Name: analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
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우리는 원고에 도움이 수정, 토론 및 의견 T. Stürner에 감사하고 있습니다; 플라이 주식을 제공하는 SL Zipursky; 화상 처리를 행하는 M Schölling. 이미지 분석의 일부는 A. Kakita의 실험실에서 수행되었다. 이 작품은, 혁신적인 분야에 시동을위한 알렉산더 폰 훔볼트 재단과 JSPS 동호회 해외 연구 (AS), JSPS 휄로우 (SH-S.), 그랜트-IN- 원조 (24800024), (25110713), 모치다에 의해 지원되었다 다케다, 이나모리, 다이 이치 산쿄, 도레이 재단 (TS), DZNE 핵심 자금 (GT)과 DZNE 광학 현미경 시설 (CM).

이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 독점적으로 초파리와 함께 작동 것을 포함하고 독일과 일본에서 동물 복지 법률을 실시하지 않습니다. 1. 빛 노출 조건 <ol><li> 광 수용체 R8 뉴런 (의 R8)에 BRP-GFP를 시각화 sensless-flippase (SENS-FLP) 및 bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15를 가지고 파리를 준비합니다. 세균 인공 염색체 (BAC) 내의 게놈 궤적 인코딩 BRP이 BRP-FSF-GFP 구조를 생성하도록 수정되었습니다. 이 변형 BAC에게 BRP-GFP의 발현을 수행 파리에서 내인성 조절 서열의 제어하에, 그러나 FRT-STOP-FRT 카세트 (15)의 sensless-flippase - 매개 R8 제거한 후 광 수용체로 제한. SENS-FLP 거의 R7S에 flippase 없음을 표현합니다. </li><li> 12 시간 리에서 파리를 유지우화 (그림 1A)까지 유충 단계에서 25 ° C에서 GHT / 12 시간 다크 사이클 (LD). </li><li> 우화 후 6 시간과 비행 음식을 포함하는 새로운 유리 병에 그들을 배치 - 파리 0를 수집합니다. </li><li> 세 단계 (41cm, 높이 21 cm의 기재 4 cm의 두께와 각 단계 13cm 높이) (도 1B) 아크릴 수지의 투명 랙에 튜브를 설정한다. </li><li> 디지털 광 측정기 (도 1C)를 사용하여 1,000 룩스의 평균 강도로 조명을 제공하도록 랙과 LED 패널 사이의 거리를 조정한다. </li><li> 1 파리 유지 - 다음 조건 중 하나에 3 일을 : 작은 배양기에서 25 ° C에서 상수 어둠 (DD), 12 시간 조명 / 12 시간 다크 사이클 (LD), 또는 일정한 빛 (LL) (도 1a 및 1C). </li></ol> 2. 해부, 면역 및 이미징 <ol><li> , 집게와 플라이 뇌를 해부 4 % FO로 해결Chaoptin에 대한 일차 항체 (1시 50분) 이전 실험 절차 (25)에 따라 광 수용체의 시각화를위한 두 번째 항체 rmaldehyde 및 발현 사이. 간단히: <ol><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 (0.1 % PBT)를 준비한다. 이 용액을 항체 조직 침투를 개선하기 위해 사용된다. </li><li> 하는 CO 2 패드에 파리를 마취 정확한 유전자형을 분류하고 0.1 % PBT 가득 배양 접시로 전송. </li><li> 프로보 시스 아래에있는 집게를 스틱, 다른 집게로 각각 오른쪽과 왼쪽 눈을 떼어. </li><li> 프로보 시스 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다. </li><li> RT에서 0.1 % PBT 150 μL를 포함하는 1.5 ML의 튜브에 집게로 머리를 전송합니다. </li><li> 2.1.3에서 10 분 반복 내 - 2.1.5 가능한 한 많은 두뇌을 얻었다. </li><li> 튜브에 16 %의 포름 알데히드의 50 μL를 추가하고 피펫으로 혼합한다. </li><li> 방에서 정착액에 머리를 품어50 분 동안 온도. </li><li> 