Lundbeck 재단 아후 스 대학, Dandrite와 Lundbeck a/S 지원이 작품.

참고: 달리 명시 되지 않은 실 온에서 모든 단계를 수행 하 고 얼음 이나 냉장고 (를 제외 하 고는 차입에서 SDS를 포함 하는 버퍼) 버퍼를 유지. 프로토콜 5 섹션으로 나뉘어져: 준비의 RNA 샘플; ip; 구슬의 준비 구슬;에 RNA BrU 표시의 바인딩 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출;에 의해 바운드 BrU 셔 서 RNA의 정화 (실시간 정량 Pcr를 사용 하 여이 예제)에서 RNA의 분석
1입니다. RNA 샘플의 준비
<ol><li>자동화 된 셀을 사용 하 여 카운트 HEK293T 셀 카운터와 10 mL 성장 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 및 50 µ g/mL 페니실린/스)에서 10 cm 배양 접시에서 3,500,000 셀의 합계를 씨앗 > 40 µ g RNA 따라 추출 48 h 후. 37 ° C, 5% CO2세포를 유지 합니다.</li>
	<li>시드, 후 48 h 8 mL 성장 매체를 발음 하 고 셀 밖으로 건조를 피하기 위해 2 mL를 남겨두고. 2mm BrU를 추가 하 고 모든 치료 8 mL를 발음 하는 성장 매체, 그리고 8 mL BrU 포함 성장 매체를 다시 적용 하기 전에 셀에서 잔여 2 mL를 제거. 이 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 세포는 BrU의 응용 프로그램에 따라 신선한 미디어 사용을 하지 않습니다.</li>
	<li>BrU와 치료 1 시간에 대 한 셀을 품 어. 5 mL 행 크의 버퍼에 셀을 세척 하 고 2 mL 0.05% 트립 신을 사용 하 여 셀을 trypsinize. 8 mL 성장 미디어 반응을 중지, 15 mL 튜브에 세포를 전송 1000 x g 2 분에 대 한 셀 아래로 회전을 추가 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 고 RNA 격리를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 총 RNA 추출 키트 ( 재료의 표참조) 또는 다른 메서드를 선호 하 고 진행 준비까지-80 ° C에서 RNA RNase 무료 H2o. 저장소에에서 elute.</li>
</ol>2입니다. 준비 구슬의 IP에 대 한
<ol><li>조사를 더하기 하나 pipetting 동안 손실에 대 한 계정 및 혼합 소용돌이 추가 샘플 수에 대 한 배치에 비즈를 준비 합니다. 회전 혼합 하 여 철저 하 게 반대로 마우스 IgG 자석 구슬 resuspend 고 RNase 무료 1.5 mL 튜브에 샘플 당 20 µ L 구슬 꺼내. 장소는 마그네틱 스탠드에는 구슬을 두고 약 20 s 1.5 mL 튜브에 수집.</li>
	<li>제거는 상쾌한, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 꺼내와 pipetting으로 400 µ L 1 x BrU IP 버퍼에서 resuspend. 아주 짧게 2에 대 한 튜브를 회전 탁상 원심 분리기에 s 마그네틱 스탠드에 다시 배치 하 고는 상쾌한 제거. 한 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>헤 파 린을 사용 하 여 구슬 블록 난다 바인딩입니다. 1 ml 1 구슬 resuspend x BrU-IP + 1 mg/mL 헤 파 린 버퍼, 그리고 회전 30 분 세척을 위한 구슬, 단계 2.2에서 두고. 참고: 헤 파 린은 RNAs 바인딩을 위해 경쟁할 것 이다 마이너스로 충전 된 중합체 이다. tRNA 또는 다른 관련이 없는 RNAs 또한 사용할 수 있습니다 경우 다운스트림 응용 프로그램 시퀀싱 하지.</li>
	<li>BrU IP 버퍼 x 1 ml 1 구슬 resuspend 고 추가 1.25 µ g/샘플 안티-α-Bromodeoxyuridine 항 체, BrU 인식 합니다. 1 시간에 대 한 구슬 회전 하는 동안 품 어 또는 실 온에서 하룻밤.</li>
	<li>세척 단계 2.2에서 세 번 비즈. 1mm BrU와 떠나 난다 바인딩 IP 중의 위험을 구슬 하 고 이로써 항 체의 감도 낮추는 30 분 회전 보충 50 µ L/샘플 1 x BrU IP 버퍼에 구슬 resuspend.</li>
	<li>3 번 단계 2.2에서 구슬 세척 하 고 50 µ L/샘플 1xBrU-IP 버퍼에서 resuspend.</li>
</ol>3. 구슬에 RNA BrU 표시 바인딩
<ol><li>1.3 단계에서 RNA 추출에서 RNA 농도 측정 자외선 보이는 분 광 광도 법, 사용 하 고 40 µ g RNA 각 샘플에서 RNase 무료 H2O 200 µ L의 총 볼륨을 희석.</li>
	<li>열 변성 RNA와 짧게 탁상 원심 분리기에서에서 회전에 80 ° C에서 2 분 동안 RNA 샘플. BrU-IP + BSA/RNAse 억제제 x 200 µ L 2를 추가 합니다.</li>
	<li>50 µ L resuspended과 구슬 단계 2.6에서에서 각 샘플을 준비 하 고 회전 1 h. 세척 4 번 단계 2.2에서 구슬을 두고 추가 합니다.</li>
</ol>4. 차입 및 3 단계 페 놀-페 놀/클로 프롬-클로 프롬 추출에 의해 RNA의 정화
<ol><li>
RNA을 elute 및 페 놀 추출
	<ol>
<li>RNA, elute 200 µ L 차입 버퍼에 구슬 resuspend 그리고 그 후 신속 하 게 추가 200 µ L 페 놀, pH 6.6 (주의: 독성, 참조 단계 4.1.2 아래) 샘플에서 어떤 비 RNA 분자를 제거 하.</li>
		<li>회전 혼합 샘플, 그리고 스핀 탁상 원심 분리기에 25000 x g에서 3 분. 참고: 페 놀 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 약 산 성 pH RNA 및 DNA 하지 추출 됩니다 보장 합니다. RNA의 친수성 특성상 위 수성 단계에서 유지 됩니다. 단백질의 소수 성 코어 페 놀을 바인딩할 하 고 낮은 유기 페 놀-단계로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페 놀-클로 프롬 추출
	<ol>
<li>(처리에 경험에 따라 200 µ L의 약 190 µ L) 가능한 만큼 위 단계를 발음 하 고 200 µ L 페 놀/클로 프롬, pH 6.6 튜브로 이동 (주의: 독성, 참고). 샘플에 걸쳐 동일한 금액을 발음 해야 합니다.</li>
