저자는 그들의 전문 기술 지원; Keali 룀, 루이자 Frieß, 하이 케 멘 젤 감사 헬가 Brünner 동물 보호; 대 하 그리고 생성 및 ImageJ 소프트웨어에 대 한 광학 disector 그리드 플러그인의 배포에 대 한 Chistopher S. 병 동.

관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 또는 기관 지침에 따라 했다. 프로토콜 Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 뷔르츠부르크, 독일에서 지방 자치 단체에 의해 승인 되었다.
 1. 조직 처리 및 Immunohistochemistry <ol><li>Euthanize 쥐 CO 2 또는 어떤 다른 승인 방법.</li>
	<li>Perfuse 6 12 주 된 C56Bl/6N 남성 쥐 transcardially 10 mL의 0.1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 25 G 바늘과 주입 펌프를 사용 하 여 다음 0.1 M PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 70 mL. 
	주의: PFA는, 알레르기, 독성 및 발암 성.</li>
	<li>Bregma (그림 25, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 +0.74 m m의 영역에서 두뇌 매트릭스 슬라이서와 코로나 비행기에 쥐의 뇌를 해 부.</li>
	<li>SN를 포함 하 여 4%에서 뇌의 등 쪽 부분 침수-고정을 위한 4 ° C에서 1 d 0.1 M PBS에 PFA.</li>
	<li>Cryo-보호에 대 한 30% 자당/0.1 mol PBS 솔루션 PFA 교환 하 고 다른 2 d 4에서 품 어 ° c.</li>
	<li>최적의 절삭 온도 (10 월)는 cryomold로 뇌의 등 쪽 부분 가득 넣어 컴파운드와 천천히 액체 드라이 아이스 냉각 isopentane는 조직의 동결. 
	주의: 드라이 아이스는 매우 추운 (-78 ° C); 드라이 아이스와 함께 작업 하면서, 장갑 등 개인 보호 장비 (PPE)를 사용 합니다. 드라이 아이스 증발 CO 2; 따라서, 연기 후드 작동.</li>
	<li>순차적으로 30 µ m cryo-섹션 코로나 비행기에서 잘라내어 Bregma (그림 51 Paxinos, 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14)에서 2.46 m m에서 시작 및 끝 Bregma에서 4.04 m m 섹션을 수집 (그림 64, Paxinos 및 프랭클린 마우스 뇌 아틀라스 14).</li>
	<li>는 Cryoprotectant (30% 글리세롤, 30 %ethoxyethanol, 및 40 %PBS)-20 ° c.에로 채워진 튜브에 4 개의 시리즈를 저장 단면화 절차 동안 표시 오른쪽 반구 brainstem의 상위 영역에 작은 구멍을 puncturing.</li>
	<li>Immunohistochemical 얼룩, 선택 마우스 당 섹션의 한 시리즈. 10% 정상 염소 혈 청 (0.1 mol 통에 PBS에에서 NGS)/2% BSA/0.5% 세제 1 시간에 대 한 preincubate 부동성 섹션. 섹션 4에서 하룻밤 2% NGS/2% BSA/0.5% 세제 0.1 mol PBS에에서 희석 토끼 반대로 마우스 티로신 hydroxylase (TH, 1:1,000 희석) 항 체로 품 어 ° c.</li>
	토끼에 대 한 항 체 <li>적용 보조 Igs (1: 100 희석) 실 온에서 2 h 뒤 avidin/비오 틴 시 약 (1: 100 희석). 품 어와 3, 3-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 H 2 O 2와 얼룩. 코팅된 개체 슬라이드에 얼룩 후 섹션을 탑재. 
	참고: 회 + dopaminergic SN 뉴런 그림 1a에 표시 됩니다. 얼룩 한 시리즈, 여 SN 동위 compacta (SNpc) 및 reticulata, 꼬리 부분에는 rostral에서 연장 13 SN 섹션의 평균은 동물 ( 그림 1b) 당 물 들 다. 섹션 120 µ m (1/4 시리즈)으로 구분 됩니다 ( 그림 1c). 
	주의: 소량은 의심 되는 발암 물질 이다. 그것은 접촉 및 흡입 독성입니다. 소량 작업 시 보호구를 사용.</li>
</ol> 2. 이미지의 수집 <li>캡처 일 immunohistochemically <ol>디지털 현미경에 결합 된 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 SN 섹션 스테인드. 1 시리즈의 각 섹션을 별도로 분석.</li>
	<li>이미징 소프트웨어의 스캔 슬라이드 옵션을 사용합니다. 높은-품질의 이미지 (그림 2)에 대 한 TIFF 형식으로 저장. 