튜브에 머리를 떠나지주의를 기울이고, 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다. </li><li> 다음 마지막으로 세척 한 후, 제조 된 0.1 %의 PBT를 제거하고 차 항체 용액을 추가 0.3 % PBT (0.3 % PBS 트리톤 X-100) 안티 Chaoptin 항체 4 μL (최종 희석 한 196 μL 추가 : 광 수용체의 시각화를위한 50). </li><li> 4 ° CO / N에서 차 항체 용액에 머리를 품어. </li><li> 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL 씻을 배. </li><li> 마지막 세척 후, 0.1 % PBT를 제거하고 차 항체를 함유하는 0.3 % PBT 200 μL를 추가한다. </li><li> 4 ° CO / N에서 어둠 속에서 그것을 품어. </li><li> 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다. </li></ol></li><li> 장착 약 2cm의 dista에서 현미경 슬라이드의 중심에 마이크로 피펫으로 장착 매체 (2 μL를 각각의) 두 개의 작은 방울을 넣어서로 NCE. </li><li> 각 드롭에 두 개의 커버 슬립, 하나를 놓고 약 0.2 mm의 커버 슬립 사이의 좁은 간격을 둡니다. </li><li> 커버 슬립의 상단에 장착 매체의 15 μL를 넣고 설치 매체에 마이크로 피펫으로 머리를 추가합니다. </li><li> 해부 현미경, 두 개의 커버 슬립 사이의 좁은 틈 (그림 2)에 최대 복부 측면과 두뇌를 놓습니다. </li><li> 상단에 커버 슬립을 놓고 시편 (그림 2)을 해결하기 위해 명확한 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. </li><li> 공 초점 현미경으로 뇌의 이미지를 얻습니다. 63X 기름 침지 대물 렌즈 (1.4 NA) 및 2.6 디지털 줌을 사용합니다. 0.5 ㎛의 스텝 사이즈를 상기 제 2 광섬유 신경절 수질 20 개 이상의 광 부분을 생성한다. </li></ol> 반점, 표면 개체, 시작 포인트 및 엔드 포인트의 3 세대 <ol><li> 의 DISTR을 수를 정량화하기ibution과 BRP-GFP의 puncta의 비편 재화의 레벨은, 이미지 분석 소프트웨어에 공 초점 현미경에 의해 얻어지는 스택을 열고 3D 영상 (도 3a)를 재구성한다. 이 연구의 단계가 Imaris 수행 하였다합니다. </li><li> 각 R8의 축삭 터미널 자리 검출 모듈에 의해 BRP-GFP의 puncta의를 식별합니다. <ol><li> &quot;새로운 관광 명소를 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 터미널을 선택합니다. </li><li> BRP-GFP 신호의 소스 채널을 선택합니다. 참고 : R7 및 R8 광 수용체의 축색 돌기가 반 Chaoptin (그림 3A)와 immunolabeled했다. 만 R8은, 그러나, BRP-GFP의 puncta에 포함되어있어 쉽게 (그림 3A) 구분 될 수있다. 또한, R8의 종점은 M3의 수질 층 진입 점에서 반 Chaoptin 양성 축삭의 씨닝에 의해 식별 될 수있다. </li><li> 추정 XY 직경 t 설정ㅇ 0.35 μm의 그 자리 검출에 &quot;배경 빼기를&quot;오프 확인합니다. </li><li> 필터 유형에서 &quot;품질&quot;을 선택하고 자동으로 필터링합니다. 다음 마침을 클릭합니다. </li><li> 다른 R 축삭 (그림 3B)에 대한 3.2.1 T-3.2.5에서 반복합니다. </li></ol></li><li> , R8 축삭의 BRP-GFP의 비편 재화 수준을 측정하는 각각의 축삭 (그림 3C)의 &quot;표면&quot;기능과 표면 객체를 생성합니다. <ol><li> &quot;새로운 표면 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 단자를 선택합니다. </li><li> 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다. </li><li> &quot;부드럽게&quot;오프 