Name: mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells at JoVE.com

우리는 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원뿐만 아니라 안드레아 Parmeggiani (L2C 및 DIMNP, 몽펠리에), 벤와 샬럿 (IES, 몽펠리에를) 감사합니다, 크리스토프 Duperray를 제공하기위한 FACS 분석은 몽펠리에 RIO 영상 설비 (MRI)에 대한 도움말 FACS와 공 초점 현미경에 적합한 환경을 제공합니다. BNM은 LABEX Numev (규칙은 ANR-10 LabX에-20)에서 대학원 친교에 의해 지원되었다. AB 바르샤바과 유럽 연합 (EU)의 대학에서 학사 교제에 의해 지원되었다 (N POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV는 과학 연구를위한 국립 센터 (CNRS)에서 직원 과학자입니다.

1 일 중간 엽 줄기 세포의 1 라벨링 (MSC) 미토콘드리아 (선택 사항) <ol><li> 1 일에 문화에 4 × 10 5 엽 줄기 세포를 갖도록 이틀 미토콘드리아 준비하기 전에, 10 ml의 αMEM / FBS 10 %에서 100 밀리미터 배양 접시에서 인간 중간 엽 줄기 세포를 시드. </li><li> PBS (4 ml)로 중간 엽 줄기 세포를 씻어 4 ml의 αMEM / FBS 1 %를 추가 (37 ° C로 데워진). </li><li> 37 ° C 배양기에서 30 분 동안 세포를 미토콘드리아 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 품어. </li><li> , 미토콘드리아 염료 용액을 제거 데워진 4 ㎖ (37 ° C) αMEM / FBS 1 %로 두 번 세포를 씻어 내고 다시 4 ml의 αMEM / FBS 10 %를 추가합니다. 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 2 시간 후, 다른 시간 30 분 후 배지 (αMEM 10 ㎖ / FBS 10 %)을 변경하고. </li></ol> 1 일 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 2. 라벨 (선택 사항, 토론 섹션 참조) <table border="1" fo:keep-together.within 페이지 = &quot;1&quot;FO : 유지 -에 - next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 세포 배양 배지 </td><td> 구성 </td></tr><tr><td rowspan="5"> GSC 기초 배지 </td><td> DMEM / F-12로 보충 </td></tr><tr><td> 인슐린 20 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> N2 보충 1 배 </td></tr><tr><td> 포도당 3g의 /의 L </td></tr><tr><td> L 글루타민 2 mM의 </td></tr><tr><td rowspan="9"> GSC 증식 매체 </td><td> 기초 매체에 추가 </td></tr><tr><td> B27 보충제의 1 배 </td></tr><tr><td> EGF (10) NG / ㎖ </td></tr><tr><td> bFGF를 10 NG / ㎖ </td></tr><tr><td> Fungine 10 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> Fungizone 0.25 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 헤파린 2 ㎎ / ㎖ </td></tr><tr><td> 시프로플록사신 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td> 겐타 마이신 2 μg의 / ㎖ </td></tr><tr><td rowspan="4"> MSC 증식 매체 </td><td> &amp; #945; MEM은 보충 </td></tr><tr><td> L 글루타민 2 mM의 </td></tr><tr><td> 10 % FBS </td></tr><tr><td> bFGF를 2 NG / ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 문화 미디어. <ol><li> 폴리 HEMA 코팅 된 세포 배양 플라스크에 neurosphere를 성장 중 GSC를 (GB4 세포주 (32) (10 × 106 세포) (단계 3.12-3.1 참조) 해리. </li><li> 105 세포로 48- 웰 플레이트에 시드 GSC를 / 웰 GSC 증식 배지 (500 μL)를 (표 1 참조). </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 세포 중요한 염료의 필요한 양을 추가하고 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 기초 배지 500 ㎕의 (표 1)를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음. </li><li> 반복 2.6-2.5 단계를 반복합니다. </li><li> GSC 기초 배지 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 5 분 동안 20 ℃에서 270 × g으로 원심 분리 판. 뜨는을 대기음. </li><li> 48 웰 플레이트의 웰 당 GSC 증식 배지 500 μl를 추가하고 37 ° C 배양기에서 배양한다. 주 : GSC를 금액이 표시 (10 × 106 세포)를 상이한 선량 - 반응 실험 FACS 제어를 수행 할 수 있습니다. 실험 조건은보다 정확하게 정의되면이 금액의 크기가 축소 될 수있다. </li></ol> 2 일 아교 모세포종 줄기 세포의 3 시드 <ol><li> 한 50㎖ 튜브에서 20 ° C에서 5 분, 270 × g으로 원심 분리하여 GSC의 neurosphere를 (10 × 106 세포)를 수집한다. </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에서 5 HBSS ml의, 원심 분리로 세포를 씻으십시오. </li><li> 뜨는을 대기음. </li><li> 부드럽게 100 μL 트립신 EDTA (0.25 %) (에서 GSC 펠렛을 재현 탁 10 × 10 당 <s)&gt; 6 셀까지 </li><li> 3 분 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 μL 염화칼슘 2 (20 mM)을 2 μL의 DNase I (10 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 P200 피펫와 피펫 팅 아래 (30-50x)에 의해 neurosphere를을 떼어 놓다. 거품을 피하십시오. 모든 GSC를이 분해되는 현미경으로 확인합니다. </li><li> 10 μL 트립신 억제제 (5 %) 및 10 ml의 HBSS를 추가합니다. </li><li> 20 ° C에서 7 분 270 XG에 원심 분리기 GSC를. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ml의 GSC 기초 배지 (표 1)를 추가합니다. </li><li> 토마스 계산 챔버와 GSC를 계산 한 다음 20 ℃에서 7 분 동안 270 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> GSC를 106 / ㎖의 세포 농도에 도달 GSC 증식 배지 (표 1)의 적절한 부피를 추가한다. </li><li> 시드 105 GSC를 96- 웰 플레이트의 웰 당 (세포 현탁액 100 ㎕). </li><li> 봇에 GSC를 얻을 20 ° C에서 7 분 270 XG에 접시를 원심 분리기우물의 톰. </li><li> 제 5 절까지 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 품어. </li></ol> 2 일 4. MSC 미토콘드리아 격리 <ol><li> 4 °의 C에 마이크로 튜브 원심 분리기의 온도를 조정합니다. </li><li> 두 튜브를 1.5 ml의 &quot;A&quot;및 (모두 EDTA 프리 프로테아제 억제제 함유하는 200 ㎕의 반응물 (A)와 400 μL 시약 C) 미토콘드리아 추출 용 시약을 함유하는 &quot;C&quot;를 준비한다. 2 다른 튜브, &quot;MSC&quot;와 &quot;미토&quot;를 표시를 준비합니다. 