Name: electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping
Uploaded: 2018-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
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이 작품은 지원 프로그램에 의해 연구 환경 개선에 대 한 특별 조정 자금에서 젊은 연구자에 대 한 홍보 과학 및 기술 (SCF) (T.S.)를, 보조금에 대 한 과학적 연구 (제 16 K 09494, T.S., No. 26293052, T.F.)를 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의. 부탁 드립니다 Brainvision 및 씨 켄 지 Tsubokura 기술 지원에 대 한 그리고 우리는 또한 그의 언어 지원에 대 한 씨 존 마틴을 감사 드립니다.

이 동물 실험 승인 되었고 수행 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 도쿄 의료 및 치과 대학 규정.
1입니다. 준비
<ol><li>재고 솔루션<ol>
<li>분해 전압에 민감한 염료 (디-4-ANEPPS, 및 RH237) 및 캘리포니아2 + 표시기 (로드 2 오전) 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 각각 6 m m, 10 mM, 10 mM의 농도로 재고 솔루션을 만들기 위해 함께.</li>
		<li>흥분-수축 (E-C) uncoupler, blebbistatin, 50 m m 재고 솔루션을 만들고 90 %DMSO 디졸브.</li>
		<li>Aliquot 0.2 mL PCR에에서 재고 솔루션, 어두운 방에 튜브 하 고 산화를 피하기 위해 질소 가스를 사용 하 여 재고 튜브에 공기를 대체 합니다.</li>
		<li>재고 튜브는 빛 으로부터 보호 하기 위해 개별적으로 알루미늄 호 일에 포장 하 고-20 ˚C에 그들을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>작업 솔루션<ol>
<li>준비 없이 캘리포니아2 + (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 8.0 m m 나2HPO4및 1.5 m m KH2포4, pH 7.40 NaOH에 의해 조정) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1 L</li>
		<li>Tyrode의 솔루션 (135 m m NaCl, 5.4 m m KCl, 1.8 m m CaCl2, 0.53 m m MgCl2, 0.33 m m NaH2포4, 5.5 m m D-포도 당, 및 5.0 mM HEPES, pH 7.40 NaOH에 의해 조정) 1 리터를 준비 합니다.</li>
		<li>0.22 μ m 병 맨 필터와 Tyrode의 솔루션 필터 및 거품 통 기 통풍 O2 가스 실린더에 연결 하는 공기 돌을 사용 하 여 잘 그것을 공기에 쐬 십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 광학 Langendorff 끼얹는다 마음에 매핑
<ol><li>(그림 1a& b) 두 개의 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 카메라를 사용 하 여 광학 매핑 시스템 조립<ol>
<li>그림 1a& b에서와 같이 광학 매핑 시스템에 CMOS 카메라, 빔 스플리터, 렌즈, 렌즈 리볼버, 광원, dichroic 거울, 필터 및 기타 부품을 조립.</li>
		<li>다른 배율 (1.6 X와 5 X)를 장착 한 터렛의 대물 렌즈를 변경 하 여 확대를 선택 합니다. 참고: CMOS 센서의 크기는 10 mm × 10 mm, 100 × 100 해상도, 즉, 5 X 객관적 렌즈,이 시스템은 20 µ m 공간적 해상도 제공 합니다.</li>
		<li>여기 빛 530의 중심 파장으로 발광 다이오드 (LED) 램프를 사용 하 여 설정 nm, 대역 통과 필터를 통과 (520/35 nm), dichroic 거울과 반영 (560 nm).</li>
		<li>기록 방출 신호는 스플리터로 나눈 (665 nm), 긴 어떤 설정 카메라 1 통과 필터 (697/75 nm) 막 전압에 민감한 염료 (디 4-ANEPPS 또는 RH237), 그리고 카메라 2 대역 통과 필터를 사용 하 여 형광을 감지 (572/28 nm) 감지는 캘리포니아2 + 표시기 (Rhod2-오전)의 신호.</li>
	</ol></li>
	<li>Langendorff 관류 회로 조립<ol>
<li>폴 리 염화 비닐 (PVC) 튜브 연동 펌프에 연결 합니다.</li>
		<li>1.2.3 단계에서 언급 한 대로 100% O2 화난 Tyrode의 솔루션으로 PVC 튜브의 입구 쪽을 넣어.</li>
		<li>손으로 만든에 어 트랩, PVC 관의 방전 쪽 연결 다음 정렬 5 µ m 필터, 3 방향 stopcocks, 압력 변환기, 난방 유리 코일, 그리고 21-게이지 무딘된 바늘 (바늘 크기는 대동맥 크기에 따라 변경 가능) 순차적으로 다른 PVC 튜브를 사용 하 여.</li>
		<li>회로, 어떤 기포를 방지 하는 Tyrode의 솔루션 관류 회로 심장 회로에 연결 될 때까지 중단.</li>
	</ol></li>
	<li>Heparinization 및 마 취<ol>
<li>25 게이지 바늘과 1 mL 주사기를 사용 하 여 마우스에 intraperitoneally unfractionated 헤 파 린 (몸 무게에 200 IU)를 주입 수 있습니다.</li>
		<li>Anesthetize 마우스 pentobarbital (65 밀리 그램/kg)의 복 주사 하 여 10 분 후에 헤 파 린 주입.</li>
	</ol></li>
	<li>Cannulation 및 관류<ol>