	참고: 이미지 해상도 cm 당 312 픽셀.</li>
	<li>기자 &#34; 취득 &#34; 수집 창 (그림 2a) 여.</li>
	<li>설정 합니다 binning &#34; 2 &#34; 회색조 이미지. 
	참고: 컬러 사진 대신 회색조 이미지의 인수 최종 스택 이미지 파일 (그림 2a)의 크기를 줄입니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 라이브 쇼 &#34; 섹션의 라이브 이미지를 보여주는 새 창을 열려면 수집 창에서 (그림 2 a와 b).</li>
	<li>클릭 &#34; 단계 &#34; 수집 창에서. 선택 &#34; 슬라이드 스캔 &#34; 드롭다운 메뉴 및 확인란 (그림 2c). 
	참고: 그러면 수집 및 z-비행기, 13 μ의 전체 범위에서 1 µ m의 연속 이미지 사이의 거리를 사용 하 여 스택 이미지의 수집 뿐만 아니라 x, y 평면에 고도의 확대 SN 이미지 (630 X 배율)의 맞춤 m.</li> <li>SN에 대 한 검색을 2.5 X 목표를 선택 합니다.</li>
	<li>X. 63 목표 변경</li>
	<li>왼쪽된 상단 (TopLeft) (그림 2c) 및 오른쪽 아래 모서리 (LowRight) (그림 2d) 섹션의 클릭 하 여 정의 &#34; 세트. &#34;</li>
	<li>클릭 &#34; Z 시리즈 &#34; 확인 하 고는 &#34; Z-비행기 시리즈 &#34; 상자 (그림 2e).</li>
	<li>결정 3 개의 무작위로 선택 된 계산에서 섹션의 실제 탑재 된 두께 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 섹션 당 사이트. 클릭이 &#34; 보기 상단 오프셋 &#34; 정의 섹션 (그림 2e)의 상단을 클릭 &#34; 중지 보기 톱 &#34; (그림 2f). 그 후, 클릭 &#34; 보기 아래쪽 오프셋 &#34; (그림 2f)를 클릭 하 고 &#34; 중지 보기 하단 &#34; (그림 2 g). 섹션의 두께 적어 둡니다.</li>
	<li>빼기 3 µ m (가드 영역) 위에서 오프셋 하 고 최고 오프셋된 슬롯 (그림 2 h)에 결과 입력 합니다. 13 µ m (광 disector의 높이) 최고 오프셋된 수에서 뺍니다 고 맨 아래 오프셋된 슬롯 (그림 2i)에 결과 입력 합니다. 다음 매개 변수를 선택 합니다: 단계, 14; 크기, 1.00 (그림 2i). 
	참고:이 연속 이미지 사이의 1 µ m 거리 13 µ m의 z 평면에 두께에 해당.</li>
	<li>(그림 2j) 파일을 저장할 디렉터리를 선택 합니다.</li>
	<li>클릭 &#34; 시퀀스 &#34; (그림 2j) 수집을 시작 하.</li>
	<li>클릭 &#34; 처리 &#34; 고 다음과 같은 매개 변수 선택: &#34; 모든 비행기 &#34;에서 &#34; 순서; &#34; &#34; 몽타주; &#34;와 &#34; 빠른 &#34; 및 &#34; 바느질 &#34; 상자, 10% (그림 2)의 이미지 중복. 시작을 클릭 하 여 이미지를 &#34; 시작 &#34;. 
	참고: 분석에 대 한 스택 이미지 생성 됩니다 (그림 2 l, 그림 3a -e).</li>
</ol> 3. Stereological 평가 순서 <ol><li>NIH ImageJ 소프트웨어 버전 4.7 사용 하 여 SN 스택 이미지의 분석을 수행.</li>
	<li>ImageJ.nih.gov 웹사이트에서 필요한 두 개의 플러그인 다운로드:는 &#34; 그리드 오버레이 &#34; 플러그인 15와 &#34; 셀 카운터 &#34; 플러그인 16. 설명 된 대로 두 플러그인 설치.</li>
	<li>편견된 stereological 평가 대 한 다음과 같은 세 매개 변수 정의: 그리드 크기 130 x 130 µ m; 계산 프레임, 50 x 50 µ m; 광 disector 높이, 13 & #181, m.</li>
	<li>클릭 하 여 이미지를 열고 &#34; 파일 &#34; &#8594; &#34; 오픈 &#34; (그림 4a)를 사용 하 여 이미지 축척을 설정에 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; 명령 (그림 4b). 이 단계에 대 한 정의 된 크기에서에서 변경 픽셀 µ m (그림 4c). 
	참고: 분석 된 이미지에 대 한 425 픽셀 100 µ m에 해당.</li>
	<li>선택은 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 그리드 &#34; &#8594; &#34; 격자 유형: 라인 &#34; 그리드를 무작위로 삽입 하는 명령. 검사는 &#34; 임의의 오프셋 &#34; 상자. 130 µ m x 130 µ m으로 grid (그리드 사각형) 내 하나의 사각형의 크기를 정의 = 16900 µ m 2 ( 그림 3b 및 그림 4 d 및 e).</li>
