이 작품은 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 미국 재향 군인 담당 부서, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 재단 (BX002356에 의해 부분적으로 지원 ISCBIRF) 인디애나 주 보건 (019919), 및 Mari Hulman 조지 기부금 펀드의.

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다.
1. 수술 준비
<ol>
	<li>척추 안정제를 포함 하 여 모든 수술 도구를 소독. 수술 테이블 및 70% 에탄올과 모든 주변 지역 청소. 비 생존 수술의 준비, 37 ° C가 열 패드 상단 깨끗 한 수술 패드 장소.</li>
	<li>6 주 오래 된 Sprague Dawley (SD) 쥐를 사용 하 여이 연구에 대 한. 무게와 케 타 민 (87.7 mg/kg) 및 xylazine (12.3 mg/kg) 혼합물의 복 주사와 쥐를 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답을 중단 하는 경우 마 취의 적절 한 단계를 확인 합니다. 피하 주사 0.01-0.05 mg/kg Buprenorphine 및 5 mg/kg Carprofen 수술 전에.</li>
	<li>2 지역에 쥐 면: 뒷면 및 목 지역을 가슴 쪽에 자 궁 경관 등뼈 지역. 70% 알코올 잎사귀 betadine 외과 스크럽과 피부 영역 면봉. 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 깨끗 한 수술 패드에서 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
</ol>
2. 외부 경 정 맥 도관 법
<ol>
	<li>외부 경 정 맥, 쇄 골 근처 펄스 포인트를 찾는 하 여 찾아서 3 해 부 포인트 크로스 포인트는 자리에 수직 절 개를 만들기 위해 작은 봄이 위 컷: 오른쪽 mandible의 큰 결 절의 꼬리 ramus 상 완 골 및 위 (그림 1A). 봄이 위 및 미세 집게를 사용 하 여 선박을 격리 합니다. 1 메 마른 외과 봉합 사 선 (그림 1C)20선단부를 묶어.</li>
	<li>1 1 mL 주사기 가득 염 분 및 21-게이지 바늘 (그림 1B)에서 만든 특수 카 테 터와 연결을 준비 합니다. 그릇에 마이크로 위를 사용 하 여 작은 절 개를 하 고 선박에는 카 테 터를 슬라이드.<ol>
		<li>두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다. 
		참고: 바늘에 흐르는 혈액의 작은 양의 바늘 혈관을 성공적으로 입력 했습니다 나타냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 척추 안정화 및 C5-C7 Laminectomy
<ol>
	<li>경향이 위치에 동물을 놓습니다. 원하는 척추 레벨에서 15 번 메스 블레이드와 중간 선 따라 피부를 잘라. 근육 레이어 5회 에서 7번째 경관 척추 (C5-C7) 양측 측면 측면 (그림 2A)21폭로 해 부. 
	참고: 고 견 사이 스파이크를 찾는 하 여 두 번째 흉부 척추를 (T2)을 찾습니다. C7 척추21,22,,2324찾을 T2 척추에서 위쪽으로 계산 합니다.</li>
	<li>수정 된 안정화 장치를 사용 하 여 쥐의 척추를 안정화 합니다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 스테인리스 스틸 팔 노출된 가로 프로세스 측면 아래 슬라이드와 안정성 (그림 2B)를 확보 하 고 나사를 조입니다.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 C5-C7 하기 (laminectomy, 그림 2C).</li>
