저자는 저산소 챔버 장치를 제공 한 Dr. Nai-Sum Wong과 기술 지원을 담당 한 Ms. Alice Lui를 인정하고자합니다.

동물을 포함한 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 엄격히 수행되었으며, 홍콩 대학교 의과 대학 Li Ka Shing 학부의 교수 및 연구 실용 동물 사용위원회의 승인을 받았습니다. 인간 골수 샘플은 정보 제공자의 동의를 얻은 후 건강한 공여자의 장골 크레스트로부터 얻어졌다. 의정서는 홍콩 대학 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 1. 래트 MSC 배양 물의 제조 <ol><li> 대퇴골에서 MSCs 수확 <ol><li> 사용 전 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 툴 ( 즉, 잘게 깎은 가위, 무뚝뚝한 뾰족한 절단 가위 및 이빨 집게)을 고압 살균하십시오. </li><li> 15 % 태아 소 혈청 (FBS)과 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S, 1 % v / v)이 보충 된 최소 필수 중 알파 - 알파 변형 (αMEM)을 포함하는 MSC 성장 배지를 준비한다.). </li><li> 펜토 바르 비톤 과다 투여 (240 mg / kg 체중, 복강 내)하여 젊은 수컷 Sprague Dawley 쥐 (체중 200-250 g)를 희생시킨다. 참고 : 다른 쥐의 골수 샘플은 별도로 처리해야합니다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부와 팔다리를 깨끗이 닦으십시오. </li><li> 미세 해부 가위 및 포 셉를 사용하여 중간 허벅지를 통해 피부와 피하 조직을 제거합니다. 대퇴부가 노출 될 때까지 허벅지 근육을 원주 방향으로 제거합니다. 무릎 및 엉덩이 관절이 보일 때까지이 근위 및 원위로 계속하십시오. 뾰족한 뾰족한 절단 가위를 사용하여 둔부와 무릎 관절을 통해 대퇴골을 분리하십시오. 참고 :이 단계에서 골수강을 노출시키기 위해 대퇴골을 가로 지르지 마십시오. 손상되지 않은 대퇴골을 층류 조직 배양 후드로 옮겨 추가 처리합니다. </li><li> metaphysis를 통해 대퇴골의 원위 및 근위 끝을 transect하는 무딘 팁 절단 가위를 사용. </li><li> 50 ML 원추형 튜브 위에 70 μm의 셀 스트레이너를 놓으십시오. 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 MM Na 2 HPO 4 , 산도 7.4)가 들어있는 21G, 10mL 주사기를 노출 된 대퇴부에 삽입하고 플러시를 반복하여 원뿔 튜브에 골수 내용물을 플러시하십시오. 참고 : 각 대퇴부를 세척하기 위해 약 20 mL의 PBS를 사용합니다. 플러시 된 내용의 색이 혈액 염색 및 탁한 상태로 유지되면 더 큰 볼륨을 사용할 수 있습니다. </li><li> 5 분 480 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 물을 버린다. MSC 성장 매체 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend. 10cm 조직 배양 dish.Place 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 조직 문화 요리에 세포를 플레이트. 0 일째로 도금 첫 날을 기록한다. 참고 : 원심 분리를 포함한 모든 단계에서 최대 감속을 위해 브레이크를 설정하십시오. </li></ol></li><li> MSC 식민지의 확립과 확장 참고 :이 프로토콜 r골수강 내에서 MSCs를 선택하는 수단으로서의 조직 배양 플라스틱 접착에 관한 연구 11 . 골수 양은 조직 배양 플라스틱에 2 일 동안 고착시킬 수 있습니다. <ol><li> 2 일째, 10 mL의 PBS로 배양 판을 3 회 씻어서 비 부착 성 세포를 제거합니다. 린스 후 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. PBS로 세포를 씻어서 매 3 일마다 MSC 성장 배지로 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다 ( 그림 2A ). </li><li> 성장 매체를 제거하고 PBS로 세포를 씻어서 일 10까지 세포를 통과하십시오. 재조합 효소 세포 해리 시약 1.5 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C 5 분. 반응을 중화시키기 위해 3 mL의 MSC 성장 배지를 첨가한다. 5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. </li><li> PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 종자는 MSC 성장 배지에서 10-cm 배양 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 계대시켰다. 참고 : 랫 MSC는 계대 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다 ( 그림 2B ). 세포는 단계 1.2.2에서 설명한대로 8 계대까지 계대 할 수 있습니다. MSCs는 면역 세포 화학과 trilineage 분화 ( 그림 3 ) 12 에 대한 그들의 능력의 수단으로 특성 수 있습니다. 통로 3과 통로 8 사이의 MSC 배양 만이 후속 저산소증 전 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. 더 큰 계통 번호의 MSC는 평평한 형태를 취하고 ( 그림 2C ) 충분한 수의 신경 전구 세포를 생성하지 않습니다. 이러한 문화는 폐기해야합니다. </li></ol></li></ol> 2. 인간 BMSC 배양 물의 제조 <ol><li> 인간 골수 1 mL를 MSC 성장 배지 9 mL로 희석하고 플레이트10cm 조직 배양 접시에있는 세포. 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에서 배양 물을 유지하십시오. </li><li> 2 일 후 배지를 제거하고 비 점착성 세포를 제거하기 위해 PBS 10 mL로 배양액을 3 회 부드럽게 씻어냅니다. 최종 린스 후 PBS를 제거하고 10 mL의 MSC 성장 배지로 교체하십시오. PBS 린스 후 배양 3 일마다 성장 배지를 보충하십시오. 참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다. 식민지의 수는 개체간에 다를 수 있습니다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 10 일째에 세포를 통과시킵니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. MSC 성장 매체에서 10cm 문화 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도에서 계대 세포를 씨앗. 