얼음에있는 모든 튜브를 유지합니다. 또한 미토콘드리아 연속 희석 용 튜브를 준비합니다. </li><li> 데워진 10 ㎖ (37 ° C) PBS로 세척 중간 엽 줄기 세포. </li><li> 2 ml를 10 초 동안 트립신 (없음 EDTA) 1 ㎖의 트립신 (없음 EDTA)를 추가 씻을 중간 엽 줄기 세포. 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 세포를 품어. </li><li> 10 ㎖ αMEM / FBS 10 %, 50 ㎖의 튜브에 전송을 추가하여 중간 엽 줄기 세포를 복구. </li><li> 20 ° C에서 5 분 270 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 뜨는을 취소하고 추가세포 펠렛을 10 mL의 αMEM / FBS 10 %. </li><li> Malassez 계산 챔버와 중간 엽 줄기 세포를 계산합니다. </li><li> 중간 엽 줄기 세포를 원심 분리기 (4-5 × 105) 20 ° C에서 5 분 동안 270에서 XG. </li><li> , 상층 액을 버리고 세포 펠렛에 1m 얼음처럼 차가운 αMEM / FBS에게 10 %를 추가하고 &quot;MSC&quot;라벨이 지정된 튜브 (단계 4.2에서 준비)에 세포를 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 900 XG에서 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 튜브. </li><li> 튜브의 모든 잔여 매체를 제거합니다. </li><li> 미토콘드리아 절연 시약 A (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. 5 초 동안 중간 속도로 소용돌이 정확히 2 분 동안 얼음에 튜브를 둡니다. </li><li> 10 초 동안 최대 속도로 미토콘드리아의 분리 시약 B. 소용돌이의 2.5 μl를 추가 한 다음 얼음에 튜브를 둡니다. 5 분마다 30 초를 반복합니다. </li><li> 미토콘드리아 절연 시약 C합니다 (EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제를 포함)의 200 μl를 추가합니다. RO (튜브를 기울 믹스ughly 30 회)하지 소용돌이 않습니다. 4 ℃에서 10 분 동안 700 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 은 &quot;미토&quot;튜브 (단계 4.2에서 준비)에 뜨는합니다 (MSC의 미토콘드리아를 포함)를 전송합니다. </li><li> 3000 XG, 4 ° C에서 15 분, 원심 분리기는 미토콘드리아 펠렛을 얻을 수 있습니다. 상층 액을 버린다. 펠렛은 고립 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다. </li><li> 미토콘드리아 펠렛을 얻기 위해, 12,000 XG, 4 ° C에서 5 분에서 다음 시약 C. 200 μL, 원심 분리기와 미토콘드리아 펠렛을 씻어. </li></ol> GSC를 격리 된 MSC 미토콘드리아 5. 전송 (MitoCeption) <ol><li> 중간 엽 줄기 세포 (4 × 10 5)에서 분리 된 미토콘드리아 펠릿에 미리 냉각 (0 ° C) GSC 증식 배지 200 μl를 추가합니다. </li><li> 지속적으로 GSC를에 미토콘드리아 현탁액의 20 μl를 추가 (GSC 증식 배지에서) 미토콘드리아 준비를 희석. </li><li> 96-w의 우물에 절연 미토콘드리아의 양을 추가원하는 농도 (0.1-10 μg의)에서 (단계 3.15에서)를 GSC를을 포함 엘 플레이트. 