Name: in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
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이 연구는 과학 및 기술 위원회 상하이 (보조금 번호 14411961800)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81300805)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서 <ol><li>문화 및 세포 주기 동기화 셀.
	<ol><li>유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 &#39; s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO 2 보충.</li>
		<li>G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다.
		<li>HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 7 셀을 사용 하 여 치료 전에 24 h에 대 한 25 ml 성장 매체와 접시 수 <ol>. 70%-80%, aspirate의 합류에 도달 세척 매체 후 셀 두 번 5 mL와 함께 prewarmed 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).</li>
			<li>추가 25 mL 1% 포함 된 DMEM 페니실린-스와 72 h. 씻어 3 mL 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 접시에서 셀에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. 새로운 5 mL 튜브로 셀 전송.</li>
			<li>Cytometry (1.2 단계)에 의해 세포 주기 분석에 셀의 작은 부분을 주제; 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리 하 여 셀의 나머지 대부분을 수집 하 고 분석까지 울트라-낮은 온도 냉동 고에 저장 하 Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>G1 단계를 셀, G0 동기화 프로세스의 끝에는 DMEM를 제거 하 고 다시 신선한 성장 매체, 세포 주기를 재입력 하 HEK293 세포 되므로 추가. 그런 다음, 다른 g 1 단계에서 세포를 수집 (초기 g 1: 30 분; G1: 2 h) 세포 주기 분석 및 추가 스모 시험.</li>
		<li>더블 티 미 딘 블록 메서드를 사용 하 여 S 단계에서 HEK293 세포를 동기화 합니다.
		<li>성장 HEK293 세포 50% 및 세척의 confluency <ol>prewarmed PBS 가진 셀입니다. 2.5 m m 티 미 딘 18 h (첫 번째 블록)에 대 한 보충 성장 매체를 추가 합니다.</li>
			<li>티 미 딘을 포함 하는 매체를 제거 하 고 셀 prewarmed PBS로 두번 세척. 14 h 셀 출시를 위한 신선한 성장 매체 추가.</li>
			<li>는 피 펫과 매체를 삭제 하 고 2.5 m m 티 미 딘 다른 18 h (2 블록)에 대 한 보충 성장 매체는 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 추가.</li>
		</ol></li> <li>G 2은 / M에 대 한 동기화, 25 mL 24 h에 대 한 성장 매체와 15cm 접시 접시 ~1.5 × 10 7 HEK293 세포. 다음 400 ng/mL의 최종 농도 얻을 때까지 매체에 nocodazole을 추가 합니다. 마지막으로, 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 16 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol></li> <li>Cytometry에 의해 세포 주기 분석.
	<ol><li>다시 PBS에 동기화 HEK293를 일시 중단 하 고 다음 2 h 4에서 차가운 70% 에탄올을 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 수정 ° C. 셀 클러스터링 최소화, 세포 현 탁 액의 최종 농도를 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올 dropwise 추가할 유의 부드럽게 vortexing 동안 70% 에탄올.</li>
		<li>X 500g에 5 분에 대 한 셀을 원심 다음 신중 하 게 하 게 삭제는 상쾌한 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어. 원심 분리기 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>추가 500 µ L PBS 포함 50 µ g/mL 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물, 셀에 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 1 µ g/mL RNase A와 섞어 잘. 15 분 37에 대 한 셀을 품 어 ° c.</li>
		<li>Cytometry 분석까지 4 ° C에서 샘플 저장.</li>
	</ol></li> <li>생 Rb 단백질의 Immunoprecipitation.
	<ol><li>준비는 HEK293 세포 lysates입니다.
		<ol><li>Lyse 부드럽게 다시 차가운 라디오-immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (표 1)의 1 mL에 갓 포함 하는 그들을 중단 하 여 동기화 HEK293 세포 추가 20 mM N-Ethylmaleimide, 수 있는 isopeptidase 억제제 스모 프로 테아 제를 차단 하 고 안정화 스모 어원이 같은 말.</li>
			<li>더 균질 Dounce 균질, 쥡니다 또는 단순히 통과 10 배 2 mL 주사기에 21 G 바늘을 통해 얼음에 셀. 그런 다음, 5 분 ice에 셀을 품 어 
			참고: 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) RIPA 버퍼에는 Rb 스모의 최신 결정에 대 한 중요 한으로 Rb 단백질 및 기타 비 공유 상호작용에서 파생 된 불특정 스모 신호를 제거할 수 있습니다. 비-Rb 스모 종.</li>
		</ol></li> <li>4 시 30 분에 대 한 18000 x g에서 세포 lysates 원심 ° C. 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 튜브는 supernatants 전송. 
		참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 단백질-80 ° C에 6 개월 이상 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비 하 저장 위의 설명 상쾌한의 작은 부분 새로운 튜브와 스토어-80 ° c.</li>
		<li>위의 supernatants Rb 항 체 단일 클로 널 및 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 20 µ L 1 µ g의 일반적인 마우스 면역 글로불린 G (IgG) 같은 종과 isotype의 추가. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>원심 3 분 3000 x g에서 샘플 4 ° C. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송. 각 샘플에 5 µ L Rb 1 차적인 항 체와 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 40 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 비드 손실을 방지 하기 위해 유의 구슬 드라이 발음 하지 않습니다.</li>