<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 동물 핀치 발가락에 응답의 부족에 의해 anesthetized 확인 합니다. 가 위를 사용 하 여 칼 프로세스 수준 아래 복 부 벽을 엽니다. 가로 절 개를 횡 경 막에, 마음에 어떤 손상도 없이 중간 겨드랑이 선 갈비뼈의 양쪽 모두를 잘라 만들고 앞쪽 가슴 벽 위쪽으로 플립. 심장, 뒤에 곡선된 겸 자 사전 및 하강 대동맥, 식도, 및 열 등 한 베 나 정 맥. 다음, 인접 한 혈관 및 대동맥, 폐, 기관지, 식도, 지방 조직, 및 thymus 같은 조직 함께 급속 하 게가 위로 마음을 삭제할.</li>
		<li>페 트리 접시에 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL와 함께 마음을 세척 하 고 인접 한 조직을 제거.</li>
		<li>오름차순 대동맥으로 관류 회로에 연결 된 21-게이지 무딘된 바늘의 팁을 소개 하 고 스레드는 stereomicroscope 아래와 그것을 해결.</li>
		<li>10 분 마음 100% O2화난 Tyrode의 솔루션 perfuse를 시작 합니다.</li>
		<li>증폭기와 레코더에 연결 된 압력 트랜스듀서와 관류 압력을 지속적으로 모니터링 합니다.</li>
		<li>모든 다음 단계를 수행 하는 동안 (일반적으로 2-5 mL/min 흐름 속도 대 한 해당) 80-100 mmHg 사이 관류 압력을 계속.</li>
		<li>얇은 폴 리 에틸렌 (PE) 관 삽입 초기 관류 (2.4.4 단계.), 동안 (외부 직경: 0.8 m m)는 SVC에 스레드 수정. 다음, 데워 진된 유리 챔버 (그림 1b& c)로 마음을 놓습니다.</li>
		<li>24 게이지 내재 바늘 찔린 (외경: 0.7 m m) 아 트리 움, 어떤 손상을 방지 하 고 내부 바늘을 제거 하 심 실 정점 통해 왼쪽된 심 실 (LV) 구멍에는 라스베가스에 외부 정을 떠나</li>
		<li>1 프랑스 크기 사용자 정의 만든 전극 카 테 터는 라스에 전기 자극을 수행할 SVC에서 PE 튜브를 통해 소개 필요한 경우, 심 실 서 성 대 한 우 심 실 (RV)으로 테를 사전.</li>
		<li>오름차순 대동맥 (그림 1c)에 핀 전극과 cannulation 바늘 사이 지속적으로 바이 폴라 심전도 (ECG)를 기록 하 심 실 꼭대기에 핀 전극을 삽입 합니다.</li>
		<li>전체 연구를 통해 심전도 관류 압력 모니터링을 계속 합니다.</li>
		<li>빛을 끄고 어두운 방에서 다음과 같은 실험을 수행.</li>
		<li>2.5 단계로 이동 합니다. 막 전압 또는 2.6의 단일 기록에 대 한. 막 전압 및 캘리포니아2 + 과도 듀얼 녹화에 대 한.</li>
	</ol></li>
	<li>막 전압의 단일 기록에 대 한 얼룩<ol>
<li>막 전압의 단일 기록에 대 한이 얼룩 프로토콜 중 37 ˚C에서가 열 관류 솔루션을 유지 관리 합니다.</li>
		<li>Tyrode의 솔루션 (최종 농도 5 µ M)의 10 mL와 디-4-ANEPPS 재고 솔루션 (6 m m)의 8.3 µ L를 희석.</li>
		<li>2-5 분, 5 분에 대 한 Tyrode의 솔루션으로 희미하게 뒤 관류 루트를 통해 마음에 희석된 디-4-ANEPPS 솔루션의 총 볼륨 (10 mL)를 달 이다.</li>
		<li>Tyrode의 솔루션 (최종 농도 250 µ M)의 1 mL와 함께 blebbistatin 재고 솔루션 (50mm)의 5 µ L를 희석.</li>
		<li>관류 루트를 통해 희석된 blebbistatin 솔루션의 총 금액을 관리 합니다.</li>
		<li>2.6 단계를 생략 하 고 2.7 유실에 대 한 단계를 수행 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>막 전압 및 캘리포니아2 + 과도 듀얼 녹화에 대 한 얼룩<ol>
<li>실 온에서 Tyrode의 솔루션을 유지. 참고:이 초기 설정 온도 막 전압 (2.5 단계.)의 단일 기록에 대 한 얼룩에 다릅니다.</li>
		<li>blebbistatin 단계 2.5.4 2.5.5에서 동일한 방식으로 관리 합니다.</li>
		<li>믹스 3 µ L Rhod2AM 재고 솔루션 (10 mM)의 그리고 30 µ L polyoxyethylene polyoxypropylene의 블록 공중 합체 (DMSO에 20%), F-127 Tyrode의 솔루션의 10 mL와 혼합 희석.</li>
		<li>Rhod2AM 솔루션 (3 µ M)의 총 금액을 로드는 blebbistatin로 동일한 경로 통해 2-5 분 이상.</li>
		<li>Tyrode의 솔루션의 10 mL와 함께 RH237 재고 솔루션 (10 mM)의 7 µ L를 희석.</li>
		<li>희석된 RH237 솔루션 (7 µ M)의 총 금액을 관리 2-5 분 이상.</li>
		<li>위의 절차의 완료, 후 열 37 ˚C에서 Tyrode의 솔루션을 시작 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>희미하게<ol>
<li>다음 실험에 37 ˚C에서 Tyrode의 솔루션의 온도 유지.</li>
		<li>과도 한 염료를 적어도 5 분 동안 Tyrode의 솔루션 마음 perfuse 참고: 단계에 밖으로이 세척 동안 흐름 속도 높일 필요가 있다 (2.4.6 단계로 참조.)</li>
		<li>모든 모션 아티팩트 수축, 및 perfused에 균질 얼룩의 실종을 확인 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플링 및 데이터 분석<ol>
<li>커버 유리 (25 m m × 60 m m) perfused 심장에 신중 하 게, 너무 많은 기계적인 스트레스 없이 심 방 표면에 평평 하 게 놓고 모션 아티팩트는 솔루션의 진동에서 방지. 아 트리 움 적절 하 게 커버 유리에 부착을 확인 합니다.</li>