한 번 이상 전체 표면을 덮고, 가까운 우물의 바닥에 천천히 미토콘드리아를 추가합니다. </li><li> MSC 미토콘드리아 중요한 색소의 누출을 제어, GSC 증식 배지 전용 (GSC를)를 (중대한 염료 누출 감지 부 6.2 참조)를 함유하는 96- 웰 플레이트의 웰에 미토콘드리아 제제 (0.1 μg의 10)의 동일한 양을 추가한다. </li><li> 원심 4 ℃에서 15 분 동안 1,500 XG에서 MSC 미토콘드리아 (스텝 5.3)과 상기 제어 플레이트 (스텝 5.4)과 미토콘드리아받는 GSC를 함유 96- 웰 플레이트. </li><li> 즉시 원심 분리 후 37 ℃ 세포 배양기에서 배양 플레이트를 놓습니다. 주 : 미토콘드리아 전송 프로토콜이 SYST에 따라 조정될 수 회 원심 다수의 적절한 원심 력에서 배양 된 세포의 미토콘드리아 현탁액의 원심 분리에 의존미토콘드리아 기증자 /받는 사람 세포의 그들. </li></ol> 3 일 FACS와 공 촛점 이미징에 의해 미토콘드리아 전송 6. 분석 <ol><li> FACS 분석 GSC 샘플의 제조 주 : MSC 미토콘드리아 미리 중요한 색소 (제 1)로 표지 된 경우, 효율은 24 시간 미토콘드리아 전송 후에, FACS로 모니터링 할 수있다. <ol><li> 원심 분리기 20 ° C에서 5 분 270 XG에서 MitoCepted GSC를 가진 96 웰 플레이트. </li><li> 상층 액을 버린다. </li><li> 각 웰에 100 ㎕의 트립신 (없음 EDTA)를 추가합니다. 3 분 37 ° C에서 품어. 피펫은 위아래로 24 시간 기간에 형성된 neurosphere를을 해리. </li><li> GSC 기초 배지 100 μl를 추가합니다. </li><li> 20 ° C에서 5 분 동안 270 XG에 접시를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 재현 탁 GSC를 300 ㎕의 GSC에 FACS에 기초 배지 및 전송 튜브를 채택. </li><li> 외과를 수행alysis. </li></ol></li><li> 격리 된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 중요한 염료 누출에 대한 제어 (FACS) 주 :이 단계의 목적은 오히려 진정한 MSC 미토콘드리아 전송을 반영하지만 것이다 백그라운드 FACS 신호 MitoCeption (단계 5.3)에 사용되는 표지 된 MSC 미토콘드리아에서 중요한 염료의 단순한 리크를 결정하는 것이다. <ol><li> 3.15에 단계 3.1에 설명 된대로 GSC 세포를 시드. </li><li> 1 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 원심 20 ° C에서 5 분 동안 1,500 XG에 (단계 5.4에서 5.6)만을 미토콘드리아를 함유하는 96- 웰 플레이트. </li><li> GSC 96 웰 플레이트 (단계 6.2.2)에서 문화 매체를 기음과 미토콘드리아 만 (단계 6.2.3에서 상층 액)와 함께 배양 배지로 교체합니다. </li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 GSC를 함유 96- 웰 플레이트를 인큐베이션. </li><li> FACS 분석 6.1.7하기위한 단계 6.1.1에서와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> GSC의 SAMP의 제조공 촛점 이미징을위한 레 주 : GSC를 MSC에 미토콘드리아의 전송 형광 이미징에 의해 분석 할 경우, 중간 엽 줄기 세포와 GSC를 모두 미토콘드리아 (단계 1)과 셀 (단계 2) 중요한 염료 각각 미리 표시하여야 할 필요가있다. <ol><li> 단계 6.1.5에 6.1.1에서와 같이 GSC를 준비. </li><li> 재현 탁 GSC를 35mm 배양 접시 (유리 하단)에서 2 %를 FBS와 씨앗을 포함하는 2 ml의 GSC 증식 매체입니다. </li><li> 24 시간 후 전송 된 형광 MSC의 미토콘드리아와 GSC를에 공 촛점 이미징을 수행합니다. </li></ol></li></ol>