		<li>씻어 4 번 RIPA 버퍼의 1 mL와 구슬. 각각, 혼합 튜브 15 분에 4 ° C에서 수집 하는 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 낮은 속도 원심 분리에 의해 시간과 다음 삭제는 supernatants.</li>
		<li>Supernatants 최종 세척에서 제거 후 다시 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 로드 버퍼 (표 1) x 30 µ L 1에에서 비즈를 일시 중단 하 고 잘 혼합.
		<ol><li>품 튜브는 열에 100 ° C에서 10 분 원심 작은 구슬에 1 분 동안 12000 x g에서 샘플에 대 한 차단. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송.</li>
		</ol></li> <li>샘플 4%-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤 분석 및 서양 오 점 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 인간 세포에 외 인 Rb SUMOylation 6XHis 태그의 분석 <ol><li>세포 문화 및 transfection.
	<ol><li>씨 ~ 6 × 10 6 HEK293 세포 10 cm에 요리 하 고 75%-85 %confluent 셀을 얻으려고 정상 세포 문화 조건 하에서 성장 매체에 24 h에 대 한 품 어. Transfection, 전에 성장 매체를 제거 하 고 prewarmed 감소 된 혈 청 매체의 6 mL을 추가 (재료의 표 참조) 하 고 다음 요리 다시 인큐베이터.</li>
		<li>Rb에 대 한 제정 SUMOylation 분석 결과, 각각 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 500 µ L 감소 된 혈 청 매체에 15 µ g 각 6XHis 태그 Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT 및 Ubc9 C93S 플라스 미드의 추가.
		<ol><li>야생 타입 Rb의 스모 활용 및 그것의 SUMOylation 결함 돌연변이 분석, 10 µ g 어느 6XHis 태그 Rb-WT 또는 Rb K720R 플라스 미드 GFP SUMO1와의 혼합 (10 µ g) 500 µ L 감소 1.5 mL 마이크로 원심 분리기에서 혈 청 매체 13 관.</li>
		</ol></li> <li>한편, 별도 튜브에서 50 µ L transfection 시 약을 혼합 500 µ L 감소, 혈 청 매체 (재료의 표 참조) 및 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>완벽 하 게, 위에서 설명한 두 개의 별도 튜브를 결합 하 여 세포 시 약/플라스 미드 단지 15 분 추가 transfection에 대 한 실 온에서 품 어 고 8에 대 한 문화를 계속 5% CO 2와 37 ° C에서 h</li>
		<li>Transfection 후 48 h에 대 한 정상적인 문화 조건 하에서 세포를 품 어 고 성장 매체, 감소 된 혈 청 매체.</li>
	</ol></li> <li>선호도 풀 다운 6XHis 태그 Rb 단백질의 니켈.
	<ol><li>Transfected HEK293 세포를 lyse 고 설명된 섹션 1.3.1로 총 단백질 추출.</li>
		<li>원심 분리기는 세포 lysates 18000 x g에서 4 시 30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 깨끗 한 튜브에 그들을 전송. 
		참고: 단백질 얼 수 있다이 시점에서 6 개월 이상-80 ° c.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비, 새로운 관을-80에 게 위에서 설명한 supernatants의 작은 부분 저장 ° c.</li>
		<li>워시 25 µ L 50%의 니켈 각 샘플에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 두 번 RIPA 버퍼 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) agarose 구슬. 4 시 3 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 ° c.</li>
		<li>10 m m의 최종 농도 얻기 위해 각 샘플에 추가 1 M 이미. 그런 다음 준비 된 Ni NTA agarose 구슬 포함 된 튜브에 각 샘플 추가.</li>
		<li>구슬과 부드러운 회전 4 ° C에서 2 h lysates 품 어. 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 구슬 회전 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 supernatants를 제거 합니다. 손실을 방지 하기 위해 구슬, 구슬 드라이 발음 하지 마십시오.</li>
		<li>이미 20 m m (표 1)를 포함 하는 워시 버퍼의 1 mL와 구슬 세척. 각 시간, 혼합 튜브 15 분 수집 4 ° C에서 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 회전 및 삭제는 supernatants.</li>
		<li>최종 세척 후 각 샘플을 차입의 30 µ L 버퍼 포함 250 m m 이미 (표 1)를 추가 하 고 혼합 영화. 그런 다음, 단백질을 elute 하 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>혼합 각 샘플 6 × SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1). 그런 다음, 10 분에 대 한 열 블록에 100 ° C에서 튜브를 품 어</li>
		<li>원심 분리기에서 12000 x g 작은 구슬 1 분. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 ml 마이크로 원심 관에 샘플을 전송. 샘플을 서쪽 오 점 분석 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 3. 서쪽 오 점 <ol><li>로드는 immunoprecipitation 또는 풀 다운 4-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤에 이전 단계에서 얻은 샘플. 단백질 분리를 90 분 동안 120 V에서 전기 이동 법 실시.</li>
	<li>전송 단백질 젤에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 300에서 electroblotting에 의해 탱크 전송 방법을 사용 하 여 4 ° C에서 90 분 동안 mA. 5%의 저지방 우유 (표 1) 실 온에서 1 h를 포함 하는 블록 버퍼에 PVDF 막 차단.</li>
	<li>품 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1)를 포함 하는 항 체 희석 버퍼에 1 차 항 체로 막 4 ° c.에서 하룻밤 1 차 항 체에 대 한 작동 농도 0.5 µ g/mL (안티-SUMO1 항 체), 또는 1: 2000 (안티-Rb 및 안티 Tubulin 항 체), 또는 1:5,000 (안티-GFP와 반대로 그의 항 체)의 희석 사용.</li>
	<li>씻고 막 3 x 10 분 트윈 (TBST) 버퍼 (표 1) tris 버퍼 염 분 x 1을 사용 하 여 각 시간에 대 한. 5% 탈지 우유 (표 1)를 포함 하는 블록 버퍼에 종 특정 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용 된 이차 항 체 희석된 1:5,000와 막 품 어. 3 막 씻고 10 분 1 x TBST 버퍼를 사용 하 여 각 시간에 대 한 x.</li>
	<li>는 솔루션 작업 향상 된 화학 (ECL)와 막 품 어. 커버 플라스틱 포장을 가진 막 및 신호 강도 따라 x 선 필름에 노출.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.
이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 ...