		<li>레코드는 샘플링으로 CMOS 카메라에 의해 형광 속도 최대 0.1 ms 디 4-ANEPPS, 및 1 RH237 및 Rhod2AM에 대 한 ms 얼룩.</li>
		<li>소프트웨어의 실제 작업에 대 한 제조업체의 지침에 따라 얻은 기록 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.</li>
		<li>관심, 드리프트 제거, 시간축 필터링 및 3 X 3 binning5영역 추출 후 활성화 지도 및 영화를 만듭니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. electrophysiological 연구
<ol><li>서 성 전극 및 자극 기 설정<ol>
<li>자극에 대 한 조직에 RA에서 주문 품 서 성 전극의 팁의 접촉을 확인 (단계 2.4.9 참조.).</li>
		<li>프로그래밍 가능한 자극에 연결 하는 서 성 카 테 터에서 서 성 거 려 모든 자극을 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>서 성 임계값의 결정<ol>
<li>세트 100와 150 ms (0.4 ms의 펄스 폭), 서 성 간격 피하고 어떤 본질적인 리듬 서 성 속도 능가.</li>
		<li>안정적인 심 성를 적어도 20 비트에 대 한 지속적인 서 성 자극을 제공 합니다.</li>
		<li>서 출력에서 설정 5 mV, 다음 안마당을 depolarize에 전달 된 서 성 실패까지 점차적으로 감소.</li>
		<li>광학 녹음 하 여, 심전도 및 심 방 흥분 신호에서 P 파의 존재에 의해 심 여기를 확인 합니다.</li>
		<li>최소 성 서 성 임계값으로 안마당을 depolarize 수 있는 출력을 결정 합니다.</li>
		<li>두 번 서 성 임계값에서 다음과 같은 연구에 대 한 서 성 출력을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상수와 버스트 속도<ol>
<li>99 박동에 대 한 지속적인 성 제공 150 ms에서 시작 된 서 성 간격 또는 내장 리듬을 능가 피하 긴 간격.</li>
		<li>5 ms 단계, 아 트리 움의 1:1 캡처를 실패 하는 간격에 도달 될 때까지 또는 40 ms로 진보적으로 서 성 간격을 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 extrastimulus 서 성<ol>
<li>내장 리듬 outpaces 기본 드라이브 또는 1:1 심 방 흥분을 얻기 위해 서 성 실패 하지 않는 한 120 ms, 100 ms, 및 80 ms 기본 드라이브 (S1)의 서 성 주기 길이 설정 합니다.</li>
		<li>기본적인 드라이브 기차에 대 한 10 박동 자극 성의 수를 설정 합니다.</li>
		<li>-10 ms 기본 사이클 길이 대 한 첫 번째 extrastimulus (S2)를 설정 합니다.</li>
		<li>기본 드라이브의 마지막 서 성 자극 후 s 2를 제공 합니다.</li>
		<li>S2 depolarize 안마당에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계, s 2의 커플링 간격을 단축.</li>
		<li>아 트리 움 depolarize 실패 긴 S2 간격으로 효과적인 내 화물 기간 (ERP)를 결정 합니다.</li>
		<li>ERP의 속도 적응을 평가 하기 위해 3 가지 기본 사이클 길이 ERP를 평가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>더블, 트리플 extrastimuli atrial tachyarrhythmias 유도를 서 성<ol>
<li>없는 부정맥 관찰 하는 경우 포인트 S2 ERP 밖에 서 20 ms S2 간격 재설정.</li>
		<li>추가 두 번째 extrastimulus (S3), S2로 동일한 간격으로 시작 합니다.</li>
		<li>S3 depolarize 안마당에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계 S2 및 S3 사이의 커플링 간격을 줄입니다.</li>
		<li>포인트 10 ms ERP, 밖에 서 s 2의 간격 재설정 다음 3.5.3 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>포인트 각 ERP 밖에 서 20 ms S2 및 S3 간격을 다시 설정 합니다.</li>
		<li>추가 3 extrastimulus (S4), s 3으로 동일한 간격으로 시작 합니다.</li>
		<li>S4 안마당을 depolarize에 실패할 때까지 진보적으로 5 ms 단계 S3 및 S4 사이의 커플링 간격을 줄입니다.</li>
		<li>포인트 10 ms ERP, 외부에 S3 간격 재설정 다음 단계 3.5.7 반복.</li>
		<li>포인트 10 ms ERP, 외부 S2 및 S3 간격 재설정 다음 단계 3.5.7 반복.</li>
		<li>마찬가지로 프로그램 된 자극을 사용 하 여 재현할 수 유도 하 여 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility를 정의 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>심 방 tachyarrhythmias의 inducibility의 평가<ol>
<li>지속적으로 모든 서 성 프로토콜 (3.3-3.5 단계.) 동안에 심전도 기록 합니다.</li>
		<li>각 자극, 심 방 심 박 급진 (AT) 또는 반복적인 심 응답 (RAR)의 유도 기록 하는 동안 전후 광학 녹음을 수행 합니다.</li>
		<li>AF 또는 RAR 유도 하는 경우 동일한 서 성 프로토콜을 적용 하 여 재현성을 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