확인합니다. </li><li> 임계 값에 &quot;절대 강도&quot;를 선택합니다. </li><li> 확인 &quot;사용&quot;. &quot;씨 포인트 직경은&quot;0.5 μm의입니다. </li><li> 선택 필터 유형 &quot;품질&quot;과 &quot;복셀의 수&quot;를 선택한 후, 사설 필터링으. </li><li> &quot;편집&quot;로 이동 및 기타 비 흥미로운 축삭에서 발생하는 표면의 조각을 삭제합니다. </li><li> 다른 R 축삭 (그림 3C)에 대한 3.3.8 - 3.3.1에서 반복합니다. 주 표면 일부 개체 때문에 박형화 및 M2 층에서의 감광체의 약한 신호의 방해 되었으나, 이들은 여전히 ​​시작에서 끝 지점에 하나의 오브젝트로 간주 하였다. </li></ol></li><li> 수질의 neuropil의 각 신경 세포를 따라 BRP-GFP의 puncta의 분포를 확인하려면, 측정 지점 기능 (그림 3D)로 시작 지점과 끝 지점을 정의합니다. <ol><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 표면 객체의 상단과 교차하는 &quot;개체의 표면&quot;을 선택합니다. </li><li> 위해 M1 층에서 R 축삭의 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣습니다. 이 이제 시작 지점 (그림 3D)로 정의됩니다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다.그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 표면 객체의 바닥과 교차하는 &quot;개체의 표면&quot;을 선택합니다. </li><li> 위해서는 M3 층 R 축삭의 표면 물체의 저면에 측정점을 넣어. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3D)로 정의됩니다. </li></ol></li><li> 는 GFP 채널에서 배경 신호를 빼 M6 층 (그림 3E)에 두 개의 R 축삭에 대해 표면 객체, 관광 명소, 시작 지점과 끝 지점을 생성합니다. <ol><li> &quot;새로운 표면 추가&quot;를 선택합니다. </li><li> 알고리즘 설정에서 &quot;관심의 세그먼트 만 지역&quot;을 선택합니다. 수동 M5와 M6 층 사이에 R7의 축삭 터미널을 선택합니다. </li><li> 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다. </li><li> &quot;부드럽게&quot;오프 확인합니다. </li><li> 임계 값에 &quot;절대 강도&quot;를 선택합니다. </li><li> 선택 필터 유형 &quot;품질&quot;과 &quot;복셀의 수&quot;, 자동으로 필터링 할 수 있습니다. </li><li> &quot;새로운 관광 명소를 추가&quot;를 선택;. </li><li> &quot;수동으로 편집, 자동 생성을 건너 뛰기&quot;를 선택합니다. </li><li> &quot;개체의 센터&quot;를 선택하고 3.5.1에서 발생하는 표면 객체의 내부 지역에 지점을 추가 - 3.5.6. </li><li> 다른 R7의 축삭 터미널 3.5.9 - 3.5.1에서 반복합니다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣어. 이 이제 시작 지점으로 정의된다. </li><li> &quot;새로운 측정 포인트를 추가&quot;를 선택합니다. 그런 다음 &quot;편집&quot;을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체의 바닥에 측정 지점을했습니다. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3E)로 정의됩니다. </li></ol></li></ol> 관광 명소의 번호 4. 계산, 스팟 주파수 및 배포 사용자 정의 된 이미지 데이터 분석 소프트웨어와 BRP-GFP의 농축 수준 <ol><li> 파일을 복사&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot;및 Imaris XT matlab에 폴더에 &quot;기능&quot;폴더. 이 연구에서 계산 matlab에 구현 된 사용자 정의 플러그인을 실시 하였다합니다. 웹 사이트 (에서 플러그인을 다운로드 <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> N 관광 명소, n은 표면이 측정 점 개체, (- 3.4 3.1에서 준비) 각각 포함하는 n 개의 측정 포인트 데이터 집합을 엽니 다. 제 1 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 시작 위치를 정의한다. 두 번째 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 끝 위치를 정의한다. 두 측정점 개체 측정점 동일한 수 (즉 축삭의 수이다)이 필요. </li><li> 실행 이미지 처리 &gt;&gt; CUSTOM는&gt; 시냅스 감지 6 대 atsushis. </li><li> 메타 데이터를 확인하고 정확하지 않은 경우 이미지 분석 소프트웨어의 픽셀 크기를 변경합니다. </li><li> 반환 한 선택 채널스폿 영역 및 세포질 영역 (BRP-GFP와 채널)의 강도를 분석 필요치 않는. </li><li> 결과를 내보낼 파일 이름을 정의합니다. </li><li> 백분율 빈들 및 엑손 길이의 수를 정의한다. &quot;10&quot;로 빈과 &quot;100 %&quot;(도 4a 및도 4b)와 같은 빈의 범위의 번호를 입력합니다. </li><li> BRP-GFP의 비편 재화 분석 스폿 다른 세포질 영역의 영역을 정의한다. 입력 반점은 &quot;0.35 μm의&quot;와 &quot;50 μm의&quot;로 주변 지역의 폭으로 반경. 스폿 반경 (하나 누점 중심 0.35 ㎛의 직경)을 puncta에의 GFP 신호를위한 영역을 정의한다. 주변 지역의 폭은 세포질 영역에서 GFP 신호를위한 영역 정의 (누점 중심 50㎛의 직경 있지만 R8 포함 세포질에서 모든 반점 영역을 제외하고) (도 4a 및도 4c). </li><li> 모든 신경 세포 마스크가 처리 될 때까지 기다립니다그리고 PDF 파일 (도 4b 및도 4c)와 스프레드 시트에 추가 분석을 위해 CSV 테이블로 수출했다. csv로 테이블 스폿의 수는 &quot;세포질 영역&quot;및 모든 R8 축삭 각 bin에 &quot;얼룩&quot;의 최대 신호 강도의 평균 신호 세기를 포함한다. </li><li> 배경 신호의 공제 3.5에서 제조 된 데이터 집합을 엽니 다. </li><li> 4.9-4.3에서 설명한 바와 같이 화상 처리를 수행한다. </li><li> 총 수의 평균 스프레드 시트 (도 4D 및 4E)의 BRP-GFP의 puncta의 분포를 계산합니다. </li><li> 상기 배경 신호의 평균 휘도 감산 &quot;스팟&quot;의 최대 강도로 나눈 &quot;세포질 영역&quot;의 평균 강도의 비에 의해 스프레드 BRP-GFP 신호의 비편 재화의 평균을 계산한다 (도 4F) . </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optic+Lobe+of+Drosophila-Melanogaster+.1+A+Golgi+Analysis+of+Wild-Type+Structure.">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li><li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system.">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).</li><li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent.">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states.">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

