이 작품은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (보조금 번호 154833) 및 Universidad Nacional Autónoma de México에서 지원되었습니다. 저자는 Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos 및 Soledad Juárez에게 행정적이고 기술적 인 조언을 해주신 것에 감사드립니다.

1. CAPRRESI 프로토콜 참고 : 그림 1 은 전체 CAPRRESI 프로토콜을 나타냅니다. 이 기술은 in silico 디자인과 원하는 키메라의 후속 구성을 기반으로합니다. <ol><li> 클로닝 플라스미드, pUC18 또는 pUC19의 선택. <ol><li> 기술적 인 요구에 가장 적합한 pUC 벡터를 선택하십시오. 참고 : 두 벡터는 다중 복제 사이트의 방향을 제외하고는 동일한 순서를 갖습니다. 이것은 올리고 뉴클레오티드의 디자인과 PCR 플라스미드 파괴에 중요합니다. </li></ol></li><li> 야생형 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열에 대한 in silico 분석. <ol><li> 야생형 유전자의 DNA 서열을 얻어 FASTA 형식 파일 ( 예 : genes.fas)에 저장하십시오. 참고 : pUC18 / 19 벡터의 시퀀스는 pUC.fas 파일에 포함되어 있습니다 ( 그림 1 , 1 단계). </li><li> 어떤 제한 enz 결정ymes는 REsearch.pl 스크립트를 실행하여 wildtype 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열을 절단하지 않습니다. 또는 온라인 도구로 제한 효소 사이트 검색을 수행하십시오 ( 그림 1 , 2 단계). <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl REsearch.pl 유전자. perl REsearch.pl pUC.fas 참고 :이 명령은 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas 및 pUC_re.fas. </li><li> genes_re.fas와 pUC.fas 파일을 비교하여 선택한 pUC18 / 19 벡터의 다중 복제 사이트로 wildtype 유전자를 복제하기위한 적절한 제한 효소를 선택하십시오. pUC18 / 19 벡터의 암피실린 내성 유전자 ( ampR )에 상대적인 인서트의 방향을 선택하십시오. </li></ol></li><li> 야생형 유전자 (외부 올리고 뉴클레오타이드)의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 포워드 및 리버스 올리고 뉴클레오티드를 디자인하십시오. 각 5 &#39;말단에 적절한 제한 효소 부위를 포함시킨다.올리고 뉴클레오티드; 이것은 삽입 방향을 정의합니다. <ol><li> 포워드 올리고 뉴클레오타이드에 기능적 리보솜 결합 부위를 포함시킨다. </li><li> 벡터 내에서 동일한 방향으로 두 야생형 유전자를 삽입하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택. <ol><li> translate.pl 스크립트 ( 그림 1 , 3 단계)를 실행하여 wildtype과 ampR 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl translate.pl 유전자. perl translate.pl ampR.fas 참고 :이 스크립트는 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_aa.fas 및 ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> 두 가지 야생형 아미노산 서열을 적절한 소프트웨어 ( 예 : 근육)로 전역 정렬하십시오. </li><li> 키메라 asse에 대한 원하는 휴식 영역 (3-6 아미노산)을 선택하십시오mbly. 파일을 FASTA 형식의 파일 ( 예 : regions.fas)에 저장하십시오. </li><li> 두 가지 야생형 유전자에서 선택된 아미노산 스트레치를 코딩하는 DNA 서열을 찾습니다. </li></ol></li><li> 제한 효소 사이트를 포함하는 동의어 DNA 시퀀스의 in silico 세대. <ol><li> 절단 영역으로 선택된 각 아미노산 서열 스트레치를 코드하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 4). 이러한 시퀀스는 regions.fas 파일에 저장됩니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl synonym.pl regions.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn.fas 출력 파일을 만듭니다. </li></ol></li><li> 동의어 DNA 서열에서 발견되는 제한 효소 부위를 검색하십시오. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오 : perl REsynonym.pl regions_syn.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn-re.fas 출력 파일을 만듭니다.. </li></ol></li><li> 두 야생형 유전자의 동의어 시퀀스간에 공유되는 하나의 제한 효소를 선택하십시오. 이 사이트는 제한 효소 소화를 통해 키메라를 조립하는 데 사용됩니다. 선택된 제한 효소가 야생형 유전자 나 pUC18 / 19 벡터 서열을 절단하지 않는지 확인하십시오. <ol><li> genes_re.fas, pUC_re.fas 및 regions_syn-re.fas 파일에있는 제한 효소를 비교하십시오. </li></ol></li><li> 실 리코 (Silico) 에서는 원산지를 두 야생형 유전자의 상응하는 유전자좌에서 동의어 DNA 서열로 대체합니다. synonym DNA sequence를 wildtype sequence file (genes.fas)에 추가합니다. </li><li> gene.fas 파일 ( perl translate.pl genes.fas )에 포함 된 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. </li><li> 야생형과 동의어 DNA 서열에서 번역 된 아미노산 서열을 정렬합니다. 두 시퀀스가 ​​동일한지 확인하십시오. </li><li> pU에 존재하는 ampR 유전자를 가지고이 절의 모든 단계를 반복하십시오C18 / 19 벡터입니다. 참고 : 목표는 ampR 유전자 (ampR.fas 파일)를 두 개의 보완적인 부분으로 나누는 것입니다. ampR 유전자를 파괴하기 위해 선택되는 제한 효소는 키메라 조립에 사용 된 제한 효소와 달라야 한다. </li></ol></li><li> 두 개의 야생형 유전자를 선택된 pUC18 / 19 벡터에 독립적으로 클로닝 (그림 1, 단계 3). <ol><li> 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 선택한 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 정제하십시오. <ol><li> 예를 들어, pUC18 플라스미드로 E. coli DH5α를 형질 전환시키고, 형질 전환 체를 고체 LB-0.3 mg / mL 암피실린 (Amp)상에서 37 ℃에서 밤새 성장시킨다. 형질 전환 콜로니를 선택하고 새로운 LB-0.3 mg / mL Amp 플레이트를 접종하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오. </li><li> 이전의 배양 물을 섭취하고 37 ℃에서 6 ~ 8 시간 동안 액체 LB-0.3 mg / mL Amp에서 배양하십시오. 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li><li> PCR은 approp를 사용하여 총 게놈 DNA에서 야생형 유전자를 증폭외부 oligonucleotides를 riate. 가능한 경우 높은 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하십시오. 수율을 최대화하는 DNA 중합 효소를 선택하십시오. 제조업체의 지침과 올리고 뉴클레오타이드의 용융 온도에 따라 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 사용 된 DNA 중합 효소, 앰플 리콘 크기, 주형 및 올리고 뉴클레오티드에 따라 PCR 사이클을 실행하십시오. 예를 들어, rpoD DNA를 증폭 하려면 50 μL 반응을 준비하십시오 : 10 μ 버퍼 5 μL, 50 mM MgSO 4 2 μL, 10 mM dNTP 믹스 1 μL, 각 10 μM 올리고 뉴클레오티드 2 μL (표 2), 2 템플릿 DNA ( 대장균 DH5α 총 DNA) μL, 초순수 35.8 μL, 고 충실도 DNA 중합 효소 0.2 μL를 넣었다. 다음 PCR주기를 실행하십시오 : 초기 변성을 위해 94 ℃에서 1 분, 30 사이클의 증폭 (94 ℃에서 30 초 변성, 60 ℃에서 30 초, 올리고 뉴클레오티드 어닐링, 68 ℃에서 2 분) 확장). </li><li> 1.2 g의아가로 오스에 두 배 증류수 100 mL에 넣고 전자 레인지로 가열한다. 젤 받침대를 조립하고 빗을 수평 젤 캐스터에 넣으십시오. 겔 트레이에 용융 된 아가로 오스 용액을 채우고 고형화하십시오. 빗을 제거하십시오. </li><li> 전기 영동 챔버에 젤을 넣으십시오. 1x Tris-acetate-EDTA 완충액으로 챔버를 채 웁니다. 겔 우물에 PCR 제품 50 μL를로드합니다. 시료를 전기 영동하십시오 ( 예 : 110V에서 1 시간). </li><li> 전기 영동 후 느린 흔들림으로 1 mg / mL ethidium bromide 용액 100 μL를 포함하는 2 회 증류수 100 mL에서 10 분간 겔을 염색한다. 느린 흔들림에서 두 번 증류수로 겔을 10 분 동안 씻으십시오. 수평 쉐이커를 사용하십시오. 주의 :에 티듐 브로마이드는 독성 화합물입니다. 보호용 장갑과 면화 실험용 코트를 착용하십시오. </li><li> 키트를 사용하여 젤의 해당 밴드에서 야생형 유전자 DNA를 정제하십시오. 얼룩이 진 젤을 UV 챔버에 넣음으로써 밴드를 시각화하십시오 (권장 파장 : 300 nm). 젤의 노출을 최소한으로 유지하십시오. DNA 정제 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 주의 : 자외선은 위험합니다. 보호용 방패, 안경 및 면화 실험 코트를 착용하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 야생형 유전자와 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 제조자의 지침에 따라 제한 효소로 분해하십시오. 가능한 경우 빠른 소화 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 10 μL의 초순수, 2 μL의 10X 버퍼, 1 μL의 Kpn I 제한 효소 및 1 μL의 Xba I 제한 효소에서 6 μL의 pUC18 DNA (300 ng / μL)를 소화 합니다. 반응을 37 ℃에서 30 분간 둔다. <ol><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, 이중 소화 반응 Kpn I- Xba I을 80 ℃에서 5 분 동안 비활성화시킨다. </li></ol></li><li> 믹스 인서트 : 체적 비율의 벡터 DNA3 : 1이다. 라이 게이션 반응에 대해서는 제조업체의 지침을 따르십시오. 가능한 경우 빠른 연결 효소를 사용하십시오 (25 분 동안 반응을 10 분 동안 그대로 두십시오). 참고 : 일반적으로 키트를 사용한 정제 후 DNA 농도는 소화 및 라이 게이션 반응에 충분합니다. 예를 들어, rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 6 μL, pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 3 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 1 μL 물, 및 T4 DNA 리가 아제 1 μL. 25 ° C에서 10 분 동안 연결 반응을 남겨주세요. </li><li> Supplementary Materials에 설명 된대로 2 ~ 4 μL의 라이 게이션 반응으로 대장균 DH5α를 형질 전환하십시오. 형질 전환 된 세포를 고체 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에 플레이트한다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 보충 교재에 설명 된대로 반응을 시퀀싱 할 후보를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 후보자로부터 플라스미드 DNA를 추출하십시오. 또는 인서트를 클로닝하기 위해 사용 된 것과 동일한 제한 효소로 후보 플라스미드 DNA를 분해하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 공급자가있는 시퀀스 후보 구성 10 . DNA 어셈블러 11 ( 그림 1 , 단계 5)을 사용하여 silico로 서열 을 조립하십시오. </li></ol></li><li> PCR에 의한 플라스미드 파쇄와 제한 효소 소화. <ol><li> 야생형 및 ampR 유전자의 경우 브레이크 영역에서 전방 및 후방 올리고 뉴클레오타이드를 각각 디자인하십시오. silico 에서 해당 동의어 DNA 서열 (1.4 단계에서 얻음)에 대해 야생형 단편을 대체하십시오. 참고 :이 동의어 DNA 서열은 제한 효소 부위를 포함합니다. 정방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드는 t그는 효소 부위를 제한한다. 올리고 뉴클레오타이드는 21-27 개의 뉴클레오티드, 시토신 또는 구아닌으로 끝나야하며, 제한 효소 부위를 포함해야한다. 순방향 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 그 표적 부위와 동일한 서열을 갖는다. 역전 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 표적 부위의 역 상보 서열이다. </li><li> PCR 반응 ( 예 : pUC18 rpoD 및 pUC18 sigA )에 대한 DNA 템플릿으로 두 wildtype 유전자 구조를 사용하십시오. 각 구조물 (pUC18 rpoD σ1- σ2 , pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 및 pUC18 sigA σ3-σ4)의 두 가지 보완 부분을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 6). </li><li> DNA 샘플을 아가로 오스 겔 1-1.2 % [w / v]에 넣으십시오. 전기 영동 ( 예, 110V에서 1 시간)에 의해 DNA 주형으로부터 PCR 생성물을 분리한다. 또는 Dpn I로 PCR 반응을 분해하여 DNA 주형을 파괴 할 수 있습니다. 참고 : DpnI 효소는 메틸화 된 DNA 서열 (5&#39;-GATC-3 &#39;)만을 인식합니다. <ol><li> DNA 정제 키트를 사용하여 샘플을 정제하십시오. 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 모든 상보 적 DNA 단편을 적절한 제한 효소로 이중 절단하십시오. 가능한 경우 빠른 분해 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 제조사의 프로토콜을 사용하여 Afl II 및 Spe I로 pUC18rpoDσ1-σ2 DNA 단편을 이중 절단하십시오. 37 ° C에서 15 분 동안 소화 반응을 남겨 둡니다. </li><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, Afl II Spe I을 80 ℃에서 20 분 동안 비활성화시킵니다. </li></ol></li><li> DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. <ol><li> 원하는 키메라 유전자를 조립하기 위해 용적 1 : 1 비율로 적절한 DNA 조각을 섞는다.1, 단계 7). 참고 : 이렇게하면 ampR 유전자의 무결성이 복원되어 기능성 단백질을 생성합니다. <ol><li> 예를 들어 pUC18 rpoD σ1- σ2 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL로 분해 됨) 4 μL, pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 4 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 2 μL 및 T4 DNA 리가 제 1 μL; 키트 정제 후 DNA 농도는 소화 및 후속 연결에 충분합니다. 라이 게이션 반응을 25 ℃에서 10 분 동안 남겨 두십시오. </li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 연결 반응 (보충 자료) 3 ~ 5 μL와 대장균 DH5α를 변환합니다. 37 ° C 밤새 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에서 변형 세포를 성장시킵니다. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 37시에 하룻밤 사이에 둡니다.기음. </li><li> 보충 교재에 설명 된대로 시퀀싱 반응에 대한 후보자를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 전기 영동 (단계 2.3.2.1에서 설명)을 수행하여 1-1.2 % (w / v) 아가로 오스 겔에서 밴드를 시각화하십시오. </li><li> 긍정적 인 후보자로부터 문화를 성장시킵니다. 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li></ol> 2. 서열 후보 키메라 구조물 <ol><li> 플라스미드 DNA의 품질이 서열 분석 서비스 제공자의 지침에 따라 서열 분석 반응에 충분한 지 확인하십시오. 정화 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 예를 들어, 시퀀스 서비스 제공 업체의 인터넷 페이지에서 샘플에 대해 권장되는 DNA 농도에 특히주의하십시오. DNA 정량 도구를 사용하여 시료의 농도를 구하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 제공 업체와의 서열 후보 키메라 구조 10 . </li><li> se 조립<html> in silico DNA 어셈블러 11을 사용하여 읽기를 시작합니다. </li><li> 서열 정렬 도구 9 , 12를 사용하여 실 리코 설계 키메라 시퀀스 대 어셈블 된 어레이를 정렬합니다. 키메라 유전자가 성공적으로 융합되었는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 준비하기 참고 : 살아있는 세포와 관련된 모든 단계는 분젠 버너가 켜져있는 깨끗한 층류 후드에서 수행되어야합니다. <ol><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 생산. <ol><li> 대장균 - 경쟁 세포를 생산하기 위해서는 공개 된 프로토콜 13을 따르거나 보충 자료를 참조하십시오. 또는 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 형질 전환. <ol><li> 대장균 배양 물의 화학적 형질 전환을 위해, 공개 된 프로토콜을 따른다.class = &quot;xref&quot;&gt; 13 또는 보충 자료 참조. 또는 박테리아 형질 전환을 위해 일렉트로 포 레이션을 사용하십시오. 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하는 경우에는 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> E. coli DH5α로부터 게놈 및 플라스미드 DNA 정제. <ol><li> 보충 교재에 명시된대로 핵산 추출을 시중에서 구할 수있는 키트를 사용하거나 출판 된 프로토콜을 사용하십시오 13 . </li></ol></li><li> 식민지 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 이 기술을 사용하여 후속 시퀀싱 반응을위한 후보 형질 전환 콜로니를 확인하십시오. 참고 :이 방법은 서열의 무결성에 대한 최종 검증을 나타내지 않습니다. 이 기술에 대한 자세한 설명은 보충 자료 에서 제공됩니다. </li></ol></li><li> 솔루션 준비. <ol><li> 만나다 <strong&gt; 솔루션 준비에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> CAPRRESI 프로토콜에 필요한 스크립트 및 시퀀스 파일을 다운로드하십시오. <ol><li> 원하는 종의 완전한 게놈 서열을 포함하는 유전자 뱅크 파일을 다운로드하고, 게놈 브라우저를 사용하여 선택한 유전자의 DNA 서열을 추출하여 fasta 파일 형식으로 저장하십시오. CAPRRESI 프로토콜에 필요한 Perl 스크립트를 다운로드하십시오. 스크립트와 시퀀스 파일을 같은 디렉토리에 저장하십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

CAPRRESI는 PRM 2 의 대안으로 설계되었습니다. 원본 PRM은 강력한 기술입니다. 그것은 선택된 유전자의 어떤 부분을 따라 DNA 서열의 융합을 허용한다. PRM의 경우 야생형 유전자를 동일한 플라스미드에 클로닝해야합니다. 그 후, 올리고 뉴클레오타이드는 플라스미드에서 발견되는 야생형 및 항생제 내성 유전자 내에서 설계된다. 플라스미드 혼란은 둔기가 끝난 고 충실도의 DNA 중합 ...

키메라 유전자 어셈블리는 단백질 기능을 밝히고 생물 공학적 목적으로 분자 생물학에서 널리 사용되어왔다. 중첩 PCR 산물 증폭 1 , 플라스미드 회수 2 , 상 동성 재조합 3 , CRISPR-Cas9 시스템 4 , 부위 유도 재조합 5 및 깁슨 어셈블리 6 과 같은 유전자 융합에 대한 다른 방법이있다. 이들 각각은 서로 다른 기술적 이점을 제공합니다. 예를 들어 중복 된 PCR 디자인의 융통성, 플라스미드 회복 동안 구조의 생체 내 선택, CRISPR-Cas9 및 Gibson 시스템의 고효율성 등이 있습니다. 반면에 이러한 방법 중 일부를 수행하는 동안 약간의 어려움이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 처음 두 접근법은 둔기가 끝난 DNA 단편에 의존하며 이러한 유형의 산물의 결찰은 stic에 비해 기술적으로 어려울 수 있습니다연말 결찰. Site-directed 재조합은 Creoxox 시스템과 같이 원래 DNA 서열 (흉터)의 흔적을 남길 수 있습니다 5 . CRISPR-Cas9는 때로는 대상 사이트 4 이외에 다른 게놈 지역을 수정할 수 있습니다. 여기에서 플라즈미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 소개합니다.이 프로토콜은 플라즈미드 회수 방법 (PRM)과 동의어 DNA 서열상의 제한 효소 부위 삽입을 결합하여 결찰 효율을 향상시키는 단백질 코딩 유전자 융합 프로토콜입니다 . 아미노산 서열의 완전성을 보장하기 위해, 제한 효소 부위는 동의어 DNA 서열 연장 부에 삽입된다. CAPPRESI의 이점 중 하나는 일반 실험실 시약 / 도구 ( 예 : 효소, 능력있는 세포, 용액 및 열 순환기)를 사용하여 수행 할 수 있으며 신속한 결과를 줄 수 있다는 것입니다 (적절한 효소가 사용되는 경우). 제한에 의존동의어 DNA 서열로부터 나오는 효소 부위는 관심있는 단백질 내부의 정확한 융합 지점의 선택을 제한 할 수있다. 그러한 경우, 중복되는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 표적 유전자를 융합시키고, 벡터의 내성 유전자에 제한 효소 부위를 삽입해야한다. CAPRRESI는 7 가지 간단한 단계로 구성됩니다 ( 그림 1 ) : 1) 클로닝 벡터 pUC18 또는 pUC19 6의 선택 ; 2) 융합 될 야생형 서열의 실 리코 (silico) 분석; 3) 키메라 조립 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택; 4) in silico 세대의 동의어 DNA 제한 효소 부위를 포함하는 염기 서열; 5) 선택된 플라스미드로의 야생형 유전자의 독립적 인 클로닝; 6) PCR에 의한 플라스미드 파괴,이어서 제한 효소 소화; 및 7) DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. 이 기술로 생산 된 키메라 유전자는 검증되어야한다.ith 시퀀싱. pUC18 / 19 벡터는 작은 크기 ( 즉, 2,686 염기쌍), 높은 카피 수, 유리한 서열화 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 클로닝 및 키메라 조립에 기술적 장점을 제공합니다. 여기에 박테리아 배양이 저렴하고 빨리 자라기 때문에 대장균 (Escherichia coli) 숙주를 사용하여 키메라를 조립하고 처리했습니다. 이를 고려하여, 최종 표적 플라스미드로의 융합 단편의 후속 클로닝 ( 예 : 박테리아의 pRK415 또는 포유류 세포의 pCMV와 같은 발현 벡터)이 필요할 것이다. CAPRRESI는 두 가지 주요 시그마 인자 유전자 인 E. colirpoD 와 Rhizobium etlisigA 를 융합시켜 시험 하였다 . 1 차 시그마 인자는 전사 개시에 관여하는 RNA 중합 효소 서브 유닛이며, 4 개의 도메인 ( 즉, σ1, σ2, σ3, σ4)으로 이루어져있다. 아미노산 서열은 길다.rpoD 및 sigA에 의해 인코딩 된 단백질은 각각 613 및 685이다. RpoD와 SigA는 48 %의 동일성 (98 % 적용 범위)을 공유합니다. 이러한 1 차 시그마 요인은 영역 σ2와 σ3 사이에서 두 개의 보완적인 조각으로 나뉘어졌습니다. 키메라 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4)과 키메라 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3- σ4)의 두 가지 키메라 유전자가이 디자인에 따라 조립되었다. DNA 융합 생성물은 시퀀싱에 의해 확인되었다.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Produces a mix of blunt/3&amp;rsquo;-A overhang ended PCR products</td></tr><tr><td>High pure plasmid isolation kit</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Used for all plasmid purification reactions</td></tr><tr><td>High pure PCR product purification kit</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Used for all PCR purification reactions from agarose gels</td></tr><tr><td>AflII restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Recognizes sequence 5&amp;rsquo;-CTTAAG-3&amp;rsquo; and cuts at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KpnI-HF restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Recognizes sequence 5&amp;rsquo;-GGTACC-3&amp;rsquo; and cuts at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SpeI-HF restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Recognizes sequence 5&amp;rsquo;-ACTAGT-3&amp;rsquo; and cuts at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>XbaI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Recognizes sequence 5&amp;rsquo;-TCTAGA-3&amp;rsquo; and cuts at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Nalidixic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Bacterial cell culture</td></tr><tr><td>Casein peptone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Bacterial cell culture</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>Sodium chloride</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>Bacterial cell culture</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XbaI&lt;/em&gt; restriction enzyme</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Fast digest &lt;em&gt;XbaI&lt;/em&gt; enzyme</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;KpnI&lt;/em&gt; restriction enzyme</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>Fast digest &lt;em&gt;KpnI &lt;/em&gt;enzyme</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Fast DNA ligation kit</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;AflII&lt;/em&gt; restriction enzyme</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Fast digest &lt;em&gt;AflII &lt;/em&gt;enzyme</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;SpeI&lt;/em&gt; restriction enzyme</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Fast digest &lt;em&gt;SpeI &lt;/em&gt;enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion

여기, 우리는 플라스미드 복구 및 제한 효소 사이트 삽입 (카프레 리)에 의한 키메라 조립을 제시한다. CAPRRESI는 원래의 플라스미드 회수 방법의 많은 장점을 활용하고 제한 효소 소화를 도입하여 DNA 라이 게이션 반응을 완화합니다 (키메라 조립에 필요함). 이 프로토콜의 경우 사용자는 야생형 유전자를 동일한 플라스미드 (pUC18 또는 pUC19)에 복제합니다. 키메라가 조립되어야하는 아미노산 서열 영역의 in silico 선택 후, 사용자는 그들을 암호화하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻는다. Ad Hoc Perl 스크립트를 사용하면 사용자가 모든 동의어 DNA 시퀀스를 결정할 수 있습니다. 이 단계 후에 다른 Perl 스크립트는 모든 동의어 DNA 시퀀스에서 제한 효소 사이트를 검색합니다. 이 in silico 분석은 pUC18 / 19 플라스미드에서 발견되는 암피실린 내성 유전자 ( ampR )를 사용하여 수행됩니다. 사용자는 synonym region 내에서 올리고 뉴클레오타이드를 디자인하여 PCR로 wildtype과 ampR 유전자를 파괴합니다. obt 후상보적인 DNA 단편을 정제하고 정제하고, 제한 효소 소화를 수행한다. 키메라 조립은 적절한 상보적인 DNA 단편을 연결함으로써 달성된다. PUC18 / 19 벡터는 작은 크기 (2,686 염기 쌍), 높은 카피 수, 유리한 시퀀싱 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 기술적 이점을 제공하기 때문에 CAPRRESI를 위해 선택된다. 키메라 조립을위한 제한 효소의 사용은 무딘 - 종단 제품을 생산하는 DNA 중합 효소의 필요성을 제거합니다. CAPRRESI는 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

그림 1 은 CAPRRESI를 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 2 개의 키메라 유전자를 2 개의 박테리아 1 차 시그마 인자 ( 즉, 대장균 RpoD 및 R. etli SigA)의 도메인을 교환함으로써 조립 하였다. rpoD 및 sigA 유전자의 DNA 서열은 각각 GenBank 게놈 파일 NC_000913 및 NC_007761에서 Artemis Genome Browser 14 를 사용하여 얻었다. pUC18 벡터의 DNA ?...

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CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

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11.5K 조회수.  Universidad Nacional Autónoma de México.  여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다. 

비디오: CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

연구

생화학

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>분자 생물학 교육 및 기술 향상을 위한 Gibson Assembly 구현

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare students to enter the workforce with modern competencies. In particular, the emergence of Gibson Assembly, a highly customizable and adaptive molecular cloning technique, has advanced the landscape of molecular cloning in numerous research environments. Thus, we created a Gibson Assembly cloning module for deployment in a molecular biology laboratory course at California Polytechnic State University, San Luis Obispo and evaluated student learning outcomes from the module. Over three iterations of the course, students participated in an experiment-based independent project that involved cloning three unique plasmid libraries to support research projects in natural products biosynthesis. Students were given pre- and post-questionnaires to evaluate their understanding of molecular cloning and their confidence in molecular biology terms and techniques. Students&#8217; responses showed a significant increase in both learning molecular cloning concepts and in self-reported confidence with molecular cloning terms and techniques. This module framework can be generalized to teach Gibson Assembly for various applications, providing instructors with a toolkit for teaching an adaptable and emergent cloning technology while advancing their research projects.

<meta charset="utf8"></head><body>Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

An adaptable Gibson Assembly molecular cloning module was employed in a course-based undergraduate research experience (CURE) format for molecular biology laboratory course students. Assessment of student learning outcomes showed improved understanding and confidence in molecular cloning after completion of the CURE, and novel plasmids were cloned for natural product biosynthesis research.&#160;&#160;

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

생체공학

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

면역학 및 감염병학

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA fragments to assemble plasmids. This method functions by transforming DNA fragments with regions of 15-50 bp of homology into commonly used laboratory Escherichia coli strains and the bacteria use the RecA-independent repair pathway to assemble the DNA fragments into a plasmid. This method is more rapid and cost-effective than many molecular cloning methods that rely on in vitro assembly of plasmids prior to transformation into E. coli strains. This is because in vitro methods require the purchase of specialized enzymes and the performance of sequential enzymatic reactions that require incubations. However, unlike in vitro methods, IVA has not been experimentally shown to assemble linear plasmids. Here we share the IVA protocol used by our laboratory to rapidly assemble plasmids and subclone DNA fragments between plasmids with different origins of replication and antibiotic resistance markers.

In vivo assembly is a ligation-independent cloning method that relies on intrinsic DNA repair enzymes in bacteria to assemble DNA fragments by homologous recombination. This protocol is both time and cost-effective, as few reagents are required, and cloning efficiency can be as high as 99 %.

고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

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공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

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Adaptable Molecular Cloning 과정 기반 학부 연구 경험을 통한 학생 결과 개선

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

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고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법