광학 매핑 심장 전기 생리학7공부에 대 한 확고 책략 이며 심 실 부정맥8,9, 뿐만 아니라 심 방 들을 평가 하는 매우 유용한 도구10,11 . 막 횡단 잠재력 및 캘리포니아2 + 과도 동시 매핑 심장 마비 및 다른 심장 질환12,13관련 된 부정맥의 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 유용 합니다. 단일 셀 또는 셀 시트를 사용 하 여 같은 다른 electrophysiological 평가 방법 비교 perfused 마음에 광학 매핑의 절대 우월 중 하나입니다 그대로 중앙홀에 전도 패턴의 평가 심 실, 부정맥14를 유도 하는 부 비 동 리듬 중 뿐만 아니라 중. 그러나 Murine 마음, 특히 아 트리 움, 인간의 대리로 서 활용 하는 시도 그들의 작은 크기 때문에 주로 어려움 발생 했습니다, 그리고, 마우스는 유전자 조작 동물에 평가 측면에서 매력적인 실험 모델 모델, 그리고이 문제는 극복 되어야 한다. 우리의 방법은 그것을 해결 하기 위해 한 방향으로 제공 합니다.
비록 우리의 광학 매핑 장치 전체 murine 마음15기존의 시스템에 기본적으로 유사 했다, 우리의 메서드는 murine 안마당을 일부 수정 하 여 평가의 이점이 있다. 첫째, 우리는 최대 0.1 ms/프레임 및 20 µ m/픽셀, 그리고이 고해상도 매핑 murine 안마당에서 전도 속도 및 전파 패턴의 더 정확한 측정에 기여의 높은 공간과 시간 해상도를 추구. 둘째, 불필요 한 기계적 손상이 나 electrophysiological 속성 16,17변경 수, 아 트리 움의 스트레치를 피하기 위해 내재 바늘 내부 챔버 압력을 줄이기 위해 라스베가스에 직접 삽입 됩니다. 이전에 수행 하는 라를 통해 삽입 하는 대신 연구15. 또한, 서 성 자극, RA에 주문 품된 1-프랑스 크기 전극 카 테 테 르 통해 전달 하지만 하지 바늘 전극에 의해는 아 트리 움 손상 수 있습니다. 어떤 핀은 지난 연구15에 사용 했다는 심 돌출부를 해결에 피 한다. 셋째, 평가 부정맥의 기본 메커니즘의 측면에서 atrial tachyarrhythmias 유도 프로그램된 자극 프로토콜은 중요 한18,19입니다. 우리 임상 electrophysiological 연구, 버스트 속도 트리플 extrastimuli 마우스 마음에 대 한 서 성 간격의 수정, 서 성까지 프로그램된 자극 동일을 수행 합니다. 따라서, 초기 측정 매개 변수 외에 프로토콜 AT의 inducibility 평가 수 있습니다. 필요할 때, AT의 inducibility isoproterenol 또는 다른 약물의 관리와 평가 이다. 우리의 경험 야생-타입 마우스는 거의 전체 자극 프로토콜 후에 어떤 ATs 보여. 따라서,의 inducibility 유전자 돌연변이, 수술, 약11의 관리 등 여러 가지 병 적인 조건에의 기여를 평가 하기 위한 중요 한 정보 이어야 한다. 이러한 수정 사항을 그대로 murine 중앙홀에 정확한 electrophysiological 평가 최적화 수 있습니다.
