저자는 아 르 님 Jenett, Aljoscha Nern, 및 조언을 루빈 연구소의 다른 회원 들과 공유 되지 않은 시 약 및 confocal 이미지를 생성 하기 위한 Janelia 비행 빛 프로젝트 팀 감사 합니다. 저자 또한 원고에 의견에 대 한 갈리아 연구소의 회원을 감사합니다.

1. 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 실험에 대 한 준비 파리 참고: The MCFO 기술 소위 Flp 중재 중지 카세트 절단 (FlpOut)의 수정된 된 버전을 말합니다. 유전자 변형 MCFO 파리 열 충격 발기인 (hsp) 수행-Flp recombinase UAS 아래 다른 기자 제어. 각 기자 myristoylated (myr) 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP), 피토 프 태그의는 10 년에서의 일반적인 백본 구성 됩니다 (예., 하, 플래그 또는 V5) 삽입 되었습니다. 결과 비 형광 단백질의 이름은 &#34; 스파게티 괴물 GFPs &#34; (smGFPs) 14 다른 epitope 태그에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 감지할 수 있습니다.
<ol><li>크로스 파리 MCFO 카세트와 hsp-Flp (hsp Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5)는 적절 한 폐해 GAL4 드라이버 라인에 (재료의 표 참조) .
	<ol><li>는 hsp 이미 25 ° C에 활성화 하 고 몇 셀 재결합 한 불특정 라벨을 선도 받을 수 시스템의 시키는 피하기 위하여 18 ° C에서 십자가를 설정 합니다. F1 세대를 18 ° C에서 약 20 일을 기다립니다. 열 후 (2 단계 참조) 충격, 25 ° C ( 그림 3)에서 날아 유지.</li>
	</ol></li></ol> 2. 열 충격 참고: 삽입 사이트 따라 hsp Flp의 효율은 달라질 수 있습니다; 그리고 따라서, 최적의 열 충격 시간 최적화가. 이 프로토콜에 대 한 hsp Flp X 염색체에 삽입 된 MCFO 비행 재고 사용 되었습니다 (재료의 표 참조).
<ol><li>전송 자손 단계 1.1에서에서 십자가의 (F1 세대 파리, 3-4 일) 음식과 열을 포함 하는 새로운 유리병에 물 욕조에 37 ° C에서 그들을 충격. 
	참고: 젊은 파리 (1-2 일)는 열 충격에 매우 민감합니다. 치료로 인 한 사망률을 줄이기 위해 열 충격을 수행 하기 전에 더 많은 일 1 또는 2를 기다립니다. 사용 F1 세대의 일부 컨트롤, 열 충격 없이 파리.</li>
	<li>열 충격 동안 스트레스 유발 사망률의 속도 감소 음식으로 일반 튜브에서 파리를 유지. 여성 및 남성 별도 튜브에 넣어.</li>
	<li>전체 유리병 균질 열 충격을 보장 하기 위해 물에 젖어 있는지 확인 합니다. 5-8 분 충격 적당 한 시작 지점으로 사용 하 여 스파스 많은 GAL4 드라이버 라인; 명과 셀의 라벨에 대 한 각 드라이버 및 실험 (짧은 또는 긴 열 충격 시간이 필요할 수 있습니다)에 대 한 충격 기간을 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>열 충격 후 열 충격에서 회복 하기 위해 파리를 수 있도록 하기 위해 몇 분 동안 벤치에 가로로 튜브 하다. 