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K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+Sanger+strategy+for+human+mitochondrial+genome+sequencing.">A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing.</a> BMC Genomics. 14, 881 (2013).</li></ol>

INSERM (연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE),있는 CJ와 ML.V. 제휴의 MitoCeption 기술 (EP14306154.7)에 특허 출원을 제기했다.

연구의 증가는 세포가 미토콘드리아를 교환 할 수 있고 이러한 미토콘드리아 표적 세포 대사와 기능에 심각한 영향을 보여준다. 따라서, 양적으로 생물학적 효과의 정확한 연구 있도록이 표적 세포에 공여 세포에서 미토콘드리아를 전송하는 툴을 습득하는 것이 필수적이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 원래 점착성 암 세포주 MDA-MB-231 33 인간 중간 엽 줄기 ?...

미토콘드리아는 영양소 흡수뿐만 아니라 에너지 대사 산물 생산의 중심적인 역할을 진핵 세포에서 발견되는 세포 내 소기관이다. 이 세포 소기관은 원형 미토콘드리아 DNA 전자 수송 체인 단지,의 tRNA 및 rRNAs 1의 단백질을 인코딩 16.6 KB 긴 (미토콘드리아 DNA)를 포함합니다. 이러한 소기관의 기능은 세포 항상성 여러 병리는 미토콘드리아 장애 1, 2, 3과 연관되어 매우 중요하다. 미토콘드리아 상태는 예를 들어 치료를 4, 5, 6, 7 전이 저항에 대한 영향이 후자의 경우에, 염증, 감염증, 암에 연결되어있다. 미토콘드리아는의 놀라운 능력을 표시<html> &quot;기증자&quot;과 &quot;대상&quot;세포 사이에 전송하기. 최근에, 15 개의 실험실 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 의해 도시 된 바와 같이,이 같은 조직 복구 및 화학 요법 제에 대한 저항성과 같은 다른 기능적인 변형뿐만 아니라 표적 세포의 에너지 대사의 변화를 초래 16. 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 세포의 기능적 특성의 변형 선도, 심근 세포, 내피 세포, 폐의 폐포 상피 세포, 신 세뇨관 세포와 암 세포를 포함하여 표적 세포의 매우 다양한 미토콘드리아를 전송하는 이러한 능력을 표시 8,&gt; 9, 10, 12, 17, 18. 미토콘드리아 교환 이제 다른 세포 유형의 수가 서로 통신 및 생물학적 특성을 수정할 수있는 광범위하게 사용되는 메커니즘으로 나타난다. 이 미토콘드리아 교환은 19 복잡한 넥신 43 함유 간극 연접 8 또는 M-초 / TNFaip2 및 exocyst를 포함하는, 터널링 나노 튜브 (TNT) 형성을 통해 발생할 수 있습니다. 대안 적으로, 미토콘드리아 전송은 도메인 함유 단백질 일 매개 마이크로 소포 (ARMMs) 20 아레스에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 전송의 효능는 GTPase ρ-1의 발현 속도 MIRO1 21 iPSC- 간의 미토콘드리아 전사 효능의 차이를 설명하기위한 핵심 요소에 링크 된중간 엽 줄기 세포와 성인 BM-중간 엽 줄기 세포 22. 세포 간 미토콘드리아 교환에 관한이 데이터 부에도 불구하고, 상대적으로 적은이 미토콘드리아 전송의 대사 및 생물학적 결과에 대해 공지되어있다. 따라서,이 완전히 충분히 전달의 생물학적 효과를 평가하기위한 적절한 툴을 설정 보증. 수년에 걸쳐, 여러 기술적 접근법 수용체 세포 공여자로부터 미토콘드리아를 전송하는 것이 제안되어있다. 이것은 27 transmitochondrial cybrids (26)를 생성하는 난자 23, 24, 25, 세포 융합으로 미토콘드리아의 직접 분사를 포함 그리고, 최근, 광열를 사용하여 격리 된 미토콘드리아의 전송은 28 nanoblades. 우리는 이전과 다른 절연 mitochond의 능력을 입증시험 관내 및 생체 내 모두에서 관찰 RIA는 살아있는 세포에 의해 내부화 될 메커니즘을 통해 29, 30, 31, macropinocytosis (32)을 포함 할 것을 제안. 우리는 더 정량적 (점착성)로 예시 된 바와 같이, 표적 세포 MDA-MB-231 유방암 세포주 (31) (MSC들)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 MitoCeption라는 방법을 개발 하였다. 이 프로토콜은 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아의 전송 (GSC를) 여기 적응했다. 교 모세포종은 빠르게 주로 종양 (33) 내에 존재하는 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 치료에 내성 뇌의 적극적인 악성 종양이다. 이 GSC를 시험관에서 neurosphere를로 성장하고 이종 이식 모델에서 종양을 생성합니다. 아교 모세포종 내 암 세포를방사선 내성 성상 네트워크 (34)에 생성 된 확장 된 모세관을 통해 상호 연결되는 미토콘드리아 (또한 칼슘 세포 핵)을 통해 이전 할 수 성상 뇌종양 세포에 대해 최근에 도시 된 바와 같이, 용량은 세포 간 연결을한다. 아교 모세포종은 MSC들 (35), (36)를 포함하여 종양 미세 환경 내에서 여러 셀을 채용 할 수있다. 우리는 중간 엽 줄기 세포를 공 배양에 GSC를 가진 세포 - 세포 연결을하고 GSC 기능적 특성을 수정할 것으로 예상된다 그들의 미토콘드리아 (도시되지 않은 데이터)를 전송할 수 있음을 보여 주었다. 본 프로토콜은 MitoCeption 기법 기능적 생물학적 결과를 결정하기위한 목적으로 인간에게 GSC를 인간 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 절연 미리 전송하는 방법을 설명한다. 능성 높은 종양 GB4 GSC 라인 37는이 연구에 사용 하였다.