	<li>계속 moisturized (그림 2D) 노출된 dura mater 위에 식 염 수에 젖은 gelfoam의 작은 조각을 넣으십시오.</li>
</ol>
4. 2 광자 (2 P) 이미징 창 설치
<ol>
	<li>물건 작은 조각의 gelfoam 근육과 척추 뼈 사이의 간격으로 또한 척수와 척추 뼈 사이 gelfoam의 얇은 라인을 물건 다음 조직 접착제 접착제를 사용 하 여 근육-뼈 주변을 밀봉 하기 위하여. 완전 한 건조 (그림 2E)에 대 일 분 기다립니다. 
	참고: 이 단계는 효과적으로 창 시키는 침수 솔루션으로 미래의 출혈을 방지 합니다.</li>
	<li>DdH2O 전자 레인지에 4 %agar 준비 합니다. 고 한 천이 녹는 완전히 후 만질 수 있는 온도에 반환 될 때까지 기다립니다. 한 솔루션으로 1 mL의 멸 균 주사기를 (그림 2E) 벽을 만들려고 윈도우의 가장자리에 파이프. 솔루션 신속 하 게 굳은 렌즈 또는 목표 자유롭게 이동할 수 있도록 유연 하 고.</li>
	<li>이미징에 대 한 준비를 하는 경우 2 P (그림 2F) 이미징에 대 한 창 gelfoam 및 장소 침수 액체를 제거 합니다. 2 광자 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 전송 및 2 P 이미징 창 렌즈 아래에 직접 배치. 이미지 창으로 렌즈를 신중 하 게 낮은.</li>
</ol>
5. 첫 번째 형광 염료 및 초기 이미징의 주입
<ol>
	<li>0.5 mL Rhodamine B isothiocyanate-Dextran의 준비 (4 mg/mL 평균 분자량 ~ 70kDa) 염 분에. 솔루션 1 mL의 멸 균 주사기를 이전에 설치한 카 테 터에 주사기를 연결. 
	참고: 형광 염료 솔루션을 준비 하 고 전에 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>주사기를 매우 느리게 우울 하 여 첫 번째 염료를 주사 (그림 3B). 먼저, 관심의 영역을 식별 하는 접 안 렌즈를 사용 합니다. 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 랜드마크 이미지와 낮은 확대율에서 표면 혈관 패턴의 밝은 필드 이미지를 얻으려고. 전환 하 레이저 스캐닝 모드와 다음 두 이미지를 수집 하기 위한 소프트웨어 이미징 2p를 열고 고 라인 스캔 데이터.</li>
	<li>Fluorophores 군데 조직에 있는 사용에 맞게 적절 한 2 P 레이저 여기 파장, 전력 및 형광 채널 (첫 번째 염료 빨강 채널)을 선택 하 고 vivo에서 화상 진 찰 (그림 3E)를 수행. 전체 과정에서 열 패드에 동물 유지.</li>
</ol>
6. C7 Contusive 부상 리사 장치를 사용 하 여
<ol>
	<li>C7 중간 타 박상 부상 이전 설립된 프로토콜25,26에 따르면 루이빌 부상 시스템 장치 (리사) 장치를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
		<li>간단히, 다음 보정 리사 무대에 동물을 배치 합니다.</li></ol></li></ol>0 포인트 설정을 선택 하 고 조직 조정 후 변위 (이 경우 0.800 m m), 소프트웨어 충돌 릴리스를 실행 하 고 부상을 만들의 "실험 실행" 버튼을 클릭 합니다.
		<li>부상, 후 식 염 수에 젖은 gelfoam moisturized 유지 하 노출된 dura mater 위에 다른 작은 조각을 놓습니다.</li>
	
