Name: kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

참고 : 포함되지만, 장갑, 보호 안경, 실험실 코트, 적절한 아크릴 방패로, 제한 개인 보호 장비의 사용하지 않는 방사성 물질의 안전한 사용 및 폐기에 관한 모든 기관의 규정을 따릅니다. 참고 : 표준 버퍼가 40 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.5, 50 MM의 칼륨 글루타메이트, 5 mM의 DTT, 0.1 mM의 EDTA (현재의 버퍼가 5 배 농도에서 미리 제조) 각각의 dNTP 0.3 밀리미터로 구성되어 있습니다. T7 복제 단백질 10, 9, 8 바와 같이 정제된다. 단일 T7 프리 메이스 인식 부위 (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;- GTGTC-3&#39;, 5&#39;- TGGTC-3 &#39;)를 함유하는 단일 가닥 DNA는 DNA 합성 다양한 회사 (길이에서 살 수 ssDNA를가 T7의 프리 메이스 위해 선택한 효소에 의존하는 량체는 전체 길이의 프라이머를 합성 최소 템플릿 길이 1애매한 C가 필수적으로, 프라이머는 폴리머 라제에 의해 확장 될 경우 (1)는, 그러나, 부가적인 뉴클레오티드는 템플릿의 3 &#39;말단에 존재한다. 반응은 10 밀리미터의 MgCl 2의 최종 농도로 첨가하여 개시하고, 25 ℃에서 배양된다. 수동 샘플링은 5 초 이상의 시간이 점을 잘 작동합니다. 보다 짧은 시간 포인트가 필요한 경우, 정확하게 데이터를 획득하기 위해 급속 급랭 흐름 수단을 사용할 것을 권장한다. 수동 샘플링 1. 다중 매출 프라이머 합성 반응 <ol><li> 실험을 시작하기 전에, 포름 아미드 염료 버퍼의 나누어지는 2 μL (93 % (v / v)의 포름 아미드, 50 mM의 EDTA, 0.01 %의 크실렌 cyanol과 파란색 0.01 % 브로 모 페놀) 8 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에. 일반적으로, 튜브의 수는 분석 시간 점의 수와 동일하다. </li><li> , 1X 버퍼, 0.1 mM의 ATP 및 CTP 0.25 mCi의 / ㎖ [α- 32 P] CTP 이루어진 20 μL 혼합물을 제조 0.1 μM SSD(헥사 농도로 표현 - 0.6 μM 모노머) NA 템플릿, 0.1 μM GP4. </li><li> 5 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션. </li><li> 피펫을 사용하여 혼합물의 2 μL를 제거하고 아무 반응 제어 (시간 제로)에 대한 단계 1.1 준비 1.5 ML의 튜브에 2 μL 포름 아미드 염료 버퍼와 혼합. </li><li> (10 mM의 최종 농도), 반응 혼합물을 0.1 M의 MgCl 2 2 μL를 추가한다. </li><li> 수동으로 10 초 간격으로 피펫을 이용하여 상기 반응 혼합물을 2 μL 샘플을 인출하고, 단계 1.1의 제조 1.5 ㎖의 튜브에 미리 분배 포름 염료와 혼합한다. </li><li> 열 블록에서 5 분 동안 95 ℃에서 가열 된 샘플. </li><li> 변성 겔에 샘플의 분취 량을로드합니다. 비스 아크릴 아미드 다음 T7의 프리 메이스 합성 작은 tetraribonucleotide 프라이머 제품은 0.4 mm에서 잘 두께의 25 % 아크릴 아미드 해결 (19 : 1), 3 M 우레아, 1X TBE (100 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA). </li><li> chromatogra에 전체 젤 배치플라스틱 랩과 PHY 종이 커버. 겔 건조기를 사용하여 건조 겔. </li><li> 반응 혼합물의 나머지의 희석 계열을 조제하고 크로마토 그래피 용지에 겔에 로딩 동일한 볼륨 자리, 즉 시료 4 μL 넣고, 경우 희석 4 μL 자리. 주 :이 반응 동안 형성된 생성물의 농도를 결정하는 표준 곡선이 될 것이다. 예를 들면, TE 완충액 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA)의 범위에 걸쳐 잘 작동하여 5 배 희석하여 1:25으로 : 15,625 (5 2 -5 6)하지만 희석해야 활동 레벨에 따라 조절 될 수있다. </li><li> 은 phosphorimager 화면을 사용하여 건조 겔 및 표준을 노출. 12 희석 시리즈의 방사능을 정량화 8 바와 같이 표준 곡선을 만들 주 : 상기 반응 혼합물을 T7 DNA 폴리머 라제 포함될 하나 EXA 받을수내이 효소에 의해 tetraribonucleotide 프라이머의 사용. 