<table><tbody><tr><td>Mitochondria Isolation Kit for Tissue&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10579663</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement W/O VIT A (50x)</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11500446</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; w/o Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>poly Heme&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM w/o glutamine</td><td>Ozyme</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 without glutamine</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11540566</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25030-024&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>I 1882&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human&amp;nbsp;bFGF&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>AF-100-15&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Inhibitor</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&amp;nbsp;</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 0.25% / EDTA 1&amp;nbsp;mM</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors EDTA free</td><td>Sigma</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fungine&amp;nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>Molecular Probes</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Molecular Probes</td><td>&amp;nbsp;M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Molecular Probes</td><td>&amp;nbsp;M22426&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Molecular Probes</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>Molecular Probes</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Sterile Culture Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>2,523,749</td><td></td></tr><tr><td>FACS apparatus</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception: transferring isolated human msc mitochondria to glioblastoma stem cells

미토콘드리아는 세포 대사, 에너지 생산 및 세포 사멸의 제어를위한 중심적인 역할을한다. 부적절한 미토콘드리아 기능은 신경 학적 병변에서 암에 이르기까지 매우 다양한 질병에 대한 책임이 발견되었다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 최근 용량을 표시하도록 도시 된 상기 현재 관심을 향상 미토콘드리아받는 세포 대사 및 기능적 결과와 공 배양 조건에서 암 세포에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 특히 세포 유형 사이에서 전송 될 이러한 세포 소기관의 생물학적 특성에 대한. 표적 세포에서 전사 MSC 미토콘드리아의 효과를 평가하는 것은 예컨대 세포 - 세포 상호 작용의 생물학적 결과를 이해하기 위해 가장 중요하다. 여기에 설명 MitoCeption 프로토콜 MSC 미토콘드리아를 이용하여 표적 세포를 도너 세포로부터 미리 격리 미토콘드리아의 전송을 허용모델 시스템으로서 교 모세포종 및 줄기 세포 (GSC). 이 프로토콜은 이전에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접착하는 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 격리를 전송하는 데 사용되었다. 이것은 미토콘드리아 전송 프로토콜은 체외로 neurosphere를 성장시키는 특정 특이성을 제시 GSC를 여기하도록 구성된다. 격리 된 미토콘드리아의 전달은 미토콘드리아에게 중요한 염료를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 공 초점 이미징 다음에 할 수 있습니다. 별개의 일배 체형 (SNP가)와 미토콘드리아 공여체 및 목표 세포의 사용은 또한 표적 세포에서의 원형 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)의 농도에 기초하여 상기 전송 된 미토콘드리아의 검출을 허용한다. 프로토콜이 이러한 기준을 검증 한 후에, 전사 된 미토콘드리아 형질 세포를 상기와 같은 세포 대사, 소성, 증식 및 치료에 대한 응답으로서 생물학적 특성에 외인성 미토콘드리아의 효과를 결정하기 위해 분석 될 수있다.

간엽 줄기 세포 (MSC) 및 MitoCeption하여 타겟 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC) 그들의 전송에서 미토콘드리아의 분리를 개설 절차의 단계는도 1에 도시된다. GSC를 자신의 줄기 세포 특성을 유지하기 neurosphere를로 성장 암 줄기 세포이다. 이 프로토콜의 경우, GSC를 미토콘드리아가 높은 전송 효율을 허용 미토콘드리아 (단계 3)의 전송 전에 단일 세포로 두 시간을 시?...

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MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다.

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  Montpellier University.  여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다. 

