사진과 함께 도움을 주신 샘플 Trace와 Tin Ki Tsang의 도움으로 Ye Zhang에게 감사드립니다. 이 작품은 Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award와 C.-YS 및 NIH 교부금 (R01DC009597 및 R01DK092640)에 대한 NIH 교부금 (R01DC015519)에 의해 JWW에 지원되었습니다.

1. at4 녹음을위한 하드웨어 준비 <ol><li> 피펫 끌어 당기 도구를 사용하여 알루미 노 규산염 유리 모 세관 (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm)으로 전극을 준비하십시오. 비행의 clypeus에 삽입을 용이하게하기 위해 미세한 포셉 한 쌍으로 참조 전극의 끝을 약간 뭉게하십시오 ( 즉 , 머리 부분 앞쪽의 둥근 접시). 참고 : 7 일된 WT 남성 (베를린)이이 연구에 사용되었습니다. 두 전극의 전해액으로 AHL 식염수 용액 14 를 사용하십시오. </li><li> 염화나트륨 6.312 g,의 KCl 0.373 g,의 NaHCO3 0.337 g에 증류수 900 mL를 혼합하여 AHL 1 L을 준비에 NaH 2 PO 4, 트레할로스 ּ 2 H 2 O의 1.892 g의 0.1120 g, 수 크로즈 3.423 g, 1.192 g의 HEPES 및 1M의 MgCl 2 mL의 8.2. 증류수를 사용하여 1L까지 총 부피를 가져온다. 1N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 가져 와서 용액을 멸균한다.진공 구동 필터 시스템. 장기간 보관하려면 AHL 분취 량을 4 ° C로 유지하십시오. 참고 : palmitoleic acid의 일관된 전달은 카트리지 간의 균일성에 달려 있습니다. 각 카트리지가 재현 가능한 방식으로 조립되는 것이 중요합니다. </li><li> 면도날을 사용하여 200 μL 피펫 팁 끝에서 0.9 cm를 제거하여 4.1 cm 크기의 첫 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 그림 1A에 설명 된 치수를 참조하십시오. 다른 200 μL 피펫 팁을 사용하여 팁과베이스에서 각각 1.7 cm와 1.5 cm를 제거하여 1.8 cm ( 그림 1A ) 인 두 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 자를 사용하여 재현성을 보장하십시오. </li><li> 여과지에서 디스크를 자르려면 1/8 &quot;구멍 펀치를 사용하십시오. </li><li> 집게를 사용하여 두 번째 카트리지 섹션의 끝 부분에 여과지 디스크를 놓습니다. 공기가 통과 할 수있는 카트리지 팁에 구멍이 있는지 육안으로 확인하십시오. </li><li> 그림 1A 와 같이 첫 번째 및 두 번째 카트리지 섹션을 함께 부착하십시오. 두 번째 카트리지 섹션을 아래쪽으로 기울여 사분면에서의 조준을 용이하게하십시오 ( 그림 1B ). </li><li> micromanipulator에 장착되어있는 악취 전달 튜브와 카트리지를 연결하십시오. 참고 :이 디자인은 교환을 용이하게하기 위해 카트리지를 바깥쪽으로 회전시킬 수 있습니다 ( 그림 1C ). </li><li> 하나의 질량 제어기에서 일정한 가습 공기 흐름을 2 L / min으로 설정하고 다른 질량 제어기에서 냄새 물질 흐름을 500 mL / min으로 흐르게하십시오. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 ( 재료 표 참조) 500 ms 냄새 퍼프를 관리하는 절차를 프로그래밍하십시오. </li></ol> 2. 배달을위한 팔 미트 톨 산성 악취 용액의 제조 참고 : Or47b ORN은 cis- 와 trans -palmitoleic acid 모두에 반응합니다. palmitoleic acid가 R에서 불안정하기 때문에T는 -20 ° C에서 저장되며 개봉시 한 달 이내에 사용됩니다. 에탄올은 팔미 톨 렌산의 용매로 사용됩니다. <ol><li> 소용돌이 믹서를 사용하여 10 mL의 시스 또는 트랜스 팔미 톨레산 저장 액 또는 희석액을 1.7 mL 미세 튜브에서 10 배 연속 희석 용 100 μL의 에탄올 90 μL와 완전히 혼합하십시오. 매일 실험 및 사용하기 전에 신선한 palmitoleic 산 희석물을 준비합니다. 참고 : 에탄올에 녹지 않는 냄새 물질의 경우 다른 유형의 유기 용제와 함께 냄새 희석액을 준비 할 때 유리 병을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> P10 마이크로 피펫을 사용하여 원하는 희석액의 cis -palmitoleic acid 용액 5 μL를 해당 카트리지의 여과지에 바릅니다. 참고 : 가장 높은 용량 (10 -1 )에는 450 μg의 화합물이 들어 있습니다. trans -palmitoleic acid 용액의 경우, 4.5μL을 대신 사용하여 가장 높은 용량 (10 -1 )에 450μg의 t그는 화합물. </li><li> 용매를 완전히 증발 시키려면 palmitoleic acid 카트리지를 RT와 7.59 mmHg에서 1 시간 동안 진공 데시 케이 터에 넣으십시오. 참고 : 카트리지는 RT에서 최대 4 시간 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 생체 전기 생리 학적 녹음을위한 at4 Sensilla에 즉시 접근하기위한 Drosophila 의 준비 참고 : WT 파리 (베를린)는 표준 번식 매질에서 25 ° C로 12:12의 명암주기에서 양육됩니다. eclosion시, 파리는 10 개의 그룹으로 성별로 구분되며, 따라서 그룹은 7d 시대까지 그룹으로 수용됩니다. 암컷과 수컷 모두에서 or47b ORN이 팔미 톨 레산에 반응한다. 단순화를 위해, 현재의 연구에서 수컷 파리 만 시험 하였다. <ol><li> 플라이 준비 슬라이드 조립 : 유리 슬라이드에서 유리 슬라이드에 ~ 3 °의 각을 형성하는 소량의 모델링 점토에 유리 커버 슬립 (18 x 18mm 2 )을 놓습니다. 내부 E에 양면 테이프 놓기coverslip의 dge와 바로 아래 슬라이드의 영역에. 매일 녹음 할 때마다 새 테이프로 교체하십시오 ( 그림 2A ). </li><li> 플라이 aspirator 15 를 사용하여 튜빙에서 관심있는 파리를 수집 한 다음 튜빙 끝에 200 μL 피펫 팁을 장착하십시오. 동시에 피펫 팁의 끝 부분에 파리를 밀어 튜브에 공기를 불어 넣은 채로 튜브를 앞으로 내리십시오. 면도날을 사용하여 파리의 몸 바로 아래와 2 개의 머리 길이를 날아서 자릅니다. </li><li> 안테나와 clypeus가 노출 될 때까지 파리를 밀어 올리면서 모델링 점토로 피펫 팁의 바닥을 감싸줍니다 ( 그림 2B ). 파리를 죽이는 것을 피하려면 파리와 복부가 노출되지 않도록 찰흙을 충분히 넣으십시오. 파리의 복부가 부서지는 것을 막을 수 있습니다. 또한 점토를 천천히 부드럽게 넣어 급격한 수축을 예방하십시오. 안테나가 있는지 확인하여 파리가 살아 있는지 확인하십시오.또는 코 움직임. </li><li> 플라이가 들어있는 피펫 팁을 움직이려면 집게를 사용하십시오. clypeus가 관찰자의 오른쪽을 향하도록 머리를 배향하십시오. 안테나의 측면이 테이프로 덮여 coverslip 표면 ( 그림 2B )에 대한 거짓말 때까지 미세한 집게를 사용하여 coverslip 함께 준비를 조정합니다. </li><li> 이동을 방지하기 위해 안테나를 양면 테이프에 고정시키는 고정대 위에 고정 막대를 놓습니다 ( 그림 2B ). 참고 : 지주 막대는 피펫 풀러가있는 붕 규산염 유리 모세관에서 끌어 당겨 모델링 점토로 고정됩니다 ( 그림 2A ). </li><li> 리그의 스테이지에 prep을 놓으십시오 ( 그림 2C ). 현미경을 사용하여, trichoids는 안테나의 세 번째 세그먼트의 말초 측면 가장자리를 따라 볼 수 있는지 확인합니다. 참고 : 이상적으로, sensilla는 배경에 대해 명확하게 윤곽을 그리게되어,<html> 식별 및 녹음을 용이하게합니다 ( 그림 3 ). 이 준비에서 접근 가능한 trichoid sensilla의 대부분은 at4 유형입니다. </li><li> 이전의 2 , 15에서 설명한 것처럼 prep에서 약 2 cm 떨어진 곳에서 별도의 공기 공급 튜브를 통해 일정한 습도의 공기 흐름 (2 L / min)으로 유지하십시오 ( 그림 4 ). </li></ol> 4. Palmitoleic Acid에 대한 at4 Trichoids의 or47b ORN으로부터의 at4 Sensillum 활성의 기록 <ol><li> 참조 전극을 clypeus에 삽입하십시오 ( 그림 3A ). 조직 손상을 피하려면 표피 아래의 체액과 접촉 할 수있는 표면 바로 아래에 전극을 신속하고 부드럽게 움직여야합니다. </li><li> 타겟 전극과 동일한 평면으로 들어가기까지 기록 전극을 천천히 낮추십시오 (= &quot;xfig&quot;&gt; 그림 3B). 50X 대물 렌즈 아래에서 기록하십시오. 참고 : 거친 삼각형 큐티클은 기록 전극을 감지기베이스에 삽입 할 필요가 있습니다. 넓은 영역은 전극이 빗나가게 할 가능성을 줄여주는 더 큰 타겟을 제공합니다 ( 그림 3B , 삽입). </li><li> sensillum에 악취 자극을 가하기 전에 다음 선택 기준을 준수하십시오. 이러한 기준을 충족시키지 못하는 모든 삼각근은 거부되어야하고 다른 감각제가 대신 선택되어야합니다. <ol><li> 높은 신호대 잡음비를 관찰하십시오 (예를 들어 그림 3C 참조). </li><li> at4A 및 at4C 뉴런에서 확인할 수있는 스파이크를 관찰합니다 ( 그림 3C ). 참고 : at4B 스파이크 진폭은 at4A 10 과 매우 유사하게 나타나 냄새 자극없이 쉽게 식별 할 수 없습니다. </li><li> at4A 뉴런의 기본 발사 속도는 다음과 같습니다.20 Hz 부근 또는 미만. 참고 :이 기준은 뉴런의 기본 발사 속도가 기본 ORNs 2 보다 높기 때문에 at4A에만 해당됩니다. 훨씬 더 높은 기저 발화는 전극이 삽입되는 동안 뉴런이 손상되었을 수 있음을 나타냅니다. </li></ol></li><li> 카트리지를 냄새 전달 튜브에 연결하십시오. 솔벤트 컨트롤부터 시작하여 낮은 농도에서 높은 농도까지 냄새 제거제를 사용하십시오. 준비 작업의 머리에 카트리지를 정면으로 향하게하면서 micromanipulator를 사용하여 카트리지를 준비쪽으로 움직이십시오. 시각적으로 카트리지가 몇 밀리미터 떨어진 곳에서 안테나에 직접 향하게되었는지 확인하십시오 ( 그림 4 ). 참고 : 목표는 카트리지 입구를 안테나에 직접 놓고 대상 조직 가까이에 배치하는 것입니다. </li><li> 냄새 제거제 카트리지가 기록 전극에서 오른쪽으로 1 ~ 2 mm 분리되고 플라이 프리p를 약 1 mm 아래로 밉니다. 참고 : 여기에 설명 된 설정에서 냄새 제거 장치 카트리지는 기록 전극, 참조 전극 및 플라이 - 준비 슬라이드 ( 그림 4 )와 밀접하게 경계를 이루고 있습니다. 참고 : 카트리지와 기록 / 참조 전극 사이의 거리에주의하십시오. 약 4mm의 거리를 권장합니다 1 . 의도하지 않은 접촉으로 인해 신호가 끊어 지거나 기록 전극의 끝이 끊어져 현재 뉴런이 손상되거나 추가 기록이 복잡해질 수 있습니다. 참고 : 카트리지와 플라이 - 준비 슬라이드를 분리하는 거리를 고려하십시오. 커버 슬립을 만지면 녹음 전극이 튕겨져 녹음이 중단 될 수 있습니다. </li><li> 레코딩을 시작하려면 데이터 수집 소프트웨어에서 &quot;Record&quot;를 누릅니다. 참고 : 10 초 녹음 할 때마다 1.9 단계에서 설명한대로 단일 500 ms 악취 펄스가 안테나로 직접 전달됩니다. </li><li> 냄새 제거제 도포 후,다음으로 높은 농도의 카트리지로 교체하기 전에 조심스럽게 카트리지를 집어 넣으십시오. 전체 용량 범위가 확보 될 때까지 계속하십시오. 참고 : 적응의 영향을 피하기 위해 각 비행에서 하나의 Or47b ORN 만 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 하루 동안 녹음을 마치면 녹음 전극을 증류수로 완전히 헹구십시오. </li><li> 상업적으로 이용 가능한 오프라인 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯합니다. </li></ol>

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여기에서 우리는 or47b ORNs의 palmitoleic acid에 대한 반응을 강력하게 유도하고 기록 할 수있는 절차를 설명했다. 우리는 불충분 한 페로몬 냄새 전달 문제를 해결하기 위해 전통적인 장거리 냄새 전달 방법 2 , 7 , 10 을 변경했습니다. 우리는 냄새 제거제 카트리지를 통해 화합물을 전달함으로써 냄새 제거제의 낮은 휘발성 문제를 ...

<html> Drosophila ORN은 에스테르, 알콜, 케톤, 락톤, 알데히드, 테르펜, 유기산, 아민, 황 화합물, 헤테로 고리 및 방향족 화합물을 포함하여 광범위한 탄소 사슬 길이와 다양한 작용기를 가진 방대한 냄새 물질에 반응합니다 2 , 3 . 그들의 물리 화학적 특성에있어서 다양한 냄새 물질은 화합물의 증기압에 의해 현저하게 상이한 휘발성을 나타낼 수있다. 특히, Drosophila melanogaster에 대한 생물학적으로 관련된 냄새 물질은 그들의 휘발성이 엄청나게 다릅니다. 예를 들어, Ir92a ORN은 휘발성이 높은 암모니아 4 에 20 ° C에서 6,432 mmHg의 증기압으로 반응합니다. 반대로 Or67d ORNs (VA c) 남성 페로몬, CIS -vaccenyl 아세트산 5, 6에 대응 증기압은 20 ℃에서 43 mmHg로한다. ov_content &quot;&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 냄새가 운반기 공기 흐름을 통해 상대적으로 장거리 ( 즉, 수 센티미터)에 걸쳐 전달되는 기존의 냄새 전달 방법에서 특히 어려움이 있습니다. 예를 들어, 고 선량의 c VA에 대한 Or67d ORN의보고 된 반응은 ~ 40 7 -&gt; 200 spikes / s 6 범위에 해당합니다. 더욱이 전통적인 전달 방법을 이용한 c VA의 효과적이지 않은 전달은 잘못된 결과에 기인 할 가능성이 높기 때문에 c VA만으로 Or67d ORNs 8 을 활성화시키는 데 충분하지 않다는 해석으로 이어진다. 근거리 악취 전달 방법 9. 따라서 impera저 휘발성의 냄새를 효과적으로 표출 할 수있는 강력한 악취 전달 시스템을 개발하려고합니다. 최근에 우리는 Or47b ORN의 리간드로서 몇몇 긴 사슬 큐티 릭 지방산을 확인했다. 그들은 유형 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4)에 있습니다. 장쇄 지방산 냄새 물질 중 Palmitoleic acid는 Or47b ORNs 1 을 활성화시킴으로써 남성 구애를 촉진시키는 최음 제지 페로몬으로서 기능한다는 것을 발견했다. 그러나, 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 다른 연구에서, 메틸 라우 레이트가 동일한 거리 (10)로부터 제공 될 때 팔 미트 산 응답을 유발하지는 않지만 Or47b ORNs 응답을 유도하는 것으로 나타났다. VA C에 비해, 장쇄 지방산은 25 ° C 11 0.001 mmHg로는 증기압, 심지어 덜 휘발성이다. 장쇄 지방산 냄새의 본질적으로 낮은 휘발성은 안테나를 통한 효과적인 프리젠 테이션을 방해합니다.기존의 악취 전달 시스템은 위음성 결과를 설명 할 가능성이 높습니다 10 . 이러한 불일치는 저 휘발성 냄새 물질을 제시 할 때 기존의 악취 전달 시스템의 부적합 함을 강조합니다. 이것은 이전에 플라이 cuticular 냄새를 효과적으로 전달 악취 소스 및 대상 조직 (6) 사이의 근접을 요구하는 것이 도시되었다. 그들은 아마 성격 (12), (13)에 초파리에 의해 발생되는로부터의 거리를 모방, 우리는 최소한의 거리가 우리의 절차에 높은 우선 순위를 부여해야한다는 합의 동안 따라서, 완전히 생물학적 활성 페로몬의 효과를 특징입니다. 우리의 방법은 표준 전기 물리학 리그 및 기술과의 호환성을 포함하여 추가 이점을 보유합니다. 기존 장비 설치는이 프로토콜을 수용하기 위해 최소한의 수정 만 필요로하며 대부분의 SSR 단계는 사소한 조정 만 필요합니다. 이우리의 기술을 SSR 경험이있는 연구원이 쉽게 이용할 수있게합니다. 또한, 우리의 기술은 날카로운 발병 및 오프셋을 갖는 저 휘발성 냄새 물질의 제시를 허용하고, 신경 전달 반응과 자극 전달을 상관시킨다. 마지막으로, 하드웨어 레이아웃은 냄새 제거제 카트리지 간의 신속한 교환을 촉진하여 원하는 복용량 범위에서 데이터 수집을 신속하게 처리합니다. 우리는 참조 전극과 기록 전극, AHL (Adult Hemolymph-Like) 용액, 냄새 전달 카트리지 및 해당하는 감각 계의 준비를 검토합니다. 우리는 다음에 녹음을 위해 파리의 준비가 뒤따른 팔미 톨산 산 냄새 처리제의 준비에 대해 논의합니다. 우리는이 방법을 사용하여 얻은 대표 데이터를 제시하기 전에 냄새 제거제 카트리지의 위치를 ​​기록하고 더 세밀하게 조사하기 위해 삼중 모양의 감각제를 선택하는 기준을 고려합니다. 마지막으로, 우리는이 techniq의 유용한 응용을 탐구하여 결론을 내린다.ue, 몇 가지 문제가 발생했습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

곤충은 식량 구하기, 육식 동물 회피, 산란, 교미와 같이 생존에 필수적인 다양한 행동을 유도하기 위해 냄새 감각에 의존합니다. 다양한 휘발성 물질의 무수한 화학 물질이 곤충 후각 수용체 뉴런 (ORN)을 활성화시키는 천연 냄새 물질로 확인되었습니다. 그러나, 저 휘발성 냄새 물질에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 그러한 자극을 효과적으로 제공 할 수 없기 때문에 방해 받고있다. 여기서는 생체 내 Single-Sensillum Recording (SSR)을 위해 저 휘발성 취기 물질을 효과적으로 제시 할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 냄새 소스와 표적 조직 사이의 거리를 최소화함으로써이 방법은 구토 및 교미 행동에 관여하는 ORN에 대한 효과가 입증 된 자극 페로몬 인 팔미 톨 레산 (palmitoleic acid)을 포함하여 생물학적으로 현저하지만 지금까지 접근 할 수없는 냄새 물질의 적용을 허용합니다 1 .따라서 우리의 절차는 곤충 반감 및 페로몬 커뮤니케이션에 대한 연구를 위해 저 휘발성 냄새 물질을 분석하는 새로운 방법을 제시합니다.

우리의 기술은 성공적으로 palmitoleic acid의 시스 ( 그림 5B ) 이성질체 대 트랜스 ( 그림 5A )의 상대적인 효능을 결정하는 데 적용되었습니다. 우리의 대표적인 데이터는 trans -palmitoleic acid가 cis isoform과 비교했을 때 Or47b ORN에 대해보다 효과적인 리간드임을 입증합니다 ( 그림 5C ). ?...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K 조회수.  University of California San Diego.  이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다. 

비디오: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

연구

신경과학

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

생물학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

에서 전기 생리학 기록<em&gt; 초파리</em&gt; Labellar는 Sensilla 맛

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

면역학 및 감염병학

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em&gt; 초파리</em&gt; 네 사분면의 후각에

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

곤충 맛 뉴런 활동의 향상된 분석을 위한 새로운 방법

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

저자 스포트라이트: 화학수용의 발전 – 곤충 냄새 수용체에서 비코딩 RNA까지

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

염기 기록: 초파리에서 미각 뉴런의 반응을 분석하는 기법

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

에서 전기 생리 학적 기록

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곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

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의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동

메뚜기 벨 Sensilla Basiconica에 대 한 단일 Sensillum 녹음

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