	참고: 그것은 튜브를 변경할 필요가 없습니다.</li>
	<li>25 ° C에서 파리를 유지 하 고 해 부 (3, 4 단계 참조) 그들 2 일 이상 열 충격 후 최적의 기자 식.</li>
</ol> 3. 해 부 준비 및 솔루션 <ol><li>해 부, 주 20 %paraformaldehyde (PFA)를 2 %PFA 솔루션의 20 µ L와 S2 세포 배양 매체의 180 µ L를 혼합 하 여 200 µ L PCR 튜브에 신선한 통 솔루션을 준비. 전과 해 부 동안에 얼음 통 솔루션 유지. 
	주의: PFA 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다. 
	참고: 혼합 S2 세포 배양 매체의 160 µ L 2% 솔루션 대신 4 %PFA 솔루션을 준비 하는 200 µ L PCR 튜브에 20 %paraformaldehyde (PFA)의 40 µ L.</li>
	<li>튜브 당 8-10 두뇌의 최대 유전자 당 1 개의 PCR 관을 사용 하 여 최적의 얼룩 결과.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션의 준비: 0.5% 소 혈 청 알 부 민, 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100. 
	참고: 얼룩, 1%를 포함 하는 솔루션에 따라 트라이 톤 X-100 필요할 수 있습니다. Triton X-100의 높은 농도 조직에 항 체의 침투를 증가 하 고 그것은 깊은 조직 (예: 성인 초파리 뇌의 시 냅 스 지역) 안에 얼룩 지역 필요.</li>
	<li>차단 솔루션 준비: 3% 정상 염소 혈 청, 3% 정상 당나귀 혈 청, 그리고 0.5 %PBS 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>두뇌 세척 솔루션 및 차단 솔루션의 몇 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음에 깊은 우울증 웰 스 유리 접시를 넣고 각 채우기 다음 솔루션과 잘:와 70% 에탄올, 하나 PBS, S2 세포 배양 매체와 하나 하나.</li>
</ol> 4. 성인 뇌 해 부 <ol><li>3cm는 stereomicroscope의 무대에서 요리를 해 부하 고 차가운 S2 세포 배양 매체와 그것을 채우기. 조직 해 부 절차 동안 건강 한 유지에이 매체의 모든 해 실시. 
	참고: (이미지)에서 좋은 배경 대조를 제공 하는 블랙 실리콘의 몇 밀리미터 늘어서 해 접시를 사용 하 고 해 부 동안에 집게를 보존.</li>
	<li>CO 2 원하는 유전자의 파리 anesthetize.</li>
	<li>집게, 날개에 의해 파리를 잡아와 30에 대 한 차가운 70% 에탄올에 그것을 씻어 다음 추가 30에 대 한 차가운 PBS 가진 s s.</li>
	<li>깊은 우울증 잘 S2 세포 배양으로 가득으로 즉시 전송.</li>
	<li>동일한 유전자 형의 모든 파리에 대 한 동일한 절차를 반복 하 고 해 부, 조직 유지 됩니다 때까지 차가운 S2 세포 배양 매체에서 그들을 유지. 
	참고: Anesthetize 수 수 해 부 약 30 분의 기간에 S2 세포 배양 매체에서 긴 보육 시간 파리의 수는 조직 손상 될 수 있습니다만.</li>
	<li>집게와 함께 파리를 잡아와, stereomicroscope에서 잠수함 S2 세포 배양 매체에서 비행.</li>