참고 : 인간 MSC ( 그림 2D )는 랫 MSC와 유사한 형태를 나타내며 마찬가지로 통과 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다. 그들은 chara이어야한다.immunocytochemistry 및 trilineage 차별화를위한 그들의 능력에 의해 cterized 12 . 쥐의 MSC와 마찬가지로, 3 ~ 8 단계의 인간 MSC는 후속 저산소 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. </li></ol> 3. 저산소 사전 컨디셔닝 <ol><li> 링 클램프를 풀고 hypoxia 챔버 구성 요소 ( 즉, 베이스, 뚜껑, 쟁반)를 분해하고 70 % 에탄올로 각 부품을 깨끗이 닦아냅니다. 15 분 동안 자외선 아래 살균을위한 층류 조직 문화 후드 내에 챔버 구성 요소를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning하기 전에, 매체를 제거하고 10 ML의 PBS로 쥐와 인간 MSC 문화 (섹션 1과 2)을 씻어. 25 MM HEPES로 보충 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. 참고 : 10cm dish에서 배양 된 MSC는 저산소 조건화를 받기 전에 80-90 %의 confluency에 도달해야합니다. </li><li> 줄을 놓으십시오.저산소실에서 요리를합니다. 챔버 부품을 다시 조립하고 링 클램프를 조입니다. 99 % N 2 / 1 % O 2 의 가스 혼합물을 5 분 동안 10L / min의 유속으로 챔버로 흘려 보내십시오. </li><li> 가스 누설이 없도록 저산소 챔버의 연결 끝 부분을 밀봉하십시오. 16 시간 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 ) 안에 챔버를 놓습니다. </li><li> hypoxic preconditioning 완료되면, 후속 신경 전구체 농축 문화에 대비하여 챔버에서 문화를 제거합니다. </li></ol> 4. 신경 전구 세포 농축 배양 <ol><li> B27 (2 % v / v), 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng / ml), 상피 세포 성장 인자 (EGF, EGF)가 보충 된 Dulbecco &#39;s modified eagle medium / Ham의 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)를 포함한다. </li><li> 단계 1.2.2에서 설명한대로 hypoxic preconditioned 쥐 / 인간 MSC를 분리합니다.5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 6,000 셀 / cm 2 의 밀도로 낮은 부착, 6 잘 접시에 신경 progenitor 매체와 종자에있는 세포를 Resuspend. 12 일 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 문화를 놓으십시오. 3 일마다 75 %의 신경 전구 세포를 보충하십시오. 참고 : 크기가 큰 비 부착 성 세포 클러스터는 6-7 일까지 관찰해야합니다. 10-12 일까지, 직경 ≥ 100 μm의 뉴로 필어를 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 4 ). 저산소 상태의 전처리 된 MSC는 정상 산소 상태에서 배양 된 MSC와 비교하여 더 많은 신경 세포를 생성합니다 9 . </li><li> 12 일에 10-mL 피펫으로 흡입하고 15 mL 원뿔 튜브로 옮겨 neurospheres를 모으십시오. 5 분 250 XG에서 neurospheres를 원심 분리기. 참고 : Neurospheres 수 있습니다네 스틴 (nestin) 및 GFAP 7 과 같은 신경 전구 마커에 대해 12 일째에 특징 지워진다. </li></ol> 5. DRG 뉴런과 공동 배양을 통한 운명의 결정을받은 Schwann 세포의 생성 <ol><li> 정제 된 래트 DRG 뉴런의 제조 <ol><li> 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 도구 ( 즉, 해부 가위, 포셉, 두 microdissection 집게 및 microdissecting 가위)을 고압. </li><li> 하룻밤 동안 4 ℃에서 poly-D-lysine (PDL, PBS에 10 μg / mL)을 코팅 한 6- 웰 조직 배양 플레이트. PDL을 제거하고 잘 PBS 당 1.5 ML로 씻으십시오. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 라미닌 (PBS 중의 10㎍ / mL)으로 플레이트를 코팅하는 것으로 진행한다. 1 well 당 1.5 mL의 PBS로 플레이트를 헹군다. </li><li> B27 (2 % v / v), L- 글루타민 (1 % v / v), 신경 성장 인자 (NGF, 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)가 보충 된 신경근 배지로 구성된 DRG 뉴런 유지 배지를 준비한다. % v / v). </li><li>B27 (2 % v / v), L-glutamine (1 %), NGF (20 ng / mL), P / S (1 %), fluorodeoxyuridine (FDU, 10)을 보충 한 신경 섬유 배지로 구성된 DRG 뉴런 정화 배지 μg / mL), 우리 딘 (10μg / mL). </li><li> 임신 14- 15 일에 임신 한 쥐를 pentobarbital 과량 투여 (240 mg / kg bodyweight, intraperitoneal)하여 희생시킨다. </li><li> 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부를 깨끗이 닦습니다. </li><li> 벌금 해부 가위와 포 셉를 사용하여 동물의 하복부 벽을 세로로 자르십시오. 해부 가위를 사용하여 자궁을 확인하고 제거하십시오. 자궁 벽을 잘라 배아를 노출시키고 추출하십시오. 배아를 PBS로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기십시오. 얼음에 문화 접시를 놓으십시오. </li><li> 해부를위한 배아를 PBS (실온)로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 배아가 엎드리는 자세에있게하십시오. 아니E : 희끄무레 한 척수와 부착 된 DRG는 반투명 한 피부를 통해 배아의 지느러미 측면에서 볼 수 있습니다. </li><li> 척수의 양쪽을 따라 microdissecting 집게를 삽입하고 주변 연조직에서 척수를 분리 시작하기 위해 무딘 절개를 사용합니다. 