진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암5의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.
포스트 번역 상 수정 RB 함수8,9의 규칙에 있는 중추적인 역할을 한다. 인 산화는 같은 한 수정, 그리고 그것은 일반적으로 Rb 비활성화 리드. 무부하 G0 셀에 Rb 인 산화 낮은 수준으로 활성화 됩니다. G0/G1 단계 진행 세포, Rb는 순차적으로 하이퍼-phosphorylated  종속 단백질 kinases (CDKs) 및 Rb를 비활성화 하 고 세포 주기를 억 누르기 위해 능력 제거   및 E/CDK2 D/CDK4/6, 같은 cyclins, 일련의에 의해 관련 유전자 식4,10. Rb 또한 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모)11,,1213수정 될 수 있습니다.
스모 다양 한 대상 단백질에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질 이다. 그것은 세포 주기 규칙을 포함 하 여 다양 한 세포질 프로세스에 대 한 중요, 전사, 단백질 세포질 지 방화 및 저하, 전송, 및 DNA 복구14,,1516, 17 , 18.에 스모 활용 통로로 구성 되어 dimeric 스모 E1 활성화 효소 SAE1/UBA2 단일 E2 conjugating 효소 Ubc9, 여러 E3 ligases, 스모 관련 프로 테아 제. 일반적으로, 초기 스모 단백질 proteolytically 성숙한 형태를 생성 하기 위해 처리 되어야 합니다. 성숙한 스모 E1 heterodimer에 의해 활성화 하 고 Ubc9 E2 효소로. 마지막으로, 스모의 C-터미널 글리신 covalently, 기판의 대상 리에 활용 된 그리고이 과정은 일반적으로 E3 ligases에 의해 촉진 된다. 스모 단백질 특정 프로 테아 제에 의해 수정 된 기판에서 제거할 수 있습니다. 이 문서의 저자에 의해 이전 연구 Rb SUMOylation CDK2에 그것의 바인딩을 초기 g 1 단계, 세포 주기 진행13에 필요한 과정에서 인 산화 하이퍼로 이어지는 증가 밝혀. 우리는 또한 Rb SUMOylation의 손실 감소 셀 확산 원인 설명 했다. 또한, 그것은 최근에 Rb의 SUMOylation proteasomal 회전율에서 따라서 셀19Rb 단백질의 수준을 증가 Rb 단백질을 보호 시연 했다. 따라서, SUMOylation 다양 한 세포질 프로세스에서 Rb 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 추가 연구를 기능 결과 Rb SUMOylation의 생리 적인 관련성 그건 인간의 세포 또는 환자 조직에서 Rb의 스모 상태를 분석 하는 효과적인 방법을 개발 하는 것이 중요.
SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정 이다입니다. 따라서, 완전히 생 조건에서 스모 수정 단백질을 검출 하기 위하여 일반적으로 어렵습니다. 이 종이 생 Rb SUMOylation 검색 하는 메서드를 제공 합니다. 또한, 그것은 야생-타입 Rb와 그 스모 결핍 돌연변이11외 인 Rb SUMOylation 감지 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 제이콥스 외. 주어진된 기판의 스모 수정 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD)20특히 증가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에 따라,이 프로토콜은 Rb의 강제 SUMOylation 그리고 그것의 기능적인 결과 분석 하는 방법을 설명 합니다. 스모 기판의 수백 설명한가지고 있고 더 많은 putative 스모 기판 많은 proteomic 기반 분석 실험에서 확인 되었습니다,이 프로토콜 분석 인간 세포에이 단백질의 SUMO 수정에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 ly...

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In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K 조회수.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

연구

생화학

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

생물학

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

요약

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유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

단백질 Ubiquitination의 감지

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술