	<li>머리는 시체의 나머지 부분에서 분리합니다. 본문을 삭제 하 고 S2 세포 배양 매체에 빠져들 머리를 유지. 그것은 매우 중요 한 해 부의 전체 기간에 대 한 집게로 머리를 잡아입니다. 머리를 시작 하는 경우는 조직 손상 없이 검색 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>항상 적어도 하나의 집게로 머리를 잡고 한쪽 눈을 꺼내 여 해 부를 시작 합니다. 그는 집게의 끝은 바로 피하려고 망막 아래는 조직 손상 아래 다는 것을 확인 하십시오. 다른 눈에 밖으로 끌어와 두뇌가 나타날 때까지 표 피를 제거 시작.</li>
	<li>제거 모든 tracheal 조직과 뇌 주변의 표 피 조직 깨끗 한 때까지 합니다. 최적의 얼룩 결과; 뇌 주변의 모든 tracheal 조직을 제거 확인 조직 고정 하 고 얼룩이 될 준비가 됩니다.</li>
	<li>차가운 S2에 모든 해 부 머리 고정 단계 시간 위하여 PFA 솔루션으로 그들을 전송 하기 전에 배양 세포 유지.</li>
</ol> 5. 성인 두뇌 얼룩 < ol> <li>전송 P10 피 펫과 격리 된 뇌 실 온 (RT)에서 PFA 솔루션으로. 조직 손상을 방지 하려면 해 부 후 두뇌를 전송 집게를 사용 하지 마십시오. 200 µ L PCR 튜브는 nutator에 있는 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>튜브의 하단에 정착을 두뇌 허용 P200 피 펫과 오래 된 솔루션을 삭제 하기 전에 모든 단계. 발음은 조직 없이 상쾌한을 제거 하려고 합니다. 가벼운 노출에서 조직 보호.</li>
	<li>수정 2%의 200 µ L에서 두뇌 PFA S2 세포 배양 매체 1 h 또는 4% PFA 30 분. 재현성을 증가 하기 위하여 샘플 사이 동일한 고정 시간을 유지.</li>
	<li>세척 솔루션, 성인 뇌의 200 µ L에 각각 15 분의 3 (또는 이상) 세척 후 30 분에 대 한 솔루션을 차단의 200 µ L로 조직 차단. 솔루션을 차단에 더 이상 부 화 시간이 가능 하다.</li>
	<li>두뇌 두뇌 세척 솔루션 200 µ L의 총 볼륨 희석 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 품. 
	참고: 보육 시간 사용 하는 항 체의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 더 이상 외피 필요할 수 있습니다.
	<ol><li>3 MCFO 마커의 라벨에 대 한 안티와 두뇌를 품 어-하 (1: 500), 반대로 플래그 (DYKDDDDK epitope) (1: 100), 및 안티-v 5 기본 항 체.</li>
		<li>기본 직접 활용 된 항 체는 정상적인 1 차 + 2 차 조합 대신 사용할 수 (예., 안티-V5:DyLight 549 (1: 200)). 이 경우에, 2 차 항 체로 직접 활용 된 항 체 치료. 
		참고: 각 유전자 형에 대 한 컨트롤을 확인 하는 얼룩의 특이성으로 일부 머리를 유지. 1 차적인 항 체 외피를 생략 하 고 다음 단계로 직접 이동.</li>
	</ol></li> <li>성인 뇌 세척 솔루션 (단계 3.3)의 200 µ L에 3 번 1 시간을 위한 조직을 세척 하 고 보조 fluorophore-어원이 같은 말/기본 직접 활용 된 항 체 두뇌 4 솔루션을 하룻밤 세척 희석으로 그들을 품 어 ° C 또는 200 µ L의 전체 볼륨에 RT에서 4 h 참고: 적절 한 항 체의 예: AlexaFluor 488 (1: 250), 안티-V5:DyLight 549 (1: 200) 및 DyLight 647 (1: 100)-항 체를 활용 시켰다.</li>