비디오: MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

연구

신경과학

현탁액 성장 암세포에서 투과연골 Cybrid 생성

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

저자 스포트라이트: 암 세포주를 사용한 투과연골 Cybrid 생성  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

암 연구학

Mitochondrial Transfer from Mouse Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells into Aged Mouse Oocytes

Due to the decline in the quantity and quality of oocytes related to age, the fertility of women over 35 years of age has declined sharply. The molecular mechanisms that maintain oocyte quality remain unclear, thus it is difficult to increase the birth rate of women over 35 years old at present. Oocytes contain more mitochondria than any type of cell in the body, and any mitochondrial dysfunction can lead to reduced oocyte quality. In the 1990s, oocyte cytoplasmic transfer resulted in great success in human reproduction but was accompanied by ethical controversies. Autologous mitochondrial transplantation is expected to be a useful technique to increase the quality of oocytes that have decreased due to age. In the present study, we used adipose-derived stem cells from aged mice as a mitochondria donor to increase the quality of oocytes of aged mice. Further development of autologous mitochondrial transfer technology will provide a new and effective treatment for infertility in aged women.

Here, we describe the isolation of mitochondria from mouse adipose-derived mesenchymal stem cells, and then transfer the mitochondria into aged mouse oocytes to improve the quality of the oocytes.

Due to the decline in the quantity and quality of oocytes related to age, the fertility of women over 35 years of age has declined sharply. The molecular ...

발생학

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

면역학 및 감염병학

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have immunosuppressive potential and have been shown to suppress inflammation in mouse models of intestinal inflammation, even though the route of administration can limit their homing and effectiveness 1,3,4,5. Local application of MSCs to colonic injury models has shown greater efficacy at ameliorating inflammation in the colon. However, there is paucity of data on techniques to enhance the localization of human bone marrow-derived MSCs (hMSCs) to the small intestine, the site of inflammation in the SAMP-1/YitFc (SAMP) model of experimental Crohn&#39;s disease. This work describes a novel technique for the ultrasound-guided intracardiac injection of hMSCs in SAMP mice, a well-characterized spontaneous model of chronic intestinal inflammation. Sex- and age-matched, inflammation-free AKR/J (AKR) mice were used as controls. To analyze the biodistribution and the localization, hMSCs were transduced with a lentivirus containing a triple reporter. The triple reporter consisted of firefly luciferase (fl), for bioluminescent imaging; monomeric red fluorescent protein (mrfp), for cell sorting; and truncated herpes simplex virus thymidine kinase (ttk), for positron emission tomography (PET) imaging. The results of this study show that 24 h after the intracardiac administration, hMSCs localize in the small intestine of SAMP mice as opposed to inflammation-free AKR mice. This novel, ultrasound-guided injection of hMSCs in the left ventricle of SAMP mice ensures a high success rate of cell delivery, allowing for the rapid recovery of mice with minimal morbidity and mortality. This technique could be a useful method for the enhanced localization of MSCs in other models of small-intestinal inflammation, such as TNF&#916;RE6. Future studies will determine if the increased localization of hMSCs by intra-arterial delivery can lead to increased therapeutic efficacy.

Murine studies in models of colonic inflammation have demonstrated that a small percentage (1 - 5%) of mesenchymal stem cells (MSC) injected intravenously or intraperitoneally home to the inflamed colon1,2. This study shows that ultrasound-guided intracardiac injections of MSCs result in increased localization to the intestine.