목 개방과 꼬리 스텁을 따라 microdissecting 집게를 사용하여 동물에서 척수를 무료로 잘라. 주변의 연조직에서 코드를 제거하기 위해 코드의 복부 측면에 대해 추가 무딘 절개를 수행하십시오. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 해제 척수의 지느러미 측면 이상의 잔여 연조직을 제거합니다. 참고 :이 단계에서는 척수, 신경 뿌리 및 부착 된 DRG 만 남아 있어야합니다. </li><li> microdissecting 집게를 사용하여 연결 신경 뿌리에서 개별 DRGs를 분리합니다. PBS가 포함 된 1.5 ML, 살균 원심 분리기 튜브에 DRG를 전송하는 1 ML 팁에 연결된 피펫 펜을 사용합니다. 참고 : 각 1.5 mL 튜브의 경우 최대100 개의 DRG를 수용 할 수 있습니다. </li><li> 5 분 250 XG에서 DRGs를 원심 분리기 및 재조합 효소 세포 해리 시약 (튜브 당 200 μL)에 그들을 resuspend. 10 분 동안 37 ℃, 5 % CO 2를 인큐베이션한다. 5 분 250 XG에서 DRG를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 DRG 뉴런 유지 관리 매체에 resuspend. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 부드러운 마찰로 펠렛을 떼어. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. </li><li> 잘 당 DRN 뉴런 유지 매체 1.5 ML PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 5,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 배양 2 일 후, DRG 뉴런 유지 매체를 제거하고 PBS로 헹구고 DRG 뉴런 정화 배지로 교체하십시오. 참고 : 각 정화 사이클에 대해 DRG 배양 물을 정화 배지로 2 일 동안 처리 한 다음 유지 관리 배지에서 1 일 배양합니다. 3-4 정화 사이클 후에, rem모든 내인성 glia의 타원형이 예상된다. 이것은 약 14 일 소요됩니다. 정제 된 문화는 연결 표지 TUJ1에 대해 양성이며 S100β 발현에는 결핍되어있다 ( 그림 5 ). </li></ol></li><li> 슈반 세포 - 유사 세포의 생성 <ol><li> β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10 %), P / S (1 % v / v). </li><li> PDL / laminin - 코팅 6 - 웰 플레이트에서 웰당 1.5 ML의 glial 유도 매체 cm 2 당 5-10 구의 밀도에서 섹션 4에서 준비 neurospheres를 판다. PBS로 세포를 헹구어 glial 유도 매체를 2 일마다 교체하십시오. 참고 : 시드 neurospheres에서 세포가 2 일까지 바깥쪽으로 마이 그 레이션 것으로 나타났습니다. 7 일까지, 철근 모양이 테이퍼 모양과 Schwann 세포에 대한 immunoposivity을 보여야한다마커 p75 뉴로 트로 핀 수용체 (p75) 및 S100β 7 . 이러한 셀을 SCLC라고합니다. </li></ol></li><li> SCLC와 DRG 뉴런의 공동 배양 <ol><li> DRG 뉴런 유지 매체 (단계 5.1.4)와 glial 유도 매체 (단계 5.2.1)로 구성된 공동 배양 배지를 1 : 1 부피비로 준비합니다. </li><li> FBS (5 %), β- 헤레 구린 (10 ng / mL), P / S (1 % v / v)가 보충 된 DMEM / F12로 구성된 Schwann 세포 유지 배지를 준비한다. </li><li> 7 일 SCLC에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 씻어 내고 37 ℃에서 0.5 mL / well의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 5 분 동안 배양합니다. 공동 배양 배지에 SCLC를 재현 탁한다. </li><li> 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> 1,000 셀 / cm 2 의 밀도로 SCLC를 정화 DRG 뉴런 문화에 종자. 2 일 간격으로 배지 교환을 실시하여 14 일 동안 공동 배양 물을 유지하십시오. 참고 : 공동 배양하는 동안 SCLCs는 성숙 Schwann 세포의 전형적인 스핀들 모양의 형태를 획득했습니다 ( 그림 6 ). 이러한 세포는 성장 인자의 철수 후 그들의 표현형에서 유지하고 체외 및 생체 내 axons myelinate 수 있습니다 7 , 10 . Schwann 세포 마커 ( 즉, p75 및 S100β)의 양성 여부는 면역 형광법으로 모니터링해야합니다. </li><li> 공동 배양이 완료되면 단계 1.2.2에서 설명한대로 숙주가 수행 한 Schwann 세포를 통과시킨다. 1 웰 당 0.5 mL의 해리 시약을 사용한다. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량. </li><li> Schwann 세포 유지 배지에서 10,000 세포 / cm 2 의 밀도로 운명의 결정을 한 Schwann 세포를 Resuspend하십시오. immunofluorescence위한 PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 세포를 시드. 참고 : 공동 배양은 필연적으로 섬유 아세포를 채택한 MSCs를 포함합니다세포 운명 7 . 이 세포들은 공동 배양의 완료시 운명 - 확약 Schwann 세포와 함께 계대된다. 이 fibroblast substratum의 꼭대기에있는 Schwann 세포는 PBS (4 ℃)의 &quot;콜드 제트 (cold jets)&quot;를 사용하여 헹구어 낸 후 쉽게 분리되어 추가로 팽창 될 수있다. 운명을 약속 한 Schwann 세포는 1 달 동안 유지 매체에서 확장 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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저산소 전처리 및 신경 구형 문화를 통해 신경 전구 세포를 풍부하게하기 전에 MSC의 &quot;줄기 (stemness)&quot;를 보존하는 것이 중요합니다. 우리의 경험으로부터 다 분화 MSC는 길쭉한 섬유 모세포와 같은 형태로 확실하게 확인 될 수 있습니다. 대조적으로, 현저한 세포 골격 스트레스 섬유를 갖는보다 편평한 사각 형태를 채택한 MSCs는 신경 세포의 운명을 쉽게 받아들이지 않으므로 버려야한다. 일?...

신경 progenitors과 그 유도체의 이식은 외상성 신경 손상 1 , 2 및 neurodegeneration 3 , 4 후 치료 전략으로 약속을 보여줍니다. 임상 적용 전에, i) 줄기 / 전구 세포의자가 공급원에 접근하고 확대하기위한 방법과 ii) 관련성이 있고 성숙한 세포 유형으로 그들을 안내하는 수단 3)을 보장하는 것이 필수적이다. 척수 손상에 대한 세포 치료에 대한 우리의 관심은 성인 조직으로부터의 강력한 신경 전구 세포 공급원을 찾기 위해 노력했다. MSCs의 subpopulation은 신경 볏에서 유래하고 쉽게 골수강에서 접근 가능합니다. 이 세포들은 뉴런과 glia 5 를 생성 할 수있는 신경 전구 세포입니다. 뇌 허혈의 동물 모델은 저산소증이 prol<html> 뇌 내부의 신경 progenitors의 iferation 및 multipotency 6 . 이것은 골수 유래 신경 전구 세포를 확장시키는 수단으로서 저산소 전처리를 이용하는 기초였다. 손상된 척수에 Schwann 세포를 이식하면 재생이 촉진됩니다 2 . SCLCs는 gliogenic 요인 ( ie, β-Heregulin, bFGF, 및 PDGF-AA)에 보충 교재에 의하여 MSCs에서 생성 할 수 있고 그러나 표현형 불안정성을 설명 할 수있다. 성장 인자를 제거하면 섬유 아세포 유사 표현형으로 되돌아 간다. 표현형의 불안정성은 세포 이식에서 바람직하지 않은데, 이는 분화 및 발암의 위험이 있기 때문이다. Schwann 세포 전구체는 배아 말초 신경 8 내의 축삭 번들과 관련이 있기 때문에, 우리는 정화 배아 DRG 뉴런과 함께 공동 배양 SCLCs 7 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 9. 결과 성숙 Schwann 세포는 운명 - 약혼 및 시험관 기능 7 , 9 및 생체 내 10 기능을 보여 줍니다. MSCs에서 신경 progenitors의 농축에 대한 우리의 프로토콜은 간단하고 효율적이며 이후의 assays에 대한 세포 번호의 증가 결과입니다. coculture 플랫폼을 통한 운명을 결정한 Schwann 세포의 유도는 glial differentiation의 연구와 잠재적 인 임상 적용을위한 안정되고 기능적인 Schwann 세포의 생성을 가능하게합니다.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor (NGF)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF domain (&amp;beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2&#039; - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td></tr><tr><td>6-well plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Used for expansion of MSCs following passaging</td></tr><tr><td>UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Used for neural progenitor enrichment</td></tr><tr><td>anti-human CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-human nestin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&amp;beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

이 원고는 골수 간질 세포 (MSC) 집단으로부터 신경 전구 세포를 풍부하게하고 나중에 성숙한 슈반 세포 운명으로 인도하는 방법을 설명합니다. 우리는 랫드 및 인간 MSC에 일과성 저산소 상태 (16 시간 동안 1 % 산소)를 투여 한 후 상피 세포 성장 인자 (EGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 보충과 함께 낮은 부착 기질에 신경근으로 확장시켰다. Neurospheres는 poly-D-lysine / laminin 코팅 조직 배양 플라스틱에 뿌리고 Schwann cell-like cells (SCLCs)를 생성하기 위해 β-Heregulin, bFGF 및 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)가 포함 된 gliogenic cocktail에서 배양 하였다. SCLC는 E14-15 임신 Sprague Dawley 쥐에서 얻은 정제 된 Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런으로 2 주간 공동 배양을 통한 운명을 유도했다. 성숙한 Schwann 세포는 S100β / p75 발현에 지속성을 나타내며 미엘린 분절을 형성 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생성 된 셀은 잠재적 인 a질병 모델링뿐만 아니라 척수 손상 후자가 세포 이식에서의 응용.

프로토콜의 핵심 단계에 대한 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. 요약하면, 랫 및 인간 MSC는 조직 배양 플라스틱을 준수하여 선택됩니다. 확장 된 MSC는 저산소 상태로 전제 조건을 지키고 뉴로 스피어 형성 조건의 영향을받습니다. Neurospheres는 도금되어 SCLCs로 분화 할 수 있습니다. SCLC는 정제 된 DRG 뉴런과 함께 배양되어 운명의 ...

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Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K 조회수.  The University of Hong Kong.  골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다. 

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

연구

신경과학

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

생체공학

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

면역학 및 감염병학

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

생물학

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

<meta charset="utf8"></head><body>방사선 조사된 마우스에서 효과적인 HSCT를 위한 골오가노이드 유래 세포

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 쥐의 골수 연구를 위한 대퇴 내 주사

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

요약

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E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능