	
	<li>4.3 단계를 반복 하 고 다시 수행 vivo에서 화상 진 찰 이전 주입된 붉은 염료와 표시 같은 지역에 (그림 3C &#38; F).</li>
	<li>동물 다시 수술 테이블에 전송 하 고 동물 IACUC IUSM 프로토콜에 따라 적절 한 마 취와 진정을 유지.</li>

7. 두 번째 형광 염료 주입 후 부상 영상
<ol>
	<li>염 분에 Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, 평균 분자량 ~ 70 kDa) 0.5 mL를 준비 5.1에서 동일한. 1 mL의 멸 균 주사기에서 솔루션을 작성 하 고 이전에 설치 된 카 테 터와 연결.</li>
	<li>2 P 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 다시 전송 하 고 다시 첫 번째 염료에 대 한 빨강 채널와 두 번째 염료에 대 한 녹색 채널 같은 지역 이미지 (3D 인물 &#38; G).</li>
	<li>영상의 마지막에 척추 안정화 장치에서 쥐 놓고 천 벽 청소.</li>
</ol>
8. 동물 희생
<ol>
	<li>이미징, 후 transcardial 관류 프로토콜27다음 쥐를 희생. 척수 샘플을 수집 하 고 4%에 그들을 수정 PFA.</li>
</ol>
9. 오프 라인 데이터 분석: 혈관 직경의 정량화
<ol>
	<li>오프 라인 분석에 대 한 워크스테이션에 이미지 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택 열고 연관 된 단일 이미지 파일 (그림 4B).</li>
	<li>"분석" "비율 설정" (그림 4C) 다음을 선택 하 여 이미지를 보정. "픽셀에서 거리"에 배치 하는 값은 그림 4A에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 2 광자 광 렌즈의 교정 방정식에 기본 값을 결정합니다. "OpticalZoom"의 값은 Excel 확장 태그 Languagefile (XML 파일) 단일 이미지 파일 (그림 4B)와 관련 된에서 발견 된다.</li>
	<li>혈관의 긴 축에 수직인 선 그리기 (그림 4D1 &#38; E1)와 "분석" 뒤에 "측정"을 선택 하십시오. 혈관 직경의 측정 결과 창에 표시 됩니다 (그림 4D2 &#38; E2). 평균 값을 얻으려고 선박에서 3 회를 반복 한다.</li>
</ol>
10. 오프 라인 데이터 분석: 빨간 혈액의 정량화 셀 (RBC) 속도
<ol>
	<li>분석을 위한 워크스테이션을 라인 스캔 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어 시작 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택한 확장 이름 ".ome"와 모든 연결 된 라인-스캔 파일을 열.</li>
	<li>"이미지"를 열고 "스택" 뒤에 "스택 이미지"를 선택 합니다. 단일 이미지 스택 TIFF 파일로 모든 오메 파일을 변환 합니다.</li>
	<li>Matlab 소프트웨어를 시작 하 고 "열기"를 클릭 합니다, 그리고 "LSPIV_parallel.m" 코드 파일을 선택 합니다. 참고: LS-PIV를 위한 Matlab 코드 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 에서 다운로드 될 수 있다</li>
	<li>다음 주문을 선택: "실행" &#62; "폴더 변경" &#62; "동맥". 10.3에서 생성 된 이미지 스택 TIFF 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>"Y"를 입력 하 고 Enter 키를 누릅니다.</li>
	<li>커서를 왼쪽 및 오른쪽 이미지의 각각, 그리고 프로그램 데이터 처리 하기 시작.</li>
	<li>프로그램의 끝에, 최종 읽기 계산을 2 값을 입력: "pixel_meter 변환 값", 그리고 "스캔 시간 변환 값". 둘 다 라인 스캔 데이터와 관련 된 XML 파일에서 찾을 수 있습니다. 최종 값으로 평균 및 표준 편차 (mm/s) 당 밀리미터의 단위로 속도의 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>National Spinal Cord Injury Statistical Center. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Cord+Injury+Facts+and+Figures+at+a+Glance.">Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance.</a> SCI Data Sheet 2016. , (2016).</li><li>Dumont, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+spinal+cord+injury,+part+I:+pathophysiologic+mechanisms.">Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms.</a> Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).</li><li>Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. 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Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