		<li>소용돌이 샘플 스핀 25000 x g에서 3 분에 대 한 믹스. 참고: 클로 프롬 독성 및 피부 보호를 착용 하는 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 클로 프롬 반전 녹음 방송14 및 중 합 효소 연쇄 반응을15를 억제 하 여 RNA의 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 페 놀 제거에 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(지금 약 180 µ L), 앞으로 수성 위 단계 발음 하 여 클로 프롬 적 출을 수행 하 고 200 µ L 클로 프롬을 포함 하는 관에 전송. 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 스핀 25000 x g에서 3 분.</li>
	<li>(지금 약 170 µ L) 앞으로 수성 위 단계를 발음 하 고 17 µ L (1/10 볼륨) 3 M 채널3COONa, pH 6.0 포함 된 튜브에 그것을 전송. 중화 하 고 수성 해결책에서 RNA를 침전, RNA와 함께 침전 하 고 RNA 펠 릿을 더 보이는 게 2 µ L glycogen (20 mg/mL)을 추가 합니다.</li>
	<li>몇 번 튜브를 거꾸로 하 여 RNA와 혼합 소금 이온 사이의 바인딩을 증가 500 µ L 96% 에탄올을 추가 합니다. 드라이 아이스에 하룻밤-20 ° C에서 15 분 튜브를 둡니다.</li>
	<li>25000 x g, 4 ° C는 펠 렛을 방해 하지 않고 30 분 삭제 상쾌한에 샘플을 회전 하 고 모든 잔여 소금 제거 하려면 185 µ L 75% 에탄올에 펠 릿을 세척. 25000 x g, 5 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다.</li>
	<li>펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한을 완전히 삭제 하 고 열린 뚜껑으로 5 ~ 10 분 건조 펠 릿을 둡니다. RNase 무료 H2O 튜브의 측면에 적용 되는 펠 렛을 방해 하지 않으려면 10 µ L resuspend.</li>
</ol>5입니다. RNA의 분석
<ol><li>CDNA cDNA 반전 녹음 방송을 사용 하 여 준비 ( 재료의 표참조) 장비 또는 선호 하는 다른 방법을 사용 하 여 2 µ L RNA 샘플 및 1 µ g 효 모 총 RNA RNA 매체로 cDNA 합성 반응 (사용 되지 않음 cDNA 다음 세대 시퀀싱에 사용 하는 경우)에 대 한. 효 모 RNA 없이 1 µ g RNA를 사용 하 여 해당 입력의 cDNA 준비에 대 한.</li>
	<li>희석 cDNA 1시 25분와 혼합 희석 9 µ L cDNA 10 µ L 정량으로 마스터 믹스와 1 µ L fluorogenic 프로브, 두 재료의 테이블에에서 지정 된. 참고: cDNA 희석 cDNA 준비 및 사용 되는 정량 Pcr 방법에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>(예를 들어, 7500 빠른 실시간 PCR 시스템 또는 동등한) 다음 정량 프로그램 실행: 50 ° C, 20에서 2 분 95 ° C, 3의 40 주기에서 s s 95 ° C와 30에서 60 ° c.에 s</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase+2+modulates+&#945;-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production.">Polo-like kinase 2 modulates &#945;-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li><li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRIC-seq:+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Lee, T. I., Young, R. 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Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li><li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes.">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li><li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells.">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li><li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose?+How+to+evaluate+its+activity?.">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?.</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).</li><li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Alkynyl-2'-deoxyuridines:+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells.">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li><li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts.">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li><li>D&#246;lken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li><li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes.">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li><li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression.">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 RNA 생산 새로 라벨의 결정 BrU, 즉각적인 RNA 추출 및 BrU 셔 서 RNA의 immunoprecipitation와 1 시간에 대 한 RNA를 생산을 위한 BrU IP의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 참조16에서 설명한 하 고이 문서를 페 놀-클로 프롬 정화 단계 BrU의 낮은 농도와 미리 치료 구슬 IP 특이성 및 RNA 순도 증가 몇 가지 추가 단계를 포함 IP 다음 RNA 순도 증가. 또한, 우리는 또한 여기 BrU IP의 특이?...

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) 없이 세포에서 RNA 생산의 연구 또는 매우 제한 된 효과에 짧은 기간1,2라벨 동안 생리학 세포. 메서드는 안티-BrU 항 체 (그림 1)를 사용 하 여 이라는 RNA의 IP에 의해 새로 합성된 RNA로 부 순 뒤 합성 uridine 파생의 기반으로 합니다.
수십 년간 그 단백질 합성은 transcriptionally 통제 될 수 있다, 그리고 녹음 방송 요인의 존재는 이상의 50 년 전 가설 되었다 알려져 있다3. 오늘, 그것은 여러 가지 질병은 전사 및 RNA 안정성의 dysregulation에 의해 발생 알려져 (참조4보충 그림 S1), RNA 생산에 변화를 측정 하는 능력은 이해 질병에 매우 중요 하 고 개발입니다.
다른 한편으로, RNA 생산 규제 도구 너무 적은 또는 너무 많은 단백질 식 또는 파 킨 슨 병 (PD)에 같은 단백질 축적으로 인 한 질병 치료를 위한 새로운 가능성을 제공 합니다. 주된 단백질 축적으로 불용 성 집계 PD에서 α-synuclein 이며 α-synuclein 유전자의 유전자 곱셈 발생 가족 PD5α-synuclein의 수준, 질병에 직접 연결 합니다. 또한, α-synuclein 농도 의존 방식으로 집계합니다. Α-synuclein mRNA 수준의 Downregulation 그러므로 성공적으로 달성 하고있다 RNA 간섭 PD 설치류 모델6,7에 신경 세포 손실 감소를 사용 하 여 흥미로운 치료 전략 이다.
그것은 질병 또는 치료 내정간섭에 기인 하는 RNA 생산의 변화를 측정할 수 있을 해야 합니다. 첨단 방법 등 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량), 뒤 반전 녹음 방송 RNA의 측정 정상 상태 수준은 구별 또는 transcriptional 규칙에 의해 발생 하는 변경의 수 변경 RNA 안정성입니다. RNA 감소율의 조사를 위해 널리 사용 되는 방법은 transcriptional 기계 화합물 α-amanitin 악티노마이신 D 뒤에 부패 RNAs의 측정 등을 사용 하 여 차단 합니다. 그러나, 세포 apoptosis8,9의 유도 등에서 전사의 전반적인 방해와 관련 된 몇 가지 문제가 있다. 세포 독성 효과 옆에 transcriptional 억제제는 또한 느린 세포질 통풍 관에 α-amanitin 악티노마이신 D (참조10검토)의 특이성의 부족 등 여러 가지 기술적인 문제를 제시.
전사의 전반적인 막힘을 피하기 위해, 뉴클레오티드 아날로그 사용 되었습니다, 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), 부 순 등. 이들은 쉽게 포유류 세포에 의해 채택 고 새로 합성된 RNA, RNA의 특정 시간 프레임 내에서 펄스 라벨 사용에 통합. BrU 5-EU와 4-부 엉, 보다 적은 독성 그것은 선택11,12의 기본 아날로그.
BrU IP RNA 합성 속도, 안정성 모두를 조사 하 고 따라서 총 RNA에 변화의 근본 원인 사이 구별을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 RNA 합성의 측정에 초점을 것입니다 고2 RNA 안정성의 조사에 대 한 자세한 내용은 참조를 참조. RNA 합성을 조사, 세포는 BrU 예 1 h BrU-IP1 (그림 1C) 다음으로 이라는 짧게. 이 시간 내에 짧은 라벨 합성 하는 RNA의 측정을 가능 하 게 하 고 관찰 된 변화 보다 RNA 합성에 실시간 정량 하 여 총 RNA에 변화를 측정 하 여 규정의 더 나은 견적을 줄 것 이다. 그러나 그것은,, 그 라벨에, 예를 들어 1 h만 하더라도 저하 아직도 있을 수 있다 관찰 RNA 수준에 영향을 미치는 언급 한다.
BrU IP 실험에서 RNA는 실시간 정량1 또는 다음 세대 시퀀싱2,13다운스트림 분석에 적합 합니다. 다른 표준 RNA 검출 방법, 북부에 게 더 럽 히기 등 ribonuclease 보호 분석 결과, 특정 RNAs에 적용할 수도 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ribolock Rnase inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman RNA probes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td>
			<td>Flurogenic probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR system</td>
			<td colspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &#956;g/&#956;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xBrU-IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &#956;g/&#956;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

정상 상태 RNA 레벨 두 가지 조건 사이 비교는, 변화는 생산 또는 RNA의 변경으로 인해 발생 하는 여부를 구별 수는. 이 프로토콜의 RNA 생산, 5-Bromouridine immunoprecipitation, 짧은 기간 (예를 들어, 1 시간) 내에서 합성 하는 RNA의 조사를 가능 하 게 선행 하는 RNA의 라벨을 사용 하 여 측정 하는 방법을 설명 합니다. 5 Bromouridine 라벨 및 immunoprecipitation의 α-amanitin 악티노마이신 D 등 독성 transcriptional 억제제의 사용을 통해 장점은 없습니다 또는 단기 사용 중 세포 생존 능력에 매우 낮은 효과. 그러나, 5-Bromouridine-immunoprecipitation만 캡처 RNA 시간 내에 짧은 라벨 생산, 천천히 생산 뿐만 아니라 급속 하 게 저하 때문에 RNA이이 방법으로 측정 하기 어려운 수 있습니다. 5-Bromouridine-immunoprecipitation에 의해 체포 5 Bromouridine 이라는 RNA 반전 녹음 방송, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응, 그리고 다음 세대 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다. RNA의 모든 종류, 조사 하 고 메서드가이 예에서 제시 mRNA를 측정에 국한 되지 않습니다.

BrU 라벨 시간의 초기 테스트 AsPC-1 셀에서 수행 했다. 셀 0, 1, 2, 및 4.5 h, 총 RNA 추출 및 BrU IP BrU로 치료 했다. GAS5와 GAPDH는 충분 한 약 9-및 44 배 변경에 비해 배경 (0 h) GAPDH와 GAS5, 각각을 도달 하는 1 h 라벨 BrU IP RNA에서 측정 되었다.
BrU IP 및 위에서 설명한 분석 변경 사항을 발견 하는 경우를 조사 하는 데 사용 했다 (PLK-2) 폴로-같?...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K 조회수.  Aarhus University. RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

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RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

고밀도 DNA 및 RNA 마이크로어레이 - 광소학 합성, 하이브리드화 및 대형 핵산 라이브러리의 제조

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

요약

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