><td>Solution-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solution-2</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore chambers</td><td>BellCo Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Needes</td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD disposable syringe</td></tr><tr><td>PDMS silicon sheets</td><td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>Fiji image processing software</td><td></td><td></td><td>free, Open source&amp;nbsp; software available at https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>Component 1 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Alcoholic Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>Component 2 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>Component 3 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>Component 4 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry detection system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Detection System HRP DAB</td></tr></tbody></table>

three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks

영양소와 가스 교환 어머니와 태아 사이 모성 intervillous 혈액 및 많은 인간의 태 반의 실질을 구성 하는 광대 한 villous 모 세관 네트워크의 인터페이스에서 발생 합니다. 원심 villous 모 세관 네트워크는 탯 줄에서 밖으로 확장 하는 혈관의 분기의 여러 세대 후 태아 혈액 공급의 종착역입니다. 이 네트워크에 인접 한 세포 칼 syncytial trophoblast 배리어 층 태아 혈액의 혼합 방지와 모성 혈액에 그것은 지속적으로 목욕을. 장애 산 모 당뇨병, 고혈압, 비만, 등에서 발생 하는 placental 모 세관 네트워크의 무결성에 모욕 그 현재의 심각한 건강 위험 태아, 유아, 및 성인에 대 한 결과 했습니다. 이러한 모욕의 구조적 효과 더 잘 정의 하는 프로토콜 순서를 1-2 m m3 점에서 하나 완전 복잡에 토폴로지 기능을 조사할 수 있다 모 세관 네트워크 구조를이 연구에 대 한 개발 되었다. 이 위해 클러스터 터미널 villi의 태는 해 부, 그리고 trophoblast 레이어 및 모 세관 endothelia immunolabeled. 이 샘플은 다음 공초점 이미지 스택을 ~ 1 m m의 z 깊이를 취득 하는 가능 하 게 하는 프로세스를 삭제 새로운 조직으로 명백 하 게. 이러한 스택 3 차원 렌더링 후 처리 및 분석을 위한이 방법의 적합성의 유효성 검사로 볼륨, 모 세관, 지점과 모 세관 분기 엔드 포인트의 수와 같은 기본 모 세관 네트워크 측정을 생성 하 모 세관 네트워크의 특성화

클러스터 용어 배달 8 주 임신 나이에서 인간 태 반에 터미널 villi의 모세 혈관의 생성 된 3 차원 렌더링 개별 클러스터로 간주 되었고 skeletonized 네트워크 분석에 대 한. 태 반 (그림 1A)의 기능 단위는 어디 그들은 태 실질 (그림 1B, 그리고에서 확대 1 C) 침투 하는 표면 혈관의 확장 모 나무입?...

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.6K 조회수.  The New York State Office for People with Developmental Disabilities. 이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

발생학

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

면역학 및 감염병학

Improving ex vivo Placental Explant Culture using a Flow-Based Approach(흐름 기반 접근법을 사용한 생체 외 태반 이식 배양 개선)

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

저자 스포트라이트: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues(태반 조직에서 단일 세포 시퀀싱 및 공간 조직학을 통한 연구 발전) 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

생물학

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

생화학

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

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