본 연구에서는 동일한 빛의 세기에 파리를 노출하는 조명 조건을 준비하는 방법을 보여 주었다. 우리는 단지 시냅스 마커 puncta의 수를 정량 아니라 축삭을 따라 공간적으로 시냅스의 밀도를 해결 세포질 영역에서 마커 단백질의 비편 재화 수준을 측정 할 수있다. 이 세 가지 평가는 우리가 다른 환경 조건에서 단일 신경 세포 수준에서 시냅스 역학의 세부 사항을 평가 할 수 있습니다. 우리의 프?...

<html> 시냅스 기능의 변조를 정확하게 대응 자극이나 환경 변화에 적응할 수있는 신경계의 놀라운 능력에 기여한다. 시냅스 소포 방출 확률을 조정 한 시냅스 강도를 제어하는 하나의 방법이다. 시냅스 소포 릴리스는 활성 영역 (AZ), 시냅스 막 2의 전문 영역에서 발생한다. AZ는 특정 단백질 (3)의 카세트, (4)에 의해 특징입니다. AZ 어셈블리에 기여하는 대부분의 단백질은 매우 선충, 곤충, 포유류 (5)에 보존되어있다. 최근의 연구는 신경 활동의 레벨이 차례로 모두 시험 관내 및 생체 내 (6, 7)의 출력 기능의 조절에 기여 AZ, 분자 조성을 조절하는 것을 제안&gt; 8. 우리는 이전에 광 수용체 AZS 자연 환경 광 (9)에 장시간 노출 된 후 초파리의 분자 리모델링을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 상태에서는 Bruchpilot (BRP) 양성 AZS 수가 감광체 축삭 감소되었음을 관찰 하였다. BRP / CAST / ELKS 가족 단백질은 척추 동물과 무척추 동물의 시냅스 (10) AZS의 기본 빌딩 블록입니다. 초파리 BRP 돌연변이 체에서 소포 자료, 12 (11)을 억제 유발. BRP 17의 C 말단 아미노산 잔기는 초파리 신경근 접합 (NMJ) (13) (14)에 연접 소포 클러스터링 필수적이다. 이 연구는 AZ의 조직과 기능에서이 분자의 중심 역할을 보여 주었다. 재조합 (STAR), BRP와 최근에 개발 된 유전 도구, 시냅틱 태그와내인성 발현 수준 번의 시냅스 해상도 15, 특정 유형의 세포에서 생체 내에서 관찰 할 수있다. 이 도구는 가능한 정량적 복소 중추 신경계의 시냅스 내인성 역학을 평가한다. 공 초점 현미경에서 얻은 정보에 기초하고 시냅스의 정량화를 포함한 여러 연구가 있었다. 시냅스 변화는 길이, 면적, 체적 밀도를 측정하고 정교한 소프트웨어 애플리케이션에 기초하여 상기 수를 계수하여 평가 하였다. 예를 들어, 프리웨어 ImageJ에 총 시냅스 영역 및 초파리 NMJ 16 시냅스 농도를 측정하는 정량 방법을 제공한다. 사전 및 시냅스 마커의 colocalization을 사이트의 수는 ImageJ에 소프트웨어 플랫폼 (17)에서 사용할 수있는 플러그인 &quot;puncta의 분석&quot;을 사용하여 정량화하고있다. 대안 적으로, 다중 파adigm 수치 컴퓨팅 환경을 기반으로 프로그램 시냅스 검출기 (신디케이트)는 자동 형광 마커로 표지 된 신경 돌기를 추적 한 다음, 전지 본체 (18)로부터의 거리의 함수로서 시냅스 단백질 수준을 정량화 할 수있다. 소프트웨어 시냅스 puncta의 분석 (SynPAnal)은, 공 초점 형광 현미경으로부터 취득 뉴런의 2 차원 영상의 신속한 분석을 위해 설계되었다. 이 소프트웨어의 주요 기능은 단백질 puncta의 (19)의 밀도 및 강도의 자동적이고 빠르게 정량화이다. 최근, 자동 학습 기반 시냅스 검출 알고리즘은 3 차원 시각화 이용한 분석 (Vaa3D) 소프트웨어 (21)을 활용 3D 20 시냅스 수 정량에 대해 생성되었다. 상용 이미지 분석 소프트웨어는 또한 시냅스 정량화를위한 ​​강력한 도구입니다. 예를 들어, 형광표지 된 신경 전달 물질 수용체 또는 시냅스 AZ 구성 요소는 C에서 단일 시냅스 해상도 22 엘레 간스 또는 시냅스의 수백을 허용 초파리 후각 시스템 23, 24, 빠르게 하나의 샘플에서 특징으로하는 세 차원으로 정량화되고있다. 여기서는 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어에 의한 방법을 제시 플러그 그들의 수, 분포 및 분자량 성분의 농축 수준으로 포함 AZS의 반자동 여러 양상을 분석 할 수있는 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에서 구현 AZ. 따라서,이 복잡한 분석은 서로 다른 환경 조건 하에서 축삭 터미널에서 시냅스 구성 요소의 역학을 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 성인 플라이 광 수용체의 출력 시냅스에 빛 노출의 효과를 조사 하였다. 프로 시저가 세 단계로 수행된다 : 1)노광, 2) 해부, 면역 조직 화학 및 공 초점 이미징, 3) 이미지 분석을위한 준비.