	<li>성인 뇌 세척 솔루션, 4 ° C에서 하룻밤 또는 RT에 1-2 h는 PBS의 200 µ L에서 최종 세척 뒤의 200 µ L에 1 시간에 3 번 두뇌 세척, PBS 최종 세척 단계 Triton X-100의 모든 흔적을 제거 하 고 필요 최적의 얼룩 결과입니다. 유리 coverslips에 방지 페이드 에이전트 설치 매체에 두뇌를 탑재.</li>
</ol> 6. 이미징에 대 한 두뇌의 장착가 위를 사용 하 여 적절 한 크기를 <ol>이미징은 트림 <li>스페이서. 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 두 개의 유리 coverslips 사이 견본 및 이미징 스페이서 샌드위치. 
	참고: 이미징 스페이서는 얇은 (0.12 m m 두께) 접착제 스페이서 껍질 및 유리 coverslips 또는 현미경 슬라이드에 충실 하는 압축 하지 않고 표본의 장착 수.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 1 개의 표면에서 접착제 라이너를 제거 하 고 스페이서, 접착 면이 아래로, 유리 coverslip (22 m m x 60 m m)의 표면에 적용. 새로운 유리 coverslip 장착 매체의 10 µ L 적용.</li>
	<li>P10와 피 펫, 200 µ L 튜브에서 설치 매체의 드롭 옆 coverslip 두뇌를 전송. 조직, 함께 솔루션에 두뇌를 유지 하기 위해 일부 PBS 전송.</li>
	<li>P10와 피 펫, PBS에서 PBS의 양을 제한 하는 설치 매체의 드롭 두뇌를 이동 합니다. 설치 매체에 있는 표본 이미징 스페이서와 coverslip에 전송 합니다. 충분 한 설치 미디어를 사용 하 여 표본을 커버.</li>
	<li>는 스페이서의 상단에서 다른 접착제 라이너를 제거 하 고는 표본 위에 유리 coverslip 추가. 집게의 끝에와 함께 부드러운 압력 밀봉 접착제 영역에 적용 됩니다. 이미지 탑재 된 조직을 즉시 또는 나중에 분석-20 ° C에서 슬라이드 저장.</li>
</ol> 7. 이미지 수집 <ol><li>confocal 형광 이미지 40 X confocal 현미경을 사용 하 여 취득 스택 (나 = 1.2, 물 침수) 목표 또는 63 X (NA = 1.4, 기름 침수) 목표 (픽셀 크기 xy 평면;에서 1024 x 1024 = 두 개의 confocal 섹션 사이의 거리 = 0.5 µ m). 감지기 이득 및 오프셋 아무 포화 픽셀 및 0 픽셀 값은 이미지;에 존재 하는 방식으로 각 채널에서을 조정합니다 이 정보 손실 방지 및 검출기의 전체 동적 범위를 사용 하 여 보장. 
	참고: 지금까지 3D 영상 시간이 소요 때문에에 측정 다른 위치에서 동시에 여러 개의 샘플을 검색 하 여 자동화할 수 있습니다. 물 침수 목적으로 증발을 피하기 위해, 사용 하 여 특별 한 기름 침수 매체 굴절률 n = 1.33.</li>
	<li>Confocal 스택 최대 밀도 프로젝션, 채널 색조 및 밝기 조정에 변화를 처리 하 고 모든 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 대조 (재료의 표 참조).</li>
</ol>