과학 다음 혈관 연구에 대 한 하나의 도전 전통적인 기법 혈관 구조 변화 사후 샘플에 크게 제한 하기 때문에 기술적 제한입니다. 이 소설 에서 vivo imaging 위에서 설명한 방법을 혈액 흐름과 관련된 매개 변수 (속도 및 선박 직경) 살아있는 쥐에서 2 P-LSM을 사용 하 여 동적 측정을 수 있습니다. 그것은 또한 contusive 영향은 다음 다른 시간 지점에서 혈관의 동일한 세트에 반복된 검사 수 있습니다. 이전 2 광자 현미경 이미징 기술을 단일 추적 프로그램의 누설 때문 후 외상 혈관 구조를 포착 하지 못했습니다. 우리의 듀오 컬러 디자인 충격적인 모델에 대 한 동적 혈관 이미징이 있습니다. 또한,이 방법의 유연성 급성 혈관 변화 영향은 다음의 임시 공간 프로 파일을 생성 하는 기회를 제공 한다
우리의 에 비보 듀오 컬러 이미징 방법에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 시간 경과 영상, 특히 호흡 모션 아티팩트를 줄일 전에 척수의 물리적 안정성을 보장 하기 위해 기본적 이다. 우리 설계 안정화 동안 척추 척추의 높이 약간 인상 척추 클램프의 모양. 따라서 호흡 동물을 연관 척수의 운동 수 크게 감소 (그림 1D-F, 2B). 이미징 각 세션의 시작 전에 척수의 안정성을 확인 하는 것이 좋습니다. 척수 안정성을 달성 하지 못하면 조정 정렬 및 척수 클램프의 견고 하 여야 한다. 둘째, 주변 조직 (뼈, 근육 층 및 피부) 이미징 창으로 출혈 보기의 오염 위험 수 있습니다. 부드러운 이미지 세션에 대 한 효과적인 예방에 대 한 주변 조직에 gelfoam 조직 접착제 접착제를 적용 합니다. 셋째, 우리가 선택 하는 형광 염료로 알 부 민 (66 kDa), 주요 높은 분자량의 혈장 단백질은 비슷한 크기를 있다. 조건 하에서 항상성, 염료 민28유사한 선박 내부 크게 유지 했다. 부상 후 염료 방해 내 피 구조를 통해 전달 하 고 맥 관 구조 (그림 3 층-G)의 주변 지역에서 형광 강도 중요 한 증가 일으키는 실질에 유출. 또한, 우리가 외부 경 정 맥 도관 법을 선택 하는 이유는 두 가지 이유가 있다. 첫째, 그것은 언제 든 지 실험의 배달의 일관 되 게 액세스할 수 있는 경로 제공할 수 있습니다. 둘째, 그것은 미래의 치료 주사에 대 한 경로로 사용할 수 있습니다.
비록 우리의 vivo에서 듀오 컬러 방법 외상 성 혈관 이미징 연구에 대 한 새로운 장소를 제공할 수 있게,이 기술에 대해 약간의 경고를 해결 합니다. 현재,이 기술은 2 시간 포인트 (기준선 및 1 시간 후 포인트)에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 설계 되었습니다 하지만 추가 형광 염료와 채널 사용할 수 있는 경우 여러 시간 포인트 전환 가능. 비록 만성 intravital 이미징 이식된 유리 창을 사용 하 여 여러 연구, 외상 성 부상19,,2930, 후 동일한 선박에 초기 계획 정보 제공할 수 있습니다 그들 중 누구도 31,32. 이러한 연구와 달리 우리의 창 없는 유리 창이입니다. 이것은 사전 및 사후 부상 이미징, 편리 하지만 장기 관찰에 대 한 창 재건에 대 한 도전 수 있습니다. 우리의 미래 연구는 만성 이미징 기술 향상에 노력 하고있다. 혈관 시스템은 여러 선박 종류 (동맥, 정 맥 및 모 세관)로 구성 되며 각 형태와 기능의 측면에서 다른. 영상 중 선박 종류 중에서 차별화는 애타게 혈관 변화의 명확한 패턴을 도울 수 있었다. 위의 프로토콜 형태 및 속도;에 따라 선박을 식별 하는 관찰자에 따라 달라 집니다. 그러나, 동맥 특정 염료 선박 종류33사이 더 명확한 분류 줄을 쉽게 추가할 수 있습니다.
이 기술은 contusive에 평가 제한 및 다른 충격 모델, 호감의 부상과 방사선 상해 뿐만 아니라 하지만에 BSCB의 초점을 맞추고, 뿐만 아니라 혈관 침투성 변경. 스키, 외 루 경화 증 (ALS), 다 발성 경화 증 (MS) 등 다른 신경 퇴행 성 질환에 따라 혈관 변화를 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 동적 neurovascular 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물 모델에 양도 될 수 있습니다. 강력한 검사 도구로 서 미래 연구는 척수 부상에 대 한 치료의 효능을 평가 하기 위해 여기에 설명 된 이미징 기술을 활용 수 있습니다.
결론적으로, vivo에서 듀오 컬러 방법은 신뢰할 수 있는, 실시간 vivo에서 접근 도구는 시간적 공간적 혈관 프로필의 동적 혈관 변화를 평가 하 고 치료에 대 한 심사 영향은 다음과 같은 2 차 피해를 줄이기 위해