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

의학

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in part to the inability of the current treatment, consisting of surgical resection followed by radiation and chemotherapy, to eliminate invasive tumor foci. Treatment of these foci may be improved with tumoricidal human mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs exhibit potent tumor tropism and can be engineered to express therapeutic proteins that kill tumor cells. Advancements in preclinical models indicate that surgical resection induces premature MSC loss and reduces therapeutic efficacy. Efficacy of MSC treatment can be improved by seeding MSCs on a biodegradable poly(lactic acid) (PLA) scaffold. MSC delivery into the surgical resection cavity on a PLA scaffold restores cell retention, persistence, and tumor killing. To study the effects of MSC-seeded PLA implantation on GBM, an accurate preclinical model is needed. Here we provide a preclinical surgical protocol for image-guided tumor resection of GBM in immune-deficient mice followed by MSC-seeded scaffold implantation. MSCs are engineered with lentiviral constructs to constitutively express and secrete therapeutic TNF&#945;-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) as well as green fluorescent protein (GFP) to allow fluorescent tracking. Similarly, the U87 tumor cells are engineered to express mCherry and firefly luciferase, providing dual fluorescent/luminescent tracking. While currently used for investigating stem cell mediated delivery of therapeutics, this protocol could be modified to investigate the impact of surgical resection on other GBM interventions.

Tumor-seeking therapeutic mesenchymal stem cells (MSCs) show promise as a treatment for invasive glioblastoma. Optimal transplantation involves delivery of MSCs into the tumor resection cavity on scaffolds. Here, preclinical techniques to study MSC treatment of glioblastoma are provided including: image-guided tumor resection; implantation of MSC-seeded scaffolds; and postoperative therapy tracking.

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...

<meta charset="utf8"></head><body>MSC와 ARPE19 공배양에서의 미토콘드리아 전달 조사

Mitochondrial Transfer Via Tunneling Nanotubes Between Mesenchymal Stem Cells and Retinal Pigment Epithelium In Vitro

Mitochondrial transfer is a normal physiological phenomenon that occurs widely among various types of cells. In the study to date, the most important pathway for mitochondrial transport is through tunneling nanotubes (TNTs). There have been many studies reporting that mesenchymal stem cells (MSCs) can transfer mitochondria to other cells by TNTs. However, few studies have demonstrated the phenomenon of bidirectional mitochondrial transfer. Here, our protocol describes an experimental approach to study the phenomenon of mitochondrial transfer between MSCs and retinal pigment epithelial cells in vitro by two mitochondrial tracing methods.
We co-cultured mito-GFP-transfected MSCs with mito-RFP-transfected ARPE19 cells (a retinal pigment epithelial cell line) for 24 h. Then, all cells were stained with phalloidin and imaged by confocal microscopy. We observed mitochondria with green fluorescence in ARPE19 cells and mitochondria with red fluorescence in MSCs, indicating that bidirectional mitochondrial transfer occurs between MSCs and ARPE19 cells. This phenomenon suggests that mitochondrial transport is a normal physiological phenomenon that also occurs between MSCs and ARPE19 cells, and mitochondrial transfer from MSCs to ARPE19 cells occurs much more frequently than vice versa. Our results indicate that MSCs can transfer mitochondria into retinal pigment epithelium, and similarly predict that MSCs can fulfill their therapeutic potential through mitochondrial transport in the retinal pigment epithelium in the future. Additionally, mitochondrial transfer from ARPE19 cells to MSCs remains to be further explored.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: MSC와 망막 색소 상피 세포 간의 양방향 미토콘드리아 전달 — 경로 및 In Vivo 과제

Here, we present a protocol including mitochondrial tracing, direct co-culture procedures of mesenchymal stem cells (MSCs) and retinal pigment epithelial cells (ARPE19), as well as the methods for observing and statistically analyzing tunneling nanotubes (TNT) formation and mitochondrial transfer to characterize mitochondrial exchange via TNTs between MSCs and ARPE19 cells.

중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro

Mitochondrial transfer is a normal physiological phenomenon that occurs widely among various types of cells. In the study to date, the most important ...

MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송

요약

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분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

암 세포주를 이용한 트랜스미토콘드리아 Cybrid 생성

Mitochondrial Transfer from Mouse Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells into Aged Mouse Oocytes

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

마우스 모델에서 아교 모세포종에 치료 용 줄기 세포 비강 전달

세포종과 치료 줄기 세포 시드 장비의 Intracranial 주입의 이미지 기반 절제

중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro