We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

1. 높은 처리량 모르 폴리 노 디자인 전략 <ol><li> 관심의 유전자 (들) (예를 들어 후보 유전자 접근 방식, 시스 - 규제 분석, RNAseq 및 / 또는 단백체 차동 화면)를 확인합니다. </li><li> 자주 업데이트되는 웹 사이트에서 게놈, transcriptomic 및 유전자 발현 데이터를 사용 (예 : SpBase http://www.echinobase.org (20)와 S. purpuratus 게놈 검색에 http : ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html)을 시공간 발현 프로파일이 문제의 발달 메커니즘과 겹치는 것을 확인합니다. 어떤 발현 데이터가 없다면, qPCR에 프라이머를 생성 및 / 또는 인 시츄 프로브는 안티센스 유전자 발현 패턴을 평가. </li><li> 시공간 발현 패턴을 결정한 후, 게놈 웹 사이트로부터의 DNA 서열을 얻었다. <ol><li> 번역 차단 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 생성하는 오 시퀀스를 획득F 5 &#39;비 - 번역 영역 (5&#39;UTR) 직접 상류에서 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 웹 사이트에서 표현 된 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스에서 개시 코돈. 이 정보가 관심의 유전자를 사용할 수없는 경우, 다음 5 &#39;RACE를 수행합니다. </li><li> , 스플 라이스 차단 모르 폴리 노를 설계 엑손과 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 도구의 발판 BLASTN 도구를 사용하여 인트론을 포함하여 게놈 시퀀스를 검색합니다. </li></ol></li><li> 목적하는 25 염기 쌍 모르 시퀀스를 설계하기 위해, 올리고 뉴클레오티드 설계 사이트 http://oligodesign.gene-tools.com를 사용한다. <ol><li> 병진 차단 모르 들어 병진 표적 서열의 소스로 &#39;3&#39;(5)로부터의 mRNA 서열을 사용한다. 5 &#39;UTR 서열 (전사 시작 사이트의 상류 약 70 뉴클레오티드) 플러스 마크 위스콘신 코돈 시작으로 (시작 사이트의 다운 스트림) 코딩 영역의 25 기지를 포함번째 괄호 (ATG). </li><li> 스플 라이스 차단 모르 들면, 인트론 - 엑손 또는 인트론 - 엑손 경계 시퀀스를 선택하고, 경계 영역 50 염기 (엑손 서열 25 염기 및 인트론 서열 25 염기)를 포함한다. 순서가 고유한지 확인 모르 폴리 노 서열과 게놈을 스캔합니다. </li></ol></li></ol> 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 2. 미세 주입 <ol><li> 300 nmol의 모르 폴리 노의 바이알에 클레아없는 물 100 μL를 첨가하여 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 3 mM의 스톡 용액을 준비한다. 참고 : 디 에틸 피로 카보네이트는 모르 폴리 노를 손상시킬 수 있기 때문에 재 현탁액에 대한 DEPC 처리 된 물을 사용하지 마십시오. </li><li> 최고 속도로 30 초에 대한 재고 올리고 뉴클레오티드 용액이 들어있는 유리 병 아래 첫 번째 재구성 스핀 - 5 ~ 10 분, 짧게 소용돌이 65 ° C에서 (14,000 16,000 XG), 간단히 소용돌이, 열, 룸에서 모르 폴리 노의 재고를 유지 적어도 1 시간 동안 온도. 모르 폴리 노 원액<html> 들 +4 ℃로 -20 ° C에서 저장됩니다. </li><li> 원하는 농도 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 주사 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 일반적으로 20 % 글리세롤 또는 캐리어 125 밀리미터의 KCl 15 % (형광 염료 덱스 트란 10,000 MW 2.5 밀리그램 / μL 원액) FITC-덱스 트란이 포함되어 있습니다. FITC 덱스 트란 등의 형광 덱스 트란 접합체 일상적 표면 형광 현미경으로 주입 된 배아를 식별하는 데 사용된다. -20 ℃에서 보관 주사액. </li><li> 5 분 - 적어도 2 열 블록 또는 수욕에서 65 ° C에서 모르 용액을 가열한다. </li><li> 적어도 10 분 - (16,000 XG 14,000) 최고 속도로 1 분간 원심 분리를위한 - (16,000 XG 14,000), 소용돌이 짧게 모르 폴리 노의 최고 속도에서 30 초 동안 솔루션을 스핀. </li><li> 모르 폴리 노 용액 주입 바늘을 넣습니다. 자세한 미세 주입 프로토콜 Stepicheva과 노래 2014 년 21 환호와 Ettensohn 2004를 참조하십시오&quot;&gt; 22. </li></ol> S. purpuratus 태아에서 24 시간 후 수정 (HPF)에서 3. 고정하고 제자리 프로토콜에서 참고 :이 프로토콜은 아레나스 - 메나 등에서 수정됩니다. 2000 년 23 세티 등. 2014 년 24. <ol><li> 정착 <ol><li> , 배아를 포함하는 웰 (아래 참조) 정착의 몇 방울을 추가 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 그들이 정착 할 수 있습니다. 정착액 솔루션을 제거하고 고정액의 두 개의 추가 180 μL 세척과 배아를 혼합한다. 참고 : 철저하게 부드러운 피펫 위아래로 몇 번으로 세척하는 동안 배아를 혼합하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 신호 대 잡음비를 낮출 수있다. </li><li> pH를 7.0 10mM의 MOPS로 구성된 4 % 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드 실온에서 50 분 시간 1에 대한 두 번째 정착액 세척 (RT)에 수정 배아를 남겨, 0.1 % 트윈 20, 인공 seawateR (ASW). 최상의 결과를 위해 각 시간이 솔루션은 신선합니다. 또한, 편의성과 실용성 배아 96 웰 플레이트에 고정되어있다. <ol><li> 20 ML의 정착액 사용 5 mL의 16 % 파라 포름 알데히드, 15 mL의 ASW, 200 μL 1 M MOPS pH를 7.0, 20 μL 트윈 20. </li></ol></li><li> MOPS 180 μL에 실온에서 5 회 반복한다 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M의 NaCl 및 트윈 20 적어도 5 분 동안 또는 배아 때까지이 우물의 바닥에 떨어 0.1 %로 구성된 버퍼를 씻는다. 다시, 충분히 부드럽게 피펫 팅하여 여러 번 아래 세척 완충액으로 배아를 혼합하는 것이 중요하다. (4)에 저장된 경우 MOPS 세척 완충액을 2 일 동안 사용될 수있다 기음. <ol><li> 40 mL를 들어 MOPS 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을 32 mL의 DH 2 O, 40 μL 트윈 20을 씻는다. </li><li> 고정 배아 2 일 동안 4 ℃로 저장 될 수있다. 주 : 이상 고정 된 배아를 저장하는 경우, 박테리아 성장을 방지하기 위해 버퍼 워시 MOPS에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다.</li></ol></li></ol></li><li> 사전 하이브리드 <ol><li> MOPS는 버퍼 워시 기음과 2의 180 μL를 추가, 하이브리드 버퍼에 버퍼 부드러운 피펫 몇 배 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS의 1의 비율. 혼성화 완충액 70 % 포름 아미드, 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M NaCl을 구성, 1 ㎎ / ㎖의 BSA, 0.1 % 트윈 -20. <ol><li> 40 mL의 하이브리드 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을, 4 mL의 DH 2 O, 0.04 g의 BSA, 40 μL 트윈 20. , 텍싱에 의해 잘 섞는다 다시 28 mL의 포름 아미드, 및 소용돌이를 추가합니다. </li></ol></li><li> MOPS 세척 및 하이브리드 버퍼의 1의 비율과 1의 180 μL를 추가 : 2를 제거, 하이브리드 버퍼에 버퍼 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS 2 비율. </li><li> 하이브리드 버퍼 150 μL - 프로브 하이브리드 부드럽게 (100)에 배아를 혼합하기 전에. 적어도 1, 50 ° C에서 배아 부화시간. 참고 : 하룻밤 배아를 배양하는 것은 허용됩니다. 배양 전에 증발을 방지하기 위해 접착 시트 웰을 밀봉. </li></ol></li><li> 이종 교잡 <ol><li> 프로브 솔루션을 만들 부드럽게 한 다음, 하이브리드 버퍼에 소용돌이를 0.3 프로브의 NG / μL 500 μg의 / mL의 효모의 tRNA - 별도의 튜브에 0.1를 추가합니다. 효모의 tRNA는 안티센스 프로브의 비특이적 결합을 감소 시키도록 프로브 용액에 첨가된다. 이 50 ° C의 솔루션 및 흡인 하이브리드 버퍼를 예열. </li><li> 프로브 용액 100 μL에 미리 혼성화 된 배아 믹스 접착 시트로 밀봉하고, 상기 프로브에 따라 2 내지 7 일 동안 50 ° C에서 혼성화합니다 (foxq2 프로브 2 일 동안 배양 될 수있다). 참고 : 배양 시간은 프로브를 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 수준으로 발현 일부 유전자는 7 일 동안 배양까지 필요로한다. 96- 웰 플레이트는 ADHES 경우 증발에 대하여 보험 등 습도 상자에 배치 될 수있다필자 시트가 제대로 밀봉되지 않습니다. </li><li> 갓 만든 MOPS 180 μL와 50 ° C에서 5 회 반복 3 시간 총 버퍼를 씻는다. 이어서, MOPS의 μL 실온에서 세척 완충액 (180)으로 3 회 (15 분) 세척 하였다. 세척에 배아 부드럽게 여러 번 피펫 팅에 의해 때마다 버퍼 혼합해야합니다. </li></ol></li><li> 항체 배양 <ol><li> MOPS는 버퍼 워시 대기음 10 % 정상 양 혈청 5 밀리그램으로 구성된 버퍼를 차단의 180 μL에 배아를 혼합 / 버퍼 하룻밤 실온에서 적어도 45 분 4 ° C에 대해 품어 씻어 MOPS에서 ㎖의 BSA. </li><li> 버퍼를 차단 제거한 다음 1 포함하는 버퍼 차단으로 배아를 혼합 : 버퍼를 차단에 희석 알칼리 포스 파타 아제 접합 된 항 - 디그 옥시 제닌 항체의 1,500 희석. 증발을 방지하기위한 밀봉 판에 RT에서 밤새 인큐베이션. 참고 : 하룻밤 이상에서 항체를 두지 마십시오. </li><li> 배아 6 번 씻으 (5 분 또는 배아가 떨어질 때까지) MOPS에 실온에서 버퍼를 씻는다. 배아 수4 ℃에서 하룻밤 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 현장 개발 <ol><li> 0.1 M 트리스의 pH 9.5, 100 mM의 염화나트륨, 50 mM의의 MgCl 2, 1 ㎜의 levamisole로 구성된 갓의 pH 9.5 완충액으로 실온에서 배아 3 회 (10 분) 세척하고, 0.1 % 트윈 20. <ol><li> 20 ㎖의 pH 9.5 버퍼 사용 2 mL의 1 M 트리스 산도 9.5, 400 μL 5M NaCl을 1 mL의 1 M의 MgCl 2, 20 μL 트윈 20, 16.6 mL의 DH 2 O, 및 0.0048 g의의 levamisole. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 염색 버퍼에 37 ° C에서 배아를 품어. 염색 완충액 10 %의 디메틸 포름 아미드로 구성 4.5 μL / ㎖ 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 및 갓의 pH 9.5 완충액 3.5 μL / ㎖의 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 일 포스페이트 (BCIP) . <ol><li> 염색 버퍼의 한 ML 100 μL 디메틸 포름 아미드, 4.5 μL NBT, 3.5 μL의 BCIP를 사용합니다. </li></ol></li><li> MOPS에 3 ~ 5 회 세척하여 알칼리 포스 파타 아제 반응을 중지 버퍼를 씻는다. 반응 위스콘신foxq2 프로브는 일반적으로 1 시간 30 분 소요 번째. 일부 프로브는 RT 4 °에 C 중 하나에서 하룻밤 배양을해야 할 수도 있습니다. </li><li> 70 % MOPS 세척 30 % 글리세롤의 솔루션으로 배아를 섞는다. 글리세롤 현미경 필요한 굴절률을 제공한다. 배아 몇 주 동안이 용액에 저장 될 수있다. 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀으로 판을 밀봉합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 및 이미지 캡처 <ol><li> 슬라이드 위에 스트립 사이의 작은 틈으로 삼각형에 양면 테이프의 세 개의 작은 스트립을 배치하여 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 삼각형의 중심에 70 % MOPS 세척하고 30 %의 글리세롤 용액에서 배아를 전송하고, 커버 슬립으로 덮고. </li><li> 커버 슬립의 가장자리 주위 매니큐어의 층을 도포하여 커버 슬립을 밀봉. </li><li> 20 배의 대물 렌즈와 연결된 카메라 복합 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo.">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li><li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin,+a+TGF-beta+related+to+Vg1.">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li><li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin.">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li><li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells,+control+skeletal+morphogenesis+[corrected]+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development.">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li><li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin.">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li><li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology.">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li><li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm.">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).</li><li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li><li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos.">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li><li>Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+for+ectoderm+specification+in+sea+urchin+embryos.">Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).</li><li>Lin, C. Y., Su, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+sea+urchin+embryos+by+using+a+CRISPR/Cas9+system.">Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system.</a> Dev Biol. 409, 420-428 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 방법은 .. 많은 연구소가 해부 일찍 성게 개발 과정에서 유사한 분석을 사용하는 기본적인 발달 메커니즘을 지배하는 신호 전달 경로와 GRNs을 이해하는 척추 동물보다 작은 게놈과 형태 학적 복잡성 배아를 사용하는 능력을 보여주는 예입니다 다른 세포 운명 사양 이벤트에 관련된 신호 전달 경로 (예 노치 헤지 호그, TGF-β의와 FGF 신호) 27, <sup class="...