<ol>
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작가의 아무도 경쟁 또는 충돌 관심 있다.

이 프로토콜 높은 해상도에 관심의 조직 내에서 다른 세포 유형의 형태를 연구 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다. MCFO 기술을 다른 epitope 태그로 여러 기자 색 확률적 라벨 (그림 2)에 대 한 조합에 사용 됩니다. Brainbow/Flybow15,,1617등 다른 방법과 마찬가지로 MCFO 증가 마커 coexpression 통해 레이블 ...

명과, 신경 계통 (NS), 비 신경 세포 인구 했다 긴 신경 세포에 대 한 정적 프레임 워크를 제공 하 고 따라서 자세히 공부 하지 했다. 그러나, 인간, 명과 셀 NS (~ 90%)의 대다수를 구성 하 고 이다, oligodendrocytes, microglia 및 Schwann 세포를 포함 하 여 일부의 범주에 빠지다. 초파리에서 명과 NS에 있는 세포의 약 10%를 구성 합니다. 글에, 그들의 형태학과 기능 척추 동물1,2에서 발견 된 현저 하 게 유사 하다. 그들의 형태학 혈액-뇌 장벽 (BBB) 형성 epithelia, ensheathing, 사이토와 같은 셀을 포함 합니다.
다음 주 구조 이루어져 초파리 중앙 신경 시스템 (CNS): 신경 셀 시체;를 포함 하는 피 질 영역 neuropils 시 냅 스 연결 항구 다른 neuropiles; 연결 하는 크고 작은 축 삭 책자 CNS는 (그림 1)과 감각 기관과 근육을 연결 하는 주변 신경 명과 이러한 모든 해 부 구조와 관련 된 찾을 수 있습니다: 피 질 명과 (CG) 대뇌 피 질의 영역, 사이토 처럼 명과 (ALG) 및 neuropile 지역, ensheathing 명과 ensheathing 명과 (EG)에 또한 중앙 축 삭 책자와 주변 기기 연결 신경 (EGN), 그리고 마지막으로, 두 개의 시트 같은 명과, perineurial 명과 (PG) subperineurial (SPG)는 함께 전체 NS (그림 2)를 포함 하는 연속 층을 형성 하 고.
이전 연구는 명과 NS;의 개발에 중요 한 역할을 그들은 체계적으로 순환 인슐린 같은 펩 티 드에 반응 하 여 신경 세포 수를 모니터링 하 고 사이토 신경 젖 셔틀 같은 신경에 영양 지원을 제공, 먹어서3,4 여 죽어가는 신경 세포를 제거 , 5 , 6. 성숙한 NS에서 명과 BBB 유지, 신경 전달 물질을 차지 하 고 이온 항상성 유지, NS, 주요 면역 세포 대 식 세포 수 없기 때문에 BBB, 위반 시 냅 스 활동으로 동물 행동6 조절 역할 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
다른 폐해 하위 전문된 기능을 수행 하는 여부는 중요 한 미결 문제에 남아 있다. 그러나, 명과, 성인, 특히에 대 한 체계적인 게놈 넓은 분석 그들의 조작에 대 한 적절 한 유전 도구의 부족에 의해 방해 되어 있다. 여기, 셀 셰이프 셀을 복잡 한 상호 작용을 공부를 효율적이 고 쉬운 특성을 허용 하는 메서드가 제공 됩니다. 이 기술은 성인 초파리 뇌의 다른 폐해의 형태학 특성을 적용 하지만, 특정 GAL4 드라이버 사용에 따라 그것은 신경12,13 공부에 적응 수 있습니다. , intermingling 셀의 원리에 어떤 종류 어떤 발달 단계에 있는 조직.

<table><tbody><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>Glass dissection dish</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Glass dissection plates</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>home made with charcoal</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 cell culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Primary antibody, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Secondary antibody, dilution 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Secondary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contact company for ordering</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for automated scanning</td></tr></tbody></table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

셀 다른 형태학 및 복잡 한 해 부 관계를 표시합니다. 그들의 이웃과 셀 어떻게 상호 작용 합니까? 상호 작용 세포 유형 사이 또는 지정 된 형식 내에서 심지어 다릅니까? 그들은 어떤 종류의 공간 규칙을 따라 합니까? 이러한 근본적인 질문에 비보에 대 한 답변 고해상도 단일 셀 라벨에 대 한 도구의 부족으로 지금까지 방해 되어 있다. 여기, 상세한 프로토콜 멀티 컬러 FlpOut (MCFO) 기법으로 단일 세포를 대상으로 제공 됩니다. 이 방법은 3 다르게 태그 기자 (HA, 플래그 및 V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관을 사용 합니다. 열 충격 펄스 유도 열 충격 유도 Flp recombinase, 개별 셀에 FRT-정지-FRT 카세트를 임의로 제거 하 식: 식 또한 GAL4 드라이버를 표현 하는 셀에만 발생 합니다. 이것은 높은 해상도에서 개별 셀 형태학의 시각화 수 있는 특정된 셀 종류의 서로 다른 색된 셀의 배열. 예를 들어, MCFO 기술 초파리 두뇌의 다른 폐해의 형태학을 시각화 하기 위해 특정 glial GAL4 드라이버와 결합할 수 있습니다.

이 섹션에서는 초파리 두뇌의 MCFO 기술을 사용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다. 그림 3 방법의 회로도 보여준다. 3 명의 다르게 막 태그 기자 (myr-smGFP-하, myr-smGFP-플래그 myr-smGFP-V5) UAS 통제 transcriptional 터미네이터 2 개의 FRT 사이트 (FRT-정지-FRT)에 의해 형벌에 의해 자동 보관 됩니다. 열 충격 펄스 유도 임의로 개별 셀?...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K 조회수.  Ludwig-Maximilians-University Munich. 셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

연구

신경과학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

발생학

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

생물학

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

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