또한이 메서드는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 최대 공간 해상도 5 배 목표 렌즈를 사용 하는 아 트리 움의 한 부분에 국한 시야 (FOV) (즉.에 표시 된 그림 2a로 왼쪽된 심 방 돌출부). 아 트리 움의 더 큰 시야를 얻기위한, 1.6 X 목표 렌즈는 때로는 바람직합니다 (그림 2b). 둘째, 핀 안마당을 고정 하지 않고 가끔은 심 방 전도 속성을 올바르게 측정 하기 어려운 심 방 표면이 곡선 이기 때문에. 그래서, 우리는 핀으로 고정 하는 대신 그것을 버리고 그것의 표면에 커버 유리를 배치. 이 방법은 또한 솔루션의 진동에서 모션 아티팩트를 방지 하기 위한 도움이 됩니다. 셋째, 우리의 방법으로, 그것은 그것의 전체 FOV를 꽤 어려운 그래서, 앞쪽 및 후부 보기를 제대로 사용 하려면 그림 2와 같이 다른 접근 보다 우리의 접근 방식에 더 중요 하다. 이전 보기를 이용 병 적인 조건, 특히 돌출부 (그림 4)에 경우 재입국의 명확한 관찰 될 것 이다. 다른 한편으로, 후부 보기 심 방 후 벽의 좋은 볼을 얻기의 이점이 있다 고 트리거링 심근 소매 활동의 상세한 기록 될 수도 있습니다. 때 그것은 적절 한 보기를 얻을 우리의 방법으로 곡선된 표면 평평 어렵습니다, 아 트리 움 핀에 의해 최소한의 긴장으로 해결할 수 있습니다.
우리의 방법으로, 얼룩, 서 성, 그리고 부정맥 유도의 실패 3 가능한 문제 있다. 얼룩, 없는 경우의 오류에 대 한 또는 약간의 형광 관찰, 여부 광학 매핑 장치는 올바르게 조립, 그리고 시 적절 하 게 저장 및 사용 여부를 확인 해야 합니다. 관류 솔루션의 조건 또한 중요 한는 또한 자체, 그래서, pH, 온도를 포함 한 솔루션의 상태는 심장의 electrophysiological 속성 영향을 줄 수 이며 충분 한 통 기 통풍 엄격 하 게 모니터링 하는 여부. 그것은 또한 마음에 어떤 어 혈을 방지 하는 것이 중요입니다. 실패 속도 대 한 서 성 자극 아 트리 움, 흥분 수 없습니다 하는 경우 연구원은 확인 해야 배선 회로 시험기를 사용 하 여 정확한 인지 합니다. 서 성 자극은 올바르게 출력 하 고, 문제는 조직와 전극의 접촉 이다. 전극의 위치 문제를 해결할 수 있습니다 그리고 우리의 접근 서 성 카 테 터를 사용 하 여 쉽게. 부정맥 유도, 어려움에 대 한 계 서는 일부 제한 된 경우에는의 유도 대 한 사용할 수 있습니다. 원심 두 전극과 인접 전극 수에 위치할 RV 및 RA, 각각 quadripolar 전극 카 테 터를 사용 하 여, 그것은 쉽게 RV에 RA에서 서 성 사이트를 변경 하려면 이 카 테이 터 동시 심 실 활성화 신호 마스크 심 방 흥분 신호 때 이동 하는 심 실 흥분에도 유용 합니다.
이 방법은 기여할 것입니다 유전자 표현 형을 평가 하는 AF에서 상호 작용 관련 유전자 유전자는 다른 방법으로 그들을 표시 조사 실패에 대 한 특히 GWAS, 같은 소설 연구에 의해 새로 발견. 장치 및 기술 진보와 함께이 방법을 그대로 마음에 어20의 중요 한 소스는, 폐 정 맥 소매의 electrophysiological 속성을 평가 수 있습니다.