외상 성 척수 상해 (SCI) 모터, 감각, 및 자치 기능의 손상으로 이어지는 일반적인 상해가 이다. 에 따르면는 국립 척수 부상 통계 센터 (NSCISC) 2016 년에, 약 282000 명 동안 그들의 69% 교통 사고 때문에 주로 영향을 받은 또는1폭포. 이러한 환자는 종종 인텐시브 케어; 필요 그러나, 효과적인 치료는 현재 사용할 수 있습니다. 따라서, 과학으로 새로운 효과적인 전략 시급히 필요 합니다.
과학은 주로 두 개의 단계로 분할 된다: 기본 부상과 2 차 부상. 영향2, 염증, 세포 apoptosis, 점차적으로 이어질 나머지 축 삭의 demyelination 등 보조 부상 사건의 연속에 의해 다음의 사이트에서 출혈 성 괴 사를 일으키는 물리적 모욕을 구성 하는 주요 부상 에 형태학 상과 기능적인 적자3,4,,56의 확장. 출혈 부상, SCI7,8의 급성 단계에서 즉각적인 혈관 장애를 나타내는의 첫번째 보이는 표시 이다. 초기 혈관 손상을 줄이기 위한 신경 보호 전략 환자의 회복을 향상 시킬 수 있습니다 하지만이 사건의 초기 포스트 상해는 혈관 병 태 생리 메커니즘의 더 나은 이해.
이전 연구는 척수 맥 관 구조 공부를 다양 한 방법을 사용 하 여에 불구 하 고 중요 한 한계는 남아 있다. 예를 들어 수소 클리어런스9, autoradiography10, microangiogram8, 관 부식 캐스트11및 immunohistochemistry12, 사후 샘플만을 공부 하는 가장 공유 단점 ,13. 레이저 도플러 Flowmetry 척수 혈액 흐름14의 비 침범 성 실시간 모니터링을 제공, 하지만 그것은 혈관 시스템을 구별 하 여 혈관 형태학 상 변화를 감지 수 없습니다. 동적 대비 강화 된 MRI (DCE-MRI) 또한 비 침범 성, 하지만 그것은 저해상도 이미지를 생성 하 고 비싼 인프라15요구.
Vivo에서 2 광자를 사용 하 여 이미징 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2 P-LSM) 피 질16,,1718에 vasodynamics 공부에 대 한 개발 되었습니다, 그리고 연구의 제한 된 수 있다 두 가지 이유로 더 도전 contusive 부상 후 시연된 혈관 변화 영향은 탕 외. 다음 hemisection 모델19, 그러나 영상에서 병 변 사이트의 가장자리에 혈액의 흐름에 변화를 보여왔다. 첫째, 전통적인 유리 광학 창 부상 사이트 것 하지 기계적 영향을 유지 하 고 이미징 기능 유지. 둘째, 누설으로 인해 실질에 추적의 출혈 후 부상 영상과 어려움을 만듭니다.
여기 우리가 영상 사전 및 사후 부상 시간 지점에서 동일한 개별 선박 수 소설 듀오 컬러 이미징 방법 제시. 또한, 그것은 contusive 문화에 따라 혈관 동적 변화의 시간적 공간 프로 파일 제공 또한 여러 후 시간 점에서 이미징에 대 한 가능성이 있다. 이 프로토콜은 혈관의 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물에 직접 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>Skin sterilization</td></tr><tr><td>Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg)</td><td>Patterson Veterinary&amp;nbsp;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>Anesthetic agent</td></tr><tr><td>Buprenorphine(0.03 mg/mL)&amp;nbsp;</td><td>Patterson Veterinary&amp;nbsp;</td><td>07-891-9756</td><td>Pain relief agent</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>Non-steroidal anti-inflammatory drug</td></tr><tr><td>Dukal Gauze Sponges&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>Skin sterilization</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>Skin sterilization</td></tr><tr><td>Artificial Tears Eye Ointment</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261&amp;nbsp;</td><td>Prevent drying eyes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>1006015</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&amp;ndash;Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Average mol wt 70kDa</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>Average mol wt 70kDa</td></tr><tr><td>Instrument Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>for sterilizing surgery tool</td></tr><tr><td>Spine stabilizer set</td><td>Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Contact Y. Ping Zhang for details.&lt;br/&gt; (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB</td><td>Tissue adhesive Glue</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>Stop bleeding</td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps- Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomy</td></tr><tr><td>Surgical Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12&amp;nbsp;</td><td>skin cut</td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>skin cut</td></tr><tr><td>micro angled scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>3-0 vicryl sutures</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>Silk Black Braided Non-Absorbable Suture, 3-0, C-7, Reverse Cutting, 18&quot;</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200.V0</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Can be from any vendor</td></tr><tr><td>Two-photon Laser Scanning Microscope</td><td>Bruker Fluorescence Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LISA device</td><td>Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Contact Y. Ping Zhang for details.&lt;br/&gt; (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Corporation</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>Two-photon imaging software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Matlab statistics toolbox</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>Image analysis software</td></tr></tbody></table>