최적의 폴리머 농도는, 상기 데이터의 해석을 단순화하도록 포화되어야한다. 0.4 μM 이상의 폴리머 농도는 양호한 결과를 준다. 또한, 이러한 프라이머를 합성 또는 후행 가닥 개시하거나 단일 가닥 DNA 결합 단백질과 같은 다른 단백질의 효과가이 방식으로 측정 될 수있다. </li></ol> 신속한-급랭 악기를 사용하여 2. 다중 매출 프라이머 합성 반응 <ol><li> 반응 혼합물의 제조 <ol><li> 1X 버퍼, 0.2 mM의 ATP와 CTP가 (CTP [32 P α- 0.5 mCi의 / mL를 포함하여 0.2 μM GP4의 헥사, 0.2 μM ssDNA를 템플릿, 0.6 밀리미터의 dNTPs를 포함하는 용액 A의 400 μL를 준비합니다. </li><li> 1X 버퍼와 20 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 용액 B의 400 μL를 준비합니다. </li></ol></li><li> 급속 급냉 흐름 장비 운영 <ol><li> 랩을 켭니다ID-급냉 흐름 계측기; 메인 메뉴가 나타납니다 후, 악기 키보드 타입 7은 홈 위치로 주사기 드라이버를 이동합니다. </li><li> &quot;LOAD&quot;열기 버퍼 주사기 위치. </li></ol></li><li> 로드 버퍼 주사기 <ol><li> 드라이브 주사기 포트에 10 ML의 주사기 포함하는 버퍼를 연결합니다. &quot;LOAD&quot;에 주사기 손잡이 위치를 변경합니다. </li><li> 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 10 mM 트리스, pH가 7.5, 1 mM의 EDTA로 구 버퍼 탱크 A와 B를 입력하고 종결 용액 (250 mM의 EDTA, 0.2 % SDS)와 주사기 C 채운다. 과에서 플런저를 눌러 기포를 제거합니다. </li><li> &quot;FIRE&quot;로 변경 노브의 위치. 유형 2는 주사기 드라이버 막대의 위치를 ​​조정합니다. 를 눌러 버퍼가 종료 루프 나올 때까지 주사기를 낮추는 버튼을 &quot;DOWN 조정&quot;(계속 아래로 7-간다 8-큰 스텝 다운 9 - 작은 단계 아래로). 주 메뉴로 돌아갑니다 &quot;ESC&quot;를 입력합니다. </li></ol></li><li> 세척 튜브 <ol><li> AT &amp; T는진공에 ACH 출구 라인. 샘플 노브를 &quot;FLUSH&quot;로 변경. 수평 위치 노브를 설정 닫기 버퍼 주사기입니다. 진공의 전원을 켜고 10 초 동안 H 2 O의 2 플러시 루프를 찍어, 다음 10 초 동안 메탄올에 찍어. ~ 15 초 동안 공기를 흡입하여 건조 루프, 또는 건조까지. </li></ol></li><li> 로드 샘플 <ol><li> &quot;LOAD&quot;로 변경 샘플 손잡이 위치. 1 ML의 주사기에 용액 A를 놓습니다. 샘플로드 포트 중 하나에 연결 주사기. 용액 B 반복, 반대 샘플로드 포트에 넣습니다. </li></ol></li><li> 시간 점의 컬렉션 <ol><li> 메인 메뉴에서 급냉 흐름 실행에 대해 1을 입력합니다. 반응 시간 (들)를 입력하고 Enter 키를 누릅니다 &quot;ENTER&quot;. 반응 루프 번호가 표시됩니다 사용할 수 있습니다. 필요한 반응 루프로 전환합니다. 단계 2.2.4에서 반복 세척 절차. </li><li> 샘플 노브에 &quot;LOAD&quot;를 켭니다. 로드 반응은 중앙 혼합 구획 외부까지 샘플 루프에 혼합합니다. 모든 노브를 돌려을 &quot;FIRE는 &quot;. 모든 노브가 올바른 위치에 있는지 확인합니다. </li><li> 출구 루프의 끝 부분에 1.5 mL의 튜브를 놓습니다. 눌러 반응을 실행하는 &quot;GO&quot;. 단계 2.2.4에서 반복 세척 절차. 그들이 드라이버를 칠 때까지 버퍼 주사기 A와 B를 다시로드합니다. </li><li> 원하는 각 시점에 대한 단계를 반복 2.2.6.2-2.2.6.3. 예외 : 시작 시약 제로 시간 포인트 컨트롤을 담금질 (즉,이 경우의 MgCl 2) 함유 용액을 넣지 마십시오. </li><li> 샘플을 수집이 완료되면 주 메뉴로 돌아갑니다 &quot;ESC&quot;를 입력합니다. 보도는 &quot;7&quot;홈 위치로 버퍼 주사기 드라이버를 돌아갑니다. </li></ol></li><li> 악기 청소 <ol><li> 반응 혼합물을 주사기를 제거합니다. 샘플 로딩 노브에 &quot;LOAD&quot;위치로 돌립니다. 진공에서 10 mL의 0.3 NH 3 PO 4, 10 mL의 메탄올 다음 10 mL의 0.2 N NaOH로 각 샘플 루프를 씻는다. </li><li> 에 &quot;LOAD&quot;위치 주사기의 손잡이를 돌립니다. 3 SYR 아래로 눌러인게 플런저는 반응 급랭 버퍼를 검색 할 수 있습니다. 워시는 두 배 이상 5 ㎖ H 2 O와 주사기. </li><li> 5 ㎖ H 2 O 다시 주사기를 입력하고이 &quot;FIRE&quot;위치 노브를 돌립니다. 손잡이 위치를 변경하고 단계 2.2.4에서와 같이 세척 H 2 O를 제거하기 위해 진공을 켭니다. 기기의 전원을 끄십시오. 참고 : 단계 1.7-1.12에 설명 된대로 제품을 분석하고 있습니다. 또한, T7 DNA 폴리머 라제 및 다른 복제 단백질 프라이머 합성 또는 신장에 미치는 영향을 분석하기 위해 반응 혼합물에 첨가 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 단일 매출 프라이머 합성 반응 참고 : 단일 매출 프라이머 합성 / 확장 분석은 몇 가지 중요한 차이, 다중 회전율 반응과 동일한 방법으로 실시됩니다 이러한 분석은 기판 그러나 농도, 프라이머 또는 확장 제품에 방사성 표지 된 ATP의 전환을 따라 단백질 considera 있습니다BLY 높은. 또한, 프라이머의 합성 반응의 분석을 허용 밀리 초 분해능을 달성하기 위하여, 하나는 급속 급랭 유동 시스템을 활용한다. <ol><li> 반응 혼합물의 제조. <ol><li> 1X 버퍼, 3 μM GP4 헥사, 6 μM ssDNA를 템플릿, 0.6 밀리미터의 dNTPs, 1 mM의 CTP, 2 nM의 [P (32) γ-] ATP를 포함하는 용액 A의 400 μL를 준비합니다. 1X 버퍼와 20 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 용액 B의 400 μL를 준비합니다. </li></ol></li><li> 빠른-급냉 흐름 작업 <ol><li> 단계 2.2에 설명 된대로 반응을 실시한다. 원하는 경우, 각각 15 μM 및 20 μM의 농도에서 T7 DNA 폴리머 라제 T7 또는 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 추가한다. 이 경우, 신장 산물은 반응 수동 샘플링을 허용하는 시간 체계에 축적된다. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 비선형 이내로 할에 맞춤 제품 진행 곡선최소 제곱 할 수있는 맞는 및 / 또는 수치 적분을 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 사각형 모델. 동작의 상세는 사용 된 소프트웨어에 따라 변화하지만, 이하의 데이터를 피팅에 사용되는 식의 일반화 된 형태이다 것이다. </li><li> 선형 방정식 곡선을 진행 맞는 여러 매출 프라이머 합성 반응의 생성물 형성의 속도를 결정합니다. 중요한 곡률이있는 경우, 단일 지수 함수에 데이터를 피팅하여 초기 속도에있어서 13, 14을 사용, Y는 (예 - 케이 t) = Y는 제품의 농도이고, A는 반응의 진폭은 K가된다 관찰 된 속도 상수, t는 시간 (초)입니다. 시각 = 0에서의 접선의 기울기의 초기 속도이다. 참고 : 선형 방정식 또는 이전 정상 상태 버스트 방정식에 맞추기 미리 정상 상태 프라이머 합성 반응은 Y는 (예를 들어 = - 케이 BU를A는 반응 진폭 첫 t) + 속도 SS (t)가, K 버스트는 전 정상 상태 버스트에 대한 관찰 된 속도 상수이며, 속도 SS가 정상 상태 속도 SS = K 고양이 [효소])이며, t는 시간이다 (초)입니다. (- 케이 t 전자) 단일 매출 프라이머 합성 반응은 단일 지수 함수 y를 = A에 곡선을 진행 장착한다. GP4의 경우, 시판되는 소프트웨어를 이용하여, 각 중간 효소와 평형을 이루는 세 NTP 축합 단계와 모델, 수치 적분 (15)에 의해 데이터를 장착한다. </li></ol>

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	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 실험을 수행하는 가장 중요한 요소는 고도로 정제 된 효소 활성의 이용이다. GP4과의 작업 중에, 예를 들어, -20 ℃에서 50 % 글리세롤을 함유하는 완충액에 정제 된 효소의 스토리지 (20 mM의 인산 칼륨, pH가 7.4, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT)을 찾았의 감소를 초래 몇 개월 동안 준비의 특정 활동. 따라서 우리는 이제 정제 된 25 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA, 1 mM의 TCEP에 GP4, 10 % 글?...

DNA의 복제는 모든 세포 삶의 보존 기능입니다. 복제 구성 요소의 ID와 수가 매우 다양하지만, 일반적인 메커니즘이 진화 1에서 공유됩니다. 여기에서는 T7 replisome의 구성 요소에 의해 시험관 내에서 지체 가닥 DNA 합성의 속도론을 이해 목표 방사성 기질을 사용하여, 겔 기반 불연속 동역학 실험을 설명한다. 박테리오파지 T7의 복제 장치는 네 단백질합니다 (DNA 중합 효소, GP5, 그 processivity 인자 대장균 오레 독신, 관능 프리 메이스-헬리 케이즈 GP4 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질, GP2 이루어진 매우 간단하다. 5) 2. 이 기능은 DNA 복제에 관여하는 보존 생화학 적 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 시스템을 만든다. 특별한 강조가 T7 DNA에 의해 리보 뉴클레오티드 프라이머의 형성에 배치는 비판적를 프리 메이스DNA 합성의 개시를 L 단계. 또 하나는, 반응 혼합물을 포함하여 T7 DNA 중합 효소 또는 다른 복제 단백질에 의한 이들 프라이머의 사용을 검토 할 수있다. 프리 메이스 T7-헬리 케이즈는 GP4는 프리 메이스 인식 부위 또는 PRS 불리는 특정 DNA 서열의 DNA 합성을위한 프라이머의 형성 (5&#39;-GTC-3 &#39;)를 촉매한다. PRS에서 시토신은 위치의 인식을 위해 필수적이다 애매한 있지만 제품 (3)에 복사되지 않는다. GP4에 의해 프라이머 합성의 첫 번째 단계는 삼량로 확장하고, 결국 기능 tetranucleotide 프라이머로 pppACCC, pppACCA 또는 pppACAC 템플릿 4의 순서에 따라 상기 뉴클레오티드 pppAC의 형성을 포함한다. 이 프라이머는 또한 GP4 보조 공정 (5, 6) 인 DNA 합성을 개시하는 T7 DNA 중합 효소가 사용될 수있다. 이와 관련하여, 프리 메이스도메인은 자신의 해리를 방지 템플릿과 매우 짧은 tetraribonucleotides 안정화 중합 효소 활성 부위 (7)에 프라이머 / 주형 확보에 도움이되는 방식으로 DNA 중합 효소를 결합한다. 이 단계 (RNA 프라이머 합성, 중합 효소에 프라이머 핸드 오프 및 확장)은 지체 가닥을 복제하기 위해 여러 사이클을 반복하고 선도 가닥의 복제를 조정해야합니다. 여기에 설명 된 분석은 매우 민감하고 적당한 시간 내에 수행 될 수있다. 그러나, 그들이 상대적으로 낮은 처리량과 큰 관심은 방사성 물질의 사용 및 폐기에 행사해야합니다. 반응 진행은, 하나의 정상 또는 미리 정상 상태 중 하나의 반응 시간 과정의 의미 분석 의무 시간 스케일에서 샘플을 얻기 위해 신속한 급랭기구를 채용 할 수있는 속도에 따라. 최근에, 우리는 분석은 evidenc를 제공하기 위해 여기에 설명 된 사용오카자키 조각의 시작에 GP4의 프리 메이스 도메인의 프라이머 출시의 중요성 전자. 또한, 우리는 효율적인 프라이머 형성 및 활용 (8)을 촉진, 단백질, gp2.5 바인딩 T7 단일 가닥 DNA에 대한 규제 역할의 증거를 발견했다.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

수동 다중 정점 조건 GP4에 의해 촉진 프라이머 합성 반응을 샘플링, 즉, 프로토콜의 단계 1에 기재된 바와 같이도 1a에 도시 된 결과를 얻었다. 여기서, 전기 영동 후의 제품의 범위 프라이머 합성 반응 (도 1a)의 α 위치에서 32 P로 표지 CTP를 이용하여 관찰 할 수있다. 표지 된 전구체 CTP는 높은 이동도를 나타내고, GP4 합성...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론<em&gt; 체외</em&gt;는 박테리오파지 T7 복제 단백질에 의해

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K 조회수.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

연구

생화학

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

생물학

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

생체공학

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

면역학 및 감염병학

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

T4 Phage를 사용한 Murine Models의 Gut Phage-Bacteria Dynamics 탐색

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

저자 스포트라이트: Gnotobiotic Mice의 박테리오파지 유도 면역 반응 조사

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론

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고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

에는 대장균-감염 살 균 소의 합성 기반 셀 무료 식 시스템

Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델