포유류에서 4 챔버가 마음에 의하여 이루어져 있다. 위 두 개의 챔버는 심 방, 되며 낮은 사람 심. 심 전신 또는 폐 순환 하는 혈액을 추출 펌프 작동 합니다. 심 방 조직 또는 폐 정 맥에서 돌아오는 혈액을 받을 고 심으로 혈액을 운반 효율적인 심장 펌프 기능을 얻기 위해. Electrophysiological 측면에서는 atria의 중요 한 기능은 심장 리듬 조절입니다. 전기 신호 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC)와 오른쪽 아 트리 움 (RA) 사이의 교차점에 있는 부 비 동 노드에서 발생 그리고 RA와 왼쪽된 아 트리 움 (LA), 전파 atrioventricular 노드 및 그의 Purkinje 심 실 하 실시 유도 시스템입니다.
심장 리듬 장애, 부정맥, 심 방 및 심 실 그들의 기원에 따르면로 분류 됩니다. 심 방 섬유 성 연 축 (AF)은 무작위이 고 신속한 여기는 심 방의 특징, 부정맥의 가장 일반적인 지속적인된 형태 이다. 최근 유전 분석 및 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) AF와 유전자 변이 또는 monopolymorphisms,12,,34사이 협회를 보여주었다. 이러한 연구 결과 어 적어도 부분적으로 유전 원인에 연관 나타냅니다. 따라서, 그것은 유전자 조작 동물 모델을 사용 하 여 심 방에 인 자형 표현 형 상호 작용을 평가 하는 중요 한입니다. 그것은 널리는 마우스 유전자 조작에 대 한 가장 설립 된 포유동물은 허용 됩니다.
광학 매핑 기술 심장 조직의 흥분을 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 광학 매핑에 의해 murine 아 트리 움의 관찰의 상대적으로 작은 크기에 의해 방해 된다. 우리는 시간적, 공간적 고해상도 murine 아 트리 움의 상세한 평가 달성 하려고 합니다.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>SIGMA</td><td>B0560-1MG</td><td>E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>Biotium</td><td>50024</td><td>Ca indicator</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution in DMSO</td><td>Biotium</td><td>#59000</td><td>To enhance the staining with Rhod2AM</td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td><td>Wako</td><td>041-29111</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Wako</td><td>046-21981</td><td>Solvent for reagents</td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Corning</td><td>430513</td><td>For filtering Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Haparin Sodium</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>To avoid blood clots in the coronary artery</td></tr><tr><td>Air stone (&amp;phi;8 mm x 10 mm)</td><td>Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho</td><td>N/A</td><td>for aeration</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td><td>N/A</td><td>For an anesthesia</td></tr><tr><td>Programmable stimulator</td><td>Fukuda Denshi</td><td>BC-05</td><td>Fukuda Denshi kindly rented us.</td></tr><tr><td>Power Lab</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 26/8SP</td><td>To record blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Bio Amp</td><td>AD Instruments</td><td>ML132</td><td>Amprifier for electrocardiogram</td></tr><tr><td>BP Amp</td><td>AD Instruments</td><td>FE117</td><td>Amprifier for blood pressure</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>Version 7</td><td>Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram</td></tr><tr><td>Disposable BP transducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td>pressure transducer</td></tr><tr><td>1-Fr custom made electrode catheter</td><td>Unique Medical</td><td>N/A</td><td>To pace right atrium</td></tr><tr><td>Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm)</td><td>Natume Seisakujo</td><td>SP31</td><td>Put into superior vena cava to introduce electrode catheter</td></tr><tr><td>Millex-SV 5.00 &amp;mu;m</td><td>Merk Millipore</td><td>SLSV025LS</td><td>To filter the circulating Tyrode</td></tr><tr><td>24-gauge indwelling needle</td><td>TERUMO</td><td>SR-FS2419</td><td>Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber</td></tr><tr><td>21-gauge needle</td><td>TERUMO</td><td>SN-2170</td><td>We cut the tip of needle and blunted it by filing</td></tr><tr><td>25-guage needle</td><td>TERUMO</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>PVC tube</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET0525</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>TERUMO</td><td>TS-TL2K</td><td>for Langendorff&#039;s perfusion circuit</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>As one</td><td>3-1491-01</td><td></td></tr><tr><td>Custum made heating glass coil</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Custum made warming glass chamber</td><td>Motohashi Rika</td><td>N/A</td><td>to keep temperature of perfusion solution</td></tr><tr><td>Constant temperature circulating device</td><td>Lauda</td><td>E100</td><td>connected to heating coil and warming chamber</td></tr><tr><td>Cover glass (25 mm &amp;times; 60 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C025601</td><td>Put on the atria to flatten the recording area</td></tr><tr><td>Perista pump</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211</td><td>peristaltic pump</td></tr><tr><td>Stemi DV4</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope</td></tr><tr><td>MiCAM ULTIMA-L2</td><td>Brainvision Inc.</td><td>UL-L2</td><td>Optical mapping System</td></tr><tr><td>BV_Ana Software</td><td>Brainvision Inc.</td><td>BV_Ana</td><td>Data Analysis Software</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>Brainvision Inc.</td><td>THT-ZS</td><td>Epi-Illumination Unit</td></tr><tr><td>LED Light Source</td><td>Brainvision Inc.</td><td>LEX2-G</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 560nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM560</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Excitation Filter 520/35nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Projection lens Plan S 1.0X</td><td>Carl Zeiss</td><td>435200-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Focus Drive</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens Revolver</td><td>Carl Zeiss</td><td>435302-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Manual Focus Column</td><td>Carl Zeiss</td><td>435400-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope Base</td><td>Carl Zeiss</td><td>435430-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Straight Light Guide</td><td>MORITEX Corporation</td><td>MSG10-2200S</td><td>Epi-Illuminatinon</td></tr><tr><td>Condenser Lens</td><td>MORITEX Corporation</td><td>ML-50</td><td></td></tr><tr><td>PLANAPO 5.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447243</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.0X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447157</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>PLANAPO 1.6X</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447050</td><td>Objective Lens</td></tr><tr><td>Beam-Splitter</td><td>Brainvision Inc.</td><td>FLSP-2</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mirror 665nm</td><td>Brainvision Inc.</td><td>DM665</td><td>Beam-Splitter</td></tr><tr><td>Emission Filter 572/28nm</td><td>Edmund Optics</td><td>#84-100</td><td>Rhod2-AM</td></tr><tr><td>Emission Filter 697/75nm</td><td>Semrock, Inc.</td><td>FF01-697/75-25</td><td>RH237 and Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>aluminum foil</td><td>Toyo alumi</td><td>0020</td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping

최근 게놈 넓은 협회 연구 결과 심 방 섬유 성 연 축 (AF)를 대상으로 유전자는 atria에 electrophysiological 표현 형 사이 강한 협회를 표시 했습니다. 그 우리 AF의 메커니즘을 명료 하 게 하는 유전으로 설계 된 마우스 모델을 활용 하는 것을 권장 합니다. 그러나, 그들의 작은 크기로 인해 murine atria에 electrophysiological 속성을 평가 하기 어렵습니다. 이 프로토콜 electrophysiological atria Langendorff 끼얹는다 murine 마음에 높은 시간적, 공간적 해상도 광학 매핑 시스템을 사용 하 여 평가 설명 합니다. 광학 매핑 시스템 듀얼 고속 보완 금속 산화물 반도체 카메라와 고배율 렌즈, 전압에 민감한 염료 및 캘리포니아2 + 표시기의 형광을 검출 하기 위하여 조립 된다. Murine atria의 평가에 초점, 광학 매핑 2 m m × 2 m m 또는 10 m m x 10 m m, 100 × 100 해상도 (20 µ m/픽셀 또는 100 µ m/픽셀)와 10 khz (0.1 ms) 최대 샘플링 속도의 영역으로 수행 됩니다. 1 프랑스 크기 quadripolar 전극 카 테 터를 서 성 아 트리 움에 기계적 손상을 피하 뛰어난 베 나 정 맥을 통해 오른쪽 아 트리 움으로 배치 되 고는 카 테 테 르 통해 전달 자극 성. 일정 성 등 프로그램 자극 electrophysiological 연구 수행, 서 성, 그리고 트리플 extrastimuli 성 파열. 자연 또는 리듬 성, 광학 매핑 활동 전위 기간, 활성화 지도, 전도 속도, 및 캘리포니아2 + 과도 오른쪽과 왼쪽 atria에 개별적으로 기록. 또한, 프로그램 된 자극은 심 방 tachyarrhythmias의 inducibility를 결정합니다. 정확한 정품 인증 매핑 유도 atrial tachyarrhythmia 동안 안마당에서 여기의 전파를 식별 하기 위해 수행 됩니다. 특수 설정 광학 매핑 murine 병 적인 모델에서 안마당의 철저 한 electrophysiological 평가 수 있습니다.

광학 매핑 실험 그림 1a와 같이 장치를 사용 하 여 수행 됩니다. 광학 시스템의 스키마는 그림 1b에서 나와 있습니다. 시스템 막 잠재력 및 캘리포니아2 + 안마당에 과도의 고해상도 분석을 제공합니다.
그림 1 c 와 d와 같이, 고립 된 마음 온도 제어 챔버에 배치 됩니다. 1 프랑스 크기 전극 카 테 터 삽입 SVC, PE 튜브를 통해 RA에 배치 되 고 다른 내재 PE 관을 심장 챔버에 과도 한 압력을 피하기 위해 LV 꼭대기에서 LV 구멍에 삽입 됩니다. 동시 ECG 기록에 대 한 음극 (ECG 리드 [-]) cannulation 바늘에 연결 하 고 양극 (ECG 리드 [+]) 심 실 정점에 삽입 핀 전극에 연결 합니다. 이 어셈블리의 기능에 심 방에 기계적 손상을 방지 하는.
막 전압의 평가 대 한 형광 디-4-ANEPPS를 사용 하 여 최대 10000 프레임/s의 샘플링 속도 (그림 2)와 함께 기록 됩니다. 활성화 지도 라스에서 배달 일정 성 하는 동안 얻은 고급 매핑 작은 murine atria에 상세한 전도 패턴의 분석을 수 있습니다.
그림 3 에서는 막 전압 및 캘리포니아2 + 는 라스에서 일정 성 중 RH237 및 Rhod2AM를 사용 하 여 LA에 과도의 대표적인 흔적 우리는 매핑 현재 설정을 Rhod2AM 신호의 충분 한 신호/잡음 비율을 얻기 위해 1000 프레임/s의 샘플링 속도 줄일. 그러나, 시스템 활동 전위 및 캘리포니아2 + 과도 관계를 분석 하기 위한 충분 한 품질을 제공 합니다.
우리는 다음 병 적인 상태에서 마우스를 사용 하 여 프로그램 된 자극 atrial tachyarrhythmia의 유도 수행 합니다. 그림 4 는 유도의 광학 기록 전시 murine 중앙홀에 AT 디-4-ANEPPS로 얼룩진. 마우스는 압력 과부하에 적용할 안마당 10 일전 실험6가로 대동맥 수축 절차를 거칩니다. 우리는 트리플 extrastimuli (120/100/100/80), 서 성 여 AT를 유발 하 고 재진입 회로의 전파를 관찰.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig1.jpg"> 그림 1입니다. 광학 매핑 시스템. a. 전기 생리학/광학 매핑 시스템의 일반 어셈블리입니다. b. 회로도 광학 매핑 시스템의 구성: 파란색 화살표는 광원에 의해 생성 된 여기 빛 나타냅니다. 포대와 대물 렌즈를 교환할 수 있습니다. 얼룩진된 마음에서 내보낸된 빛 카메라 1 카메라 2 사이 분할 됩니다. 막 전압에 대 한 긴 파장 신호를 탐지 하는 카메라 1 고 카메라 2 Ca2 + 과도 대 한 대역 통과 필터 580 ± 20 nm의 파장을 기록 한다. 절차 동안, ECG 및 관류 압력은 지속적으로 기록 하 고 ECG 신호는 또한 동시에 레코딩 소프트웨어 광학 지도에 가져올. c. 준비의 고립 된 마음: 마음은 관류에 대 한 오름차순 대동맥을 통해 무딘 바늘 cannulated. 동시 심전도 기록에 대 한 음극 cannulation 바늘에 연결 하 고 핀 전극으로 양극 심 실 정점에 삽입 됩니다. d. Cannulation 튜브와 전극: 심장 관류 (cannulation 바늘)에 대 한 21-게이지 무딘 바늘 cannulated. 전극 (전극)을 자극 하는 1-프랑스 크기 뛰어난 베 나 정 맥에 삽입 하는 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 오른쪽 아 트리 움에 배치 됩니다. 유리 챔버는 챔버의 캐비티에 순환 온수 물으로 37 ˚C에 예 열. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig2.jpg"> 그림 2입니다. 안마당에서 활성화 지도. 5 X 렌즈, 및 b. 앞쪽 보기 a. 대표적인 활성화 지도 1.6 X 객관적 렌즈 후부 보기에서 (왼쪽 패널) 격리 된 마음과 아 트리 움의 회로도 (오른쪽 패널) 활성화 지도 왼쪽된 아 트리 움의 디-4-ANEPPS 10000 프레임/s에서 얼룩을 얻을. 녹음은 오른쪽 아 트리 움에 배치 하는 자극 전극과 일정 속도에서 수행 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig3.jpg"> 그림 3입니다. 활동 전위 및 좌 심에서 Ca2 + 과도 듀얼 녹화. a. 격리 된 심장의 도식. b. Ca2 + 과도 막 전압 (Vm) 및 Rhod2AM RH237를 사용 하 여 왼쪽된 안마당에서 형광의 강도의 대표 이미지. 녹음 1000 프레임/s. c. 에서 5 배 목표 렌즈를 사용 하 여 수행 오른쪽 아 트리 움의 자극 전극으로 서 일정 기간 동안 ECG (맨 위), RH237 신호 (중간), 그리고 Rhod2AM 신호 (아래)의 동시 녹음. 검정색 화살표는 자극 스파이크, 그리고 노란색 화살표 심 실 흥분을 나타냅니다. 심 실에서 산란 효과 또한 볼 수 있습니다 (노란색 화살표) 모두 RH237 신호와 Rhod2AM 신호에. d. 는 병합 된 RH237 및 Rhod2AM 추적입니다. 활동 전위 및 과도 Ca2 + 변화 동시에 기록 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56478/56478fig4.jpg"> 그림 4입니다. 심 방 심 박 급진 동안 정품 인증 매핑. (왼쪽 패널) 격리 된 심장의 회로도 (중간 패널) 동안에 심 방 심 박 급진 (AT) 지도 활성화. AT는 오른쪽 아 트리 움에서 배달 트리플 extrastimuli 서 성에 의해 유발 되었다. (오른쪽 패널) 부 비 동 리듬 같은 마우스 마음에 동안 활성화 지도. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/56478fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 1. 디-4-ANEPPS로 얼룩을 사용 하 여 안마당에 잠재적인 막의 대표적인 영화. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_1.zip">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 2. 심 방 심 박 급진 및 부 비 동 리듬 동안 정품 인증 매핑의 대표적인 영화. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56478/Supplementary_movie_2.zip">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Medicine

9.7K 조회수.  Tokyo Medical and Dental University. 이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

연구

생체공학

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

의학

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

생물학

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

ElectroMap을 사용한 광학 매핑 데이터의 높은 처리량 분석

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

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