<table><tbody><tr><td>Vial</td><td>Hightech, Japan</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Customized transparent rack made of acrylic resin&amp;nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japan</td><td></td><td>a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step</td></tr><tr><td>Cool incubator</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED panel</td><td>MISUMI, Japan</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Digital light meter</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Tokken, Japan</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Germany</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Takara, Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japan</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tube</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 16%</td><td>NEM, Japan</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anti-chaoptin antibody</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. &amp;amp; Co. KG, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)</td><td>Zeiss, Germany</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial Microscopes</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope Lighting</td><td>Olympus, Japan</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscopy</td><td>Zeiss, Germany</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Switzerland</td><td></td><td>Version 7.6.4 or above</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel for Mac&amp;nbsp;</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing synaptic modulation of drosophila melanogaster photoreceptors after exposure to prolonged light

신경계는 적응하고 다양한 자극에 반응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 이 신경 조정은 크게 시냅스 수준에서 소성을 통해 달성된다. 활성 영역 (AZ)는 신경 전달 물질 방출을 매개과 골격 단백질의 조밀 한 컬렉션으로 구성되어 시냅스 막에서의 영역이다. 노랑 초파리의 AZS은 (초파리) 광 수용체 자연 주변 광에 장시간 노출 된 후 분자 리모델링을 받다. 따라서, 신경 세포 활성도의 레벨은 AZ의 분자 성분을 재 배열하여 출력 기능의 조절에 기여할 수있다. 면역 조직 화학에 빛을 노출 설정 준비에서 시작,이 프로토콜은 수, 공간적 분포 및 초파리의 광 수용체에 AZS에서 시냅스 분자의 비편 재화 수준을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이미지 분석 SOF 사용tware의 GFP 융합 AZ 구성 요소 Bruchpilot의 클러스터는 각 R8의 광 수용체 (R8) 축삭 터미널 확인되었다. 감지 Bruchpilot 명소가 자동으로 개별 R8의 축삭에 할당되었다. 축삭을 따라 자리 주파수의 분포를 계산하기 위해, 우리는 사용자 정의 소프트웨어 플러그인을 구현했습니다. 각 축삭의 시작 지점과 끝 지점을 수동으로 정의 된 각 Bruchpilot 지점의 위치는 시작과 끝 지점 사이의 연결 라인에 투영되었다. Bruchpilot 클러스터의 수 외에, 우리는 또한 클러스터 내의 Bruchpilot-GFP의 비편 재화 수준을 정량화. 이러한 측정은 서로 다른 환경 조건 하에서 단일 신경 세포의 공간적 해결 시냅스 역학 자극에 구체적으로 반영합니다.

초파리의 겹눈은 ~ 780 ommatidia, 개안을 포함, 광 수용체 각각 포함 8 종류 (R1-8). R7 및 R8 프로젝트가 층 M6와 M3, 각각 26 시냅스를 형성하는 두 번째 광학 신경절, 수질, 그들의 축삭. 광 수용체 R8 활성 영역의 분자 구성에 빛에 장시간 노출의 영향을 조사하기 위해, 우리는 별 방법 (15)을 이용했다. BRP의 내생 발현 수준은 형광 영상 ...

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Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

6.5K 조회수.  Niigata University.  여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조. 

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Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

연구

생물학

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

신경과학

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

생화학

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Gutorov, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63514">Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly&#39;s eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization, known as the prolonged depolarizing afterpotential (PDA).

초파리 광수용체(Drosophila Photoreceptor)에서 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 조사

1. Measuring the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) using the electroretinogram

	Suitable rearing conditions for Drosophila melanogaster ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Stimulation and Modulation Techniques

Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Prolonged Light

Source: Sugie, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55176">Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light.</a> J. Vis. Exp. (120)
This video demonstrates the rearing of Drosophila melanogaster under specific light conditions to study the role of Bruchpilot proteins in neurotransmitter release and the resulting modulation of synaptic activity.

Synaptic Modulation in Drosophila After Exposure to Longlonged Light (장시간 빛에 노출된 후 초파리의 시냅스 조절)

1. Light Exposure Conditions

	From the larva stage until eclosion, keep the flies in a 12 h light/12 h dark cycle (LD) at 25 &#176;C (Figure 1A).
	...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

Source: Kopke, D. L., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57765">FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced fluorescence.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

1. Larval Glue Dissection

	Thoroughly mix 10 parts of silicone elastomer base with 1 part of silicone elastomer curing agent from the elastomer kit ...

의 시냅틱 변조 분석

요약

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Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

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전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법

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