an in vivo duo-color method for imaging vascular dynamics following contusive spinal cord injury

척수 상해 (SCI) 상해의 사이트에 중요 한 혈관 장애를 발생합니다. 혈관 병 리 과학 후 즉시 발생 하 고 급성 부상 단계에 걸쳐 계속 됩니다. 사실, 내 피 세포 contusive 문화 후에 먼저 표시 혈액 척수 장벽 (BSCB)의 증가 된 침투성을 포함 한 초기 혈관 이벤트 vasogenic 부 종 유발 하 고 복잡 한 부상 메커니즘에 의해 발생 하는 해로운 2 차 부상 이벤트에 기여. 혈관 장애를 대상으로 따라서, 수 과학 후 조직학 및 기능 장애에 기여 하는 보조 부상 계곡을 줄이기 위해 핵심 전략 이전 연구와 사후 샘플에 수행 주로 했다 혈관 네트워크의 동적 변화를 포착 하지 못했습니다. 이 연구는 vivo에서 듀오 컬러 2 광자 이미징 메서드를 contusive 문화에 따라 급성 혈관 동적 변경 내용을 모니터링 개발 했습니다. 이 방법은 혈액 흐름, 혈관 직경, 및 사전 및 사후 부상 같은 쥐의 다양 한 사이트에서 다른 혈관 병 리 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 혈관 역학 조사에 대 한 훌륭한 장소를 제공 합니다.

방법은 변화를 모니터링 vivo에서 동적 척추 혈관 개별 선박 수 사전 및 포스트 외상 성 문화 첫째, 카 테 터는 후속 형광 염료 주사 (그림 1A-C, 그림 3)에 대 한 액세스 권한을 제공 하려면 외부 경 정 맥을 통해 설치 됩니다. 두 번째 단계에서 전문된 기구는 노출된 C5-C7 (그림 1D-F, 그림 2A-B)를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 이 안정화 단계 호흡 아티팩트를 제거 하 고 꾸준한 이미지를 제공할 수 있습니다. (그림 2C) laminectomy, 다음 다음 단계 2 P C5-C7 (그림 2D-F)을 통해 창 이미징의 설치입니다. 주변 조직 척추 영상 창의 주위 출혈을 최소화 하는 것이 성공적인 혈관 이미징에 대 한 중요 합니다. 다음 단계 (그림 3A-B, E) 기준으로 rhodamine dextran 형광 염료 (빨간색) 랜드마크 지도 혈관 네트워크를 언급 한 카 테 터를 통해 주입 하는. C7 중간 중간 심각도 contusive 부상, 후 원하는 후 시간 포인트에서 도입 FITC-dextran (녹색) (그림 3A &#38; D). 듀오-색 방법의 아름다움은 한 여전히 첫 번째 염료는 이미 부상 (그림 3G)으로 인해 실질으로 밖으로 유출 하는 경우 두 번째 염료를 사용 하 여 혈관 구조를 검색할 수 있습니다.
이미징 세션 동안 그것은 마 취 유도 후 몸 핵심 온도 유지 하는 생리대에 동물을 유지 하는 것이 좋습니다.
우리의 듀오 컬러 메서드를 사용 하 여 개별 혈관의 직경 및 적혈구 속도 (RBC 속도) 측정 되 고 계산. 직경, 하나 ImageJ 교정 (그림 4) 후 3 반복에 그것의 최대 직경에 선박을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 속도, 라인 스캔 이미지 RBC 속도 (그림 5)18계산 Matlab 프로그램 (MATLAB R2013a)를 사용 하 여 측정 됩니다. 형태학, 혈액 흐름 속도, 및 혈관 직경에 따라, 혈관으로 분류할 수 있습니다 2 카테고리: 동맥과 정 맥 (표 1 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
그림 1 . 경 정 맥 도관 법 및 척추 안정화 (A) 외부 경 정 맥을 찾기 위한 그리기 회로도. (B) 21-게이지 바늘에서 만든 특수 카 테 터. 팁 지상 평평 하 고 다른 21-게이지 바늘에서 잘라 2 밀리미터 팁의 조각으로 용접 했다. (C)는 회로도 도관 법의. 선단부는 근 위 카 테 터 안정화, 혈관 (혈관 결 찰, 파란색 화살표) 함께 바늘을 고정으로 끝나는 다음 먼저, 출혈입니다. (D) 수정된 척추 안정제의 이미지. C5-C7 창 laminectomy (E) 이전 및 laminectomy contusive 문화 (F) 후 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
그림 2 . 광 창 설치 단계별 회로도입니다. ( A) 1 단계: 절단 피부와 중간 선 따라 근육에 의해 척추를 노출. (B) 2 단계: 척추 안정화. (C) 3 단계: laminectomy. (D) 4 단계: 식 염 수에 젖은 gelfoam의 조각을 배치 하 여 척수의 수 분을 유지. 5 단계 (E) : 살 균 gelfoam와 vetbond 간격 물개. 건조 후, 한 천 벽의 레이어 창의 가장자리에 만들어집니다. (F) 6 단계: 이미지에 대 한 준비, 이미징 창 2 P 내부 gelfoam 및 장소 침수 액체 제거. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
그림 3 . vivo에서 듀오 컬러 방법 절차 단계별. 5 단계 (A)모든 절차에 의하여 이루어져 있다. 다음 1 단계와 2 단계, 대략 70의 크기와 한 쌍 dextran 추적기의 KDa는 (전에 척수 맥 관 구조를 시퀀스에 주입 하는B 와 C) contusive 문화 (D)후. (E)-(G) 대표 2 P 이미지-단계 5 단계 3에서 척수 맥 관 구조를 표시. 흰색 화살표 영역 (F 및 G)를 새 첫 번째 파 붉은 염료를 가리킨, 청록색 화살촉 표시 두 번째-파도 녹색 염료 누설 (G). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
그림 4 . 수집 및 척추 혈관 직경의 정량화 준비, 다음 단일 이미지 파일 보정된 값 (B)의 XML 파일과 함께 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A) 방정식 표시 "픽셀의 미크론 당" 광학 확대/축소 값에 따라 계산이 됩니다. ImageJ (C)에서 교정, 후 선박 직경 전에 경도 축을 3 지점에서 측정 된다 (D1) 후 (E1) 부상. (D2) 및 (E2) 측정된 값을 표시. (F) 기준선과 30 분 후 상해에서 혈관 직경의 정량화. 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 표시 됩니다 ± SD, 의미 * * * p &#60; 0.0001, 양측 쌍체 t 검정.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
그림 5 . 수집 및 척추 배 속도의 정량화 라인 스캔 이미지 파일은 단일 선박 속도 계산 하기 위해 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A)는 선택한 용기와 혈관 RBC 속도 평가 하는 방법의 예입니다. (B) 라인 스캔 이미지와 속도의 계산에 대 한 해당 플롯 파일의 동맥 예 뿐 아니라 정 맥 (C)의 예. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>동맥</td>
			<td>정 맥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>형태학</td>
			<td>직선, 부드러운, 두꺼운 혈관 벽</td>
			<td>분기, 거친 가장자리</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>혈액 흐름 속도</td>
			<td>빠른</td>
			<td>천천히 하지만이 다릅니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>직경</td>
			<td>30-80 µ m</td>
			<td>100-250 µ m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 기준 선박 유형 식별

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An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

an-vivo-duo-color-method-for-imaging-vascular-dynamics-following

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

9.4K 조회수.  Indiana University School of Medicine. 우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

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A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

연구

생물학

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

신경과학

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat

Laser Doppler flowmetry (LDF) is a noninvasive method for blood flow (BF) measurement, which makes it preferable for measuring microcirculatory alterations of the spinal cord. In this article, our goal was to use both Laser Doppler imaging and monitoring to analyze the change of BF after spinal cord injury. Both the laser Doppler image scanner and the probe/monitor were being employed to obtain each readout. The data of LDPI provided a local distribution of BF, which gave an overview of perfusion around the injury site and made it accessible for comparative analysis of BF among different locations. By intensely measuring the probing area over a period of time, a combined probe was used to simultaneously measure the BF and oxygen saturation of the spinal cord, showing overall spinal cord perfusion and oxygen supply. LDF itself has a few limitations, such as relative flux, sensitivity to movement, and biological zero signal. However, the technology has been applied in clinical and experimental study due to its simple setup and rapid measurement of BF.

Here we present a combination of laser Doppler perfusion imaging (LDPI) and laser Doppler perfusion monitoring (LDPM) to measure spinal cord local blood flows and oxygen saturation (SO2), as well as a standardized procedure for introducing spinal cord trauma on rat.

레이저 도플러 이미징 및 모니터링을 사용 하 여 쥐에서 척수 미세 분석 하

Laser Doppler flowmetry (LDF) is a noninvasive method for blood flow (BF) measurement, which makes it preferable for measuring microcirculatory ...

행동분석학

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an important target for neuroprotective therapies. Although several techniques have been described to assess SCBF, they all have significant limitations. To overcome the latter, we propose the use of real-time contrast enhanced ultrasound imaging (CEU). Here we describe the application of this technique in a rat contusion model of SCI. A jugular catheter is first implanted for the repeated injection of contrast agent, a sodium chloride solution of sulphur hexafluoride encapsulated microbubbles. The spine is then stabilized with a custom-made 3D-frame and the spinal cord dura mater is exposed by a laminectomy at ThIX-ThXII. The ultrasound probe is then positioned at the posterior aspect of the dura mater (coated with ultrasound gel). To assess baseline SCBF, a single intravenous injection (400 &#181;l) of contrast agent is applied to record its passage through the intact spinal cord microvasculature. A weight-drop device is subsequently used to generate a reproducible experimental contusion model of SCI. Contrast agent is re-injected 15 min following the injury to assess post-SCI SCBF changes. CEU allows for real time and in-vivo assessment of SCBF changes following SCI. In the uninjured animal, ultrasound imaging showed uneven blood flow along the intact spinal cord. Furthermore, 15 min post-SCI, there was critical ischemia at the level of the epicenter while SCBF remained preserved in the more remote intact areas. In the regions adjacent to the epicenter (both rostral and caudal), SCBF was significantly reduced. This corresponds to the previously described &#8220;ischemic penumbra zone&#8221;. This tool is of major interest for assessing the effects of therapies aimed at limiting ischemia and the resulting tissue necrosis subsequent to SCI.

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...

의학

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.