	<li>변경 이미지에서 유형 16-비트 RGB 색상 (클릭 &#34; 이미지 &#34; &#8594; &#34; 유형 &#34; &#8594; &#34; RGB 색상 &#34;) (그림 4 층). Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc를, 찾습니다 17.와 SNpc를 둘러싸 자는 &#34; 페인트 브러시 도구 &#34; (브러쉬 폭: 11) ( 그림 3 c 및 그림 4 g -난).</li>
	<li>실행 취소는 &#34; 비율 설정 &#34; 클릭 하 여 명령 &#34; 분석 &#34; &#8594; &#34; 비율 설정 &#34; &#8594; &#34; 제거 규모를 클릭 &#34; (그림 4j -l) 오히려 픽셀에 계산의 성능을 사용할 수 있도록 µ m 보다.</li>
	<li>화면 (그림 4 m)를 확인 하 고 이미지 파일 저장 ImageJ (그림 4n)으로 새 파일을 엽니다. 선택 &#34; 포인트 &#34; (그림 4o)와 25 (그림 4 p)의 브러시 폭. 그 연락처는 SN 광학 disector (그림 4 분기)의 배치에 대 한 모든 그리드 사각형을 표시 합니다. 개요 SN 부분적으로 또는 완전히 지역화 된 모든 광학 disectors에 셀 수의 분석을 수행.</li>
	<li>SN의 부분을 포함 한 그리드 사각형을 선택 합니다. ImageJ는 x와 y를 정의 하에 커서를 놓고이 사각형의 왼쪽된 위 모퉁이 좌표 (4r 그림)와 함께 시작 하는 측정. 
	참고: 광 disector를 사용 하 여 위치에 대 한 삽입 됩니다 좌표는 &#34; 광학 disector 위치 &#34; (그림 4s), 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>, 스프레드시트 서식 파일을 사용 하 여 광학 disector 위치를 계산 &#34; 광학 disector 위치, &#34; 4 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>보정 광학 disector (매크로 추가 파일 크리스토퍼 S. 구 음)를 클릭 하 여 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 편집 &#34; (그림 4t), 열은 &#34; opt_dis_ grid.txt &#34; (4u 그림) 파일, 그리고 정의의 크기는 &#34; usergrid &#34; x, y 차원 광학 disector (그림 4v)의 해당 픽셀에. 50 µ m x 50 µ m의 크기를 선택 하는 usergrid의 1 개의 측의 크기는 212.5 픽셀 (픽셀 50 x 4.25)로 정의 됩니다.</li>
	<li>광학 disector (그림 4v)의 중심을 정의 하는 ImageX와 ImageY 좌표를 삽입 하 여 스택 이미지에서 광학 disector의 위치를 결정 합니다. 매크로 실행 (&#34; 매크로 &#34; &#8594; &#34; 실행 매크로 &#34;) (그림 4w). 
	참고: 격자 ( 3d 그림 및 그림 4 x) 스택 이미지에서 사라져 버릴 것 이다. Z-평면 ( 3e 그림 및 그림 4 x)에서 이동할 때 광 disector 유지 됩니다.</li>
	<li>선택 &#34; 플러그인 &#34; &#8594; &#34; 셀 카운터 &#34; 셀 카운터 플러그인 (그림 4y) 시작. 셀 카운터를 초기화 하 고 표식 유형 (그림 4z)를 선택 합니다. 이미지에 확대 (클릭 &#34; + &#34;) 200%의 확대에 핸드폰 번호의 stereological 평가 수행 하는 고.</li>
	<li>식별 dopaminergic 신경 perikarya 그들의 둥근 또는 ovoid 모양 및 셀 크기 ( 그림 1a). Stereological 규칙을 사용 하 여 셀의 수를 계량. 
	참고: 광 disector 3 차원 큐브 ( 그림 5a) 이기 때문에, 왼쪽, 앞으로 제외 측 및 큐브 (빨간색)의 최고의 측면 정의 합니다. 따라서, 돈 &#39; t 수 회 + 셀 레드 라인 (왼쪽 및 전면) 또는 상단 측면의 접촉으로 그 어 서. 준비 된 스프레드시트 파일에는 셀의 결과 추가 &#34;의 세포 수 계산 &#34; (5 단계).</li>
	<li>SN 이미지에 따라 계산 다음 셀 개수에 대 한 광학 disector를 다음 그리드 스퀘어 사용 하 여 x, y 단계 overlying 그리드 ( 그림 5b)의 크기와 &#34; 광학 disector 위치 &#34; 4 단계에서 설명한 대로 스프레드시트 서식 파일.</li>
	<li>셀 번호 사용의 추정을 수행는 &#34;의 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 (5 단계).</li>
</ol> 4. 광학 Disector 위치를 사용 하 여 계산 된 &#34; 광 Disector 위치 &#34; 스프레드시트 서식 파일 <ol><li>계산 크기와 SN (윤곽선 overlying 그리드에 배치 각 광 disector의 위치 그림 5b) 사용 하는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가).</li>
	<li>삽입 µ m, 당 픽셀의 변환에 의해 정의 된 대로 &#34; 비율 설정 &#34; 명령의 노란색 표시 된 위치에는 &#34; 광학 disector position.xlsx &#34; 파일 ( 그림 6a와 보충 파일 ).</li>
	<li>광학 disector의 계획 된 크기와 삽입 (µ m)에서 1 개의 측의 길이 의해 정의 된 overlying 그리드의 모눈 정사각형의 크기 오렌지 표시 위치. 
	참고: 결과 주황색 상자 옆에 있는 빨간 상자에 묘사 된다.</li>
	<li>시작 지점으로 결정 했다 SN 윤곽선 그리드 사각형으로 시작 (하나의 그리드 사각형 선정 되었다로 시작 되기 위하여는, 단계 3.9에서 같이 위의).</li>
	<li>삽입 x 및 y 좌표를 기준으로 측정 단계는 파일의 녹색 상자에 3.9에서 (이러한 값, x, y 좌표를 사용 하 여이 첫 번째 사각형 내에서 광학 disector의 센터 계산 되 고 결과 파란색 상자에 묘사에 대 한). Opt_dis_grid.txt 매크로 (추가 파일) 실행.</li>
	<li>첫 번째 그리드 사각형 (갈색 상자) 기준으로 그리드 스퀘어 거리 (사각형의 수 측정)를 삽입 하 여 x, y 좌표 연속 광 disectors의 계산. 
	참고: + x: 그리드 사각형은 오른쪽; -x: 그리드 사각형은 왼쪽; + y: 그리드-광장은 아래쪽에 위치 하 고 있습니다. -y: 그리드 사각형은 상단에 위치 하 고 있습니다. 결과 회색 상자에 표시 됩니다.</li>
</ol> 5. 셀 번호를 사용 하 여 추정은 &#34; 세포 수 계산 &#34; 스프레드시트 <ol><li>계산 수식을 사용 하 여 동물 (N) 당 회 + SN 셀의 예상된 수 출판 서쪽 외 알., 1991 년 3, 어디 &#8721; Q - 일 + 신경 한 뇌 섹션의 모든 광학 disectors에 계산의 총 수로 정의 됩니다. 
	참고: 측정된 두께 (t) 섹션의 관련 광학 disector (h)의 높이 방정식에 포함 됩니다. 지역 샘플링 분수 (asf) 표 (x, y 단계)의 사각형 크기 내에서 광학 disector (광 disector) 프레임 크기의 영역 (A)의 비율으로 정의 된다 (광 disector/A x, y 단계) ( 그림 3b), 그리고 섹션 샘플링 분수 (ssf) 전체 직렬 컷된 두뇌의 섹션의 비율으로 정의 됩니다: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> 양적 높은 품질을 보장 하기 위해 추정 계수 오류 (CE) 0.10 보다 낮은 되어야 합니다. Keuker 외에 의해 수식을 사용 하 여 CE 확인., 2001 년 10: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li> <li>각각의 SN 내 휴대폰 번호 stereological 추정에 대 한 마우스, 마우스 당 생성 된 시리즈의 총 수, 광 disector, x, y 영역 광학 disector (µ m 2: 광 disector), x, y 영역 (x, y 단계 모눈 정사각형의 높이 대 한 지정 된 정보를 삽입 µ m 2에), 평균 측정 (µ m)에서 사용 하 여 노란색 상자에 섹션의 두께 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 ( 그림 6b 파일 및 보조 파일 ).</li>
	<li>같은 동물에서 각 SN 섹션 5 단계에서 설명한 대로 분석.</li>
	<li>삽입 셀 카운트 회색 상자에 각 광 disector 한 SN 섹션을 참조를 사용 하 여 각 줄에서 &#34; 셀 count.xlsx의 계산 &#34; 스프레드시트 파일 (파일 추가). 
	참고: 예상된 휴대폰 번호 및 계산 된 CE 파란색 상자 ( 그림 6b)에서 묘사 된다.</li>
</ol> 6. 상업적으로 사용 가능한 Stereology 시스템을 사용 하 여 셀 번호의 추정 <ol><li>시작 dopaminergic SNpc의 추정 셀 번호를 클릭 하 여 &#34; 프로브 &#34; &#8594; &#34; 광학 Fractionator 워크플로 &#34; 광학 Fractionator 여 워크플로 창. 
	참고: 새 창이 나타납니다-SN의 새 시리즈 계산 될 것 이다 확인.</li>
	<li>클릭 하 여 일 + SN 섹션의 새로운 시리즈를 시작 &#34; 새로운 주제를 시작 &#34; 팝업 창에서.</li>
	<li>광학 Fractionator 워크플로의 다른 단계를 통해 이동합니다. 첫 번째 단계에서 주제를 설정 합니다. 이 위해 조사를 삽입 &#39; s 이름, 주제, &#39; s 이름 (SN 그룹), 및 기타 유용한 정보. 이 SN에 대 한 계산 섹션의 숫자를 삽입 합니다. 잘라 조직 단면도의 두께 삽입 합니다. 4이 경우에 섹션 간격을 삽입 합니다. 시작으로 임의로 결정된 섹션 번호 삽입.</li>
	<li>두 번째 단계에서 설정 낮은 확대 (2 X 목표)을 선택 현미경 &#34; 탄 창 렌즈 X 2 &#34; 메뉴에서.</li>
	<li>Baquet 외에 설명 된 대로 SNpc은 마우스 왼쪽된 버튼으로 관심 영역을 추적 3 단계에서., 2009 17.</li>
	<li>4 단계에서 높은 확대에 현미경을 설정합니다. 이 위해 100 X 목표를 변경 하 고 선택 &#34; 100 X 매기 렌즈 &#34; 드롭다운 메뉴에서.</li>
	<li>5 단계에서 초점을 맞춤 으로써 섹션의 하단을 상단에 탑재 된 두께 측정.</li>
	<li>단계에서 6, 50 x 50 µ m로 계산 프레임 크기를 정의; 광학 disector (x, y)의 크기입니다.</li>
	<li>7 단계에서 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 격자의 크기 130 x 130 µ m 설정.</li>
	<li>8 단계에서 3 µ m 감시 영역을 입력.</li>
	<li>9 단계에서 설정을 저장.</li>
	<li>는 마지막으로, 광학 Fractionator 워크플로의 단계 10에서에서 SRS 격자 내에서 광학 disectors의 각 목 + dopaminergic 셀을 계산합니다. 이 클릭 하 여 시작 된 &#34; 계산 &#34; 버튼.</li>
	<li>클릭 한 부분을 마치고는 &#34; 다음 섹션 시작 &#34; 같은 SN 시리즈의 다음 SN 섹션의 광학 Fractionator 워크플로 시작 하는 버튼.</li>
	<li>1 SN 시리즈의 마지막 SN 섹션 계량 되었습니다 때 클릭 &#34; 나 &#39; ve 완료 센다. &#34;</li>
	<li>클릭 합니다 &#34; 결과 보기 &#34; stereology 샘플링의 결과 표시 하려면 단추.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV1/2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment:+a+new+mouse+model+for+Parkinson's+disease.">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11 (2017).</li><li>Ip, C. W., Beck, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct.">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881 (2011).</li><li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice.">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>. Grid_Overlay.java Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010)</li><li>. cell_counter.jar Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010)</li><li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+model-based+(2D)+and+design-based+(3D)+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+(SNpc)+of+the+C57BL/6J+mouse.">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra,+ventral+tegmental+area,+and+retrorubral+field+in+the+mouse.">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li><li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+dopaminergic+neurons+(nuclei+A8,+A9,+and+A10):+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat.">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li><li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL/6+Mice.">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094 (2016).</li></ol>

C. W. I. 즈 제약, LLC 및 TEVA; 과학 보드에서 제공 하는 Ipsen, 즈, LLC는, 제약과 엘 러간, Inc.;에서 여행에 대 한 자금 지원을 받고 있다 제출된 작품 외부 스피커 honoraria Merz, TEVA, 엘 러간, i n c.에서 받았다. J. V. 보스턴 과학, Medtronic, 및 AbbVie에 대 한 컨설턴트 역임 했다 고 제출된 작품 밖에 honoraria Medtronic, 보스턴 과학, AbbVie, Bial, 엘 러간, 및 GlobalKinetics에서 받고 있다.

Stereology는 조직 처리를 시작합니다. SN 조직의 직렬 절단 stereological 분석 하는 동안 섹션의 손실을 방지 하기 위해 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 또한, 하나의 필수 단계 stereology 수행할 때 SN 왼쪽에서 오른쪽을 구별 하기 위해 한 반구를 표시 하는. Brainstem의 상단 부분에 작은 구멍을 배치 제시 연구에서 최상의 결과 생성. 또한, 조직이 광학 fractionator 방법 요구 작업 이후 약 30-40 µ m 보다는 더 ?...

신경 세포 수의 부 량은 neurodegeneration substantia nigra (SN)1,2에서 레벨을 전 임상 파 킨 슨 병 연구에. 관심의 영역에 셀 수의 편견된 stereological 추정 금3,,45으로 간주 됩니다.
편견된 stereology의 도래 하기 전에 섹션에서 신경 세포의 수는 뉴런 섹션에 광경에와 서 가변 확률에 대 한 수정 계산된 셀 프로 파일을 조작 하 여 평가 했다. 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 아베 크롬 비6에 의해 설명 된 정량된 셀의 정정 했다. 이 방법은 세포 조각 같은 셀의 인접 한 얇은 섹션에서 발견 되는 경우 여러 번 측정할 수는 계정에 걸릴 하려고 했습니다. 따라서, 아베 크롬 비와 다른 저자 모양, 크기, 및 계산된 셀7,8의 방향에 대 한 정의 요구 하는 방정식을 생성. 그러나, 이러한 가정 일반적으로 하지 실현 되었고 따라서 실제 휴대폰 번호 (즉, 바이어스)에서 체계적인 오류 및 분기에 led. 또한, 바이어스 추가 샘플링3으로 줄일 수 없습니다.
Stereological 광학 fractionator를 사용 하 여 셀 수 추정에 대 한 수학적 원리 직접 정의 3 차원 볼륨에 직접 셀 숫자를 추정에 적용 됩니다. 이 방법의 장점은 그것은 모양, 크기, 및 계산 셀의 방향에 대 한 가정을 포함 하지 않습니다. 따라서, 예상된 핸드폰 번호는 참 값에 가까운 고 가까이 샘플 크기가 증가 (즉, 편견)3. Stereology 편견 메서드를 계속 사용 하는 경우 많은 규칙을 따라야 합니다, 때문에 준비-사용 상업 stereology 시스템 개발 되었습니다 (검토를 위해 참조 슈 미 츠, 호프, 20054). 전문된 stereology 시스템 디자인-기반 stereological 메서드 구현 선험적 정의 프로브와 샘플링 방식을 모양, 크기, 공간 배급, 및의 방향에서 독립을 이끌어 내는 stereological 평가 분석 된4,9에 셀. 그러나, 상용 stereology 시스템 비싸다; 이 새로운 연구에서 제한할 수 있습니다.
이 연구의 목표는 SN, 광학 fractionator 메서드를 사용 하 고 표준 현미경 장비 (즉, 빛을 사용 하 여 마우스에서 dopaminergic 셀의 디자인 기반 stereological 추정에 대 한 사용 가능한 기술을 개발 했다 현미경, 표준 현미경 소프트웨어 및는 자동화 한 x, y, z 단계). 이 위해, 마우스 뇌 조직 처리 하는 방법과 편견된 stereology 디자인-기반을 사용 하 여 SN 셀 숫자를 예측 하는 방법에 대 한 단계별 가이드를 제시 합니다. 또한, 예상된 셀 숫자의 계산 및 오류 (CE)의 계수에 대 한 템플릿은 제공 합니다.
여기에 설명 된 메서드는 SN의 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 마우스 또는 쥐 뇌의 해부학 적 정의 다른 영역에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 편견된 stereology 마10 과 로커 스 coeruleus11신경 세포 숫자를 추정 사용 되었습니다. 또한, 신경, 이다12 와 microglia13, 등 다른 세포 유형 뿐만 평가 될 수 있다. 따라서,이 방법은 그들의 연구에서 편견된 stereology를 구현 하고자 하지만 많은 stereology 시스템을 구입 하는 돈 지출 하고자 하는 과학자에 게 유용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Paxinos mouse atlas</td><td></td><td></td><td>The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet &amp;amp; created by Paul Halasz</td></tr><tr><td>brain matrix slicer mouse</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>sucrose /D(+) Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;phosphate buffered saline ingredients:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>potassium dihydrogen phosphate</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>di-sodium hydrogen phosphate dihydrate</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>detergent</td></tr><tr><td>3,3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid/DAB tablets 10mg pH 7.0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/ Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>avidin/biotin reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>rabbit anti mouse tyrosine hydroxylase antibody</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotinylated goat-anti-rabbit IgG H+L</td><td>vector laboratories</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator version 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>grid overlay plugin</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>cell counter plugin</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>optical disector macro</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N male mice</td><td>Charles River, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus coated object slides</td><td>Langenbrinck, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G needle Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Analog Infusion pump</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator system</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator version 11.07</td></tr><tr><td>BX53 microscope</td><td></td><td></td><td>BX53 microscope</td></tr><tr><td>self-assorted stereology</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereological estimation of dopaminergic neuron number in the mouse substantia nigra using the optical fractionator and standard microscopy equipment

전 임상 파 킨 슨 병 연구에 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 손실의 정량화를 포함 하 여 nigrostriatal로 분석은 필수적입니다. 총 dopaminergic 신경 세포 숫자를 예상 하려면 편견된 stereology 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 현재 이라고 여겨진다 금 표준. 광학 fractionator 메서드 뒤에 이론은 복잡 하 고 stereology 전문된 장비 없이 달성 하기 어렵습니다, 때문에 필요한 소프트웨어를 포함 하는 여러 상용 완료 stereology 시스템 존재, 순전히 있기 때문에 셀에 대 한 이유를 계산. 이 보고서에 dopaminergic 신경 세포의 stereological 추정 가벼운 현미경을 포함 하 여 표준 현미경 장비를 사용 하 여 계산에 대 한 방법을 설명 합니다 이후 특수 stereology 설치 구입은 항상 가능 하 고, 여러 가지 이유로, 한 이미징 소프트웨어와 분석에 대 한 컴퓨터 개체 테이블 (x, y, z 평면)를 자동화. 단계별 설명은 광학 fractionator 메서드를 사용 하 여 stereological 정량화를 수행 하는 방법에 부여 되 고 예상된 셀 개수 계산에 대 한 사전 프로그램 된 파일 제공 됩니다. 이 방법의 정확도 평가, 하 상용 stereology 장치에서 가져온 데이터에 대 한 비교는 수행 되었다. 유사한 핸드폰 번호가 프로토콜과 stereology 장치를 사용 하 여 따라서 편견된 stereology이이 프로토콜의 정밀도 보여주는 발견 됐다.

제시 방법, 일 + 오른쪽 SN 7,363 및 7,987 세포 사이 원거리로 하 고, SN, 왼쪽에서 dopaminergic 신경의 예상된 번호를 사용 하 여 7,446 및 7,904 세포 사이. 따라서, dopaminergic 신경 (± SEM)의 평균 수 SN 오른쪽과 왼쪽 SN 7,675 ± 66에 대 한 7,647 ± 83 셀 이었다. 각 동물에 대 한 계산 된 CE는 0.08 보다 낮은 (범위: 0.073 0.079) (그림 7). 상업적으로 사용 가능 하 고 전문 ster...

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Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

광학 Fractionator 표준 현미경 장비를 사용 하 여 마우스 Substantia Nigra에서 Dopaminergic 신경 수 stereological 추정

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K 조회수.  University Hospital of Würzburg. 이 작업 표준 현미경 장비 (즉, 가벼운 현미경 자동화 개체 테이블 (x, y, z를 사용 하 여 마우스 substantia nigra에서 dopaminergic 신경 세포 숫자의 편견된 stereological 추정에 대 한 단계별 프로토콜 제공 비행기), 그리고 디지털 이미지 분석을 위한 공개 소프트웨어.

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

연구

신경과학

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

전기 충격 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하기위한 광학적 분별 기 기술

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Elimination of Serotonergic Neurons by Stereotaxic Injection of 5,7-Dihydroxytryptamine in the Dorsal Raphe Nuclei of Mice

Stereotaxic injection has been widely used for direct delivery of compounds or viruses to targeted brain areas in rodents. Direct targeting of serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus (DRN) can cause excessive bleeding and animal death, due to its location below the superior sagittal sinus (SSS). This protocol describes the generation of a DRN serotonergic neuron-lesioned mouse model (&#62;90% survival rate) with stable loss of &#62;70% 5-HT-positive cells in the DRN. The lesion is induced by stereotaxic injection of a selective serotonergic neurotoxin 5,7-dihydroxytryptamine (5,7-DHT) into the DRN using an angled approach (30&#176; in the anterior/posterior direction) to avoid injury to the SSS. DRN serotonergic neuron-lesioned mice display anxiety-associated behavior alterations, which helps to confirm success of the DRN lesion surgery. This method is used here for DRN lesions, but it can also be used for other stereotaxic injections that require angular injections to avoid midline structures. This DRN serotonergic neuron-lesioned mouse model provides a valuable tool for understanding the role of serotonergic neurons in the pathogenesis of psychiatric disorders, such as generalized anxiety disorder and major depressive disorder.

This protocol describes a dorsal raphe nucleus (DRN)-lesioned mouse model (&#62;90% survival rate in experimental mice) with stable loss of dorsal raphe serotonergic neurons by stereotaxic injection of 5,7-dihydroxytryptamine into the DRN using an angled approach to prevent injury to the superior sagittal sinus.

Stereotaxic injection has been widely used for direct delivery of compounds or viruses to targeted brain areas in rodents. Direct targeting of ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...