유전자 조절 네트워크 (GRNs) 신호 전달 경로는 성인 동물 신체 계획을 작성하는 데 사용되는 배아 발달 동안 유전자의 시공간적 식을 설정. 세포 간 신호 전달 경로는 세포가 통신하는 수단을 제공하는 이러한 규제 네트워크의 필수적인 구성 요소이다. 이러한 세포의 상호 작용을 수립하고 배아 1, 2 중에 다양한 지역과 중 규제 및 분화 유전자의 발현을 수정. 세포 외 분비 조절제 (리간드 길항제) 수용체 공동 수용체 간의 상호 작용은 신호 전달 경로의 활동을 제어한다. 세포 내 분자의 구색은 세포의 변형 된 유전자 발현, 분할 및 / 또는 형상의 결과로 이러한 입력을 transduces. 주요 경로에있는 세포 및 세포 수준에서 사용되는 키 분자의 대부분은 있지만공지 그것은 개개 신호 경로의 복잡성으로 인해 많은 부분에서 불완전한 지식이다. 또한, 다른 신호 경로는 종종 세포, 세포 내에서 양 또는 음 중 서로 상호 작용하고 전사 레벨 3, 4, 5, 6. 중요한 신호 전달 경로의 중심 구성 요소는 고도로 모든 후생 동물 종에서 보존하고, 특히 관련성 phyla의 발 미생물과 비교하면 현저하게 중요한 신호 전달 경로의 대부분은 종종 많은 종에서 유사한 발달 기능을 수행하는 7, 8, 9, 10, 11. 개발하는 동안 신호의 연구는 모든 생물의 발굴 작업이며,이척추 동물에서 큰 가능한 리간드 및 수용체 / 공동 변조기 상호 작용의 수, 세포 내 전달 분자뿐만 아니라, 거기에 1) : 가장 후구 동물 모델 (척추 동물, 무척추 척색, 반삭 동물 및 극피)의 신호 전달 경로를 연구하는 몇 가지 중요한 문제는 때문에 유전체 (12, 13), (14)의 복잡도에 서로 다른 신호 경로들 사이의 상호 작용 가능성; 2) 척추 동물의 복잡한 형태와 형태 형성의 움직임은 종종 더 어렵게 및 신호 전달 경로 사이에서 상호 작용을 해석 할 수 있도록; 3) 대부분의 비 극피 동물 무척추 동물의 후구 동물 모델 종의 분석은 일부 피막이 종 (15, 16)를 제외하고 임신 횟수의 짧은 창으로 제한됩니다. 그만큼성게 배아 상술 제한 몇 가지며 생체 내 신호 전달 경로의 상세한 분석을 수행하기 위해 많은 독특한 특성을 제공한다. 이들은 다음을 포함한다 : 1) 성게 게놈의 상대적 단순성 크게 가능한 리간드, 수용체 / 공동 수용체 및 세포 내 전달 분자의 수를 감소시킨다 (17)과의 상호 작용; 2) 세균 층 및 주요 배아 축 사양 및 패턴을 제어하는 GRNs 잘 신호 (18), (19) 수신 셀 / 지역의 규제 문맥의 이해를 돕고, 성게 배아 년에 설립된다 배아가 그 형태를 분석하기 쉽다 단층 상피 구성 때 3) 다수의 신호 전달 경로는 초기 및 절단 낭배 단계 사이 연구 될 수있다 4) 분자를 포함쉽게 조작하는 성게의 신호 전달 경로에서 D; 5) 많은 성게는 10 ~ 11 개월 년 (예 : Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus)에 대한 임신하는됩니다. 여기서 우리는 체계적이고 효율적으로 지정하고 성게 배아의 패턴 영역이 여러 무척추 동물 모델 시스템은 복잡한 분자 메커니즘의 연구에 제공하는 이점을 설명하기 위해 신호 전달 경로의 구성 요소를 특성화 할 수있는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Customized</td><td>More information at www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Make 25 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole hydrochloride (levamisole)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

the power of simplicity: sea urchin embryos as in vivo developmental models for studying complex cell-to-cell signaling network interactions

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

성게 배아에서 우리는 3 가지의 Wnt 신호 지점 (이 Wnt / β-catenin이,이 Wnt / JNK와의 Wnt / PKC) 4, 25 상호 작용은 전후방 (AP) 패턴에 적용의 Wnt 신호 전달 네트워크를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시그널링 이벤트의 가장 중요한 결과 중 하나는 초기 넓게 표현 전방 neuroectoderm (ANE) GRN가 낭배의 시작 (S.의 purpuratus HPF 24)?...

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The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

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The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Unit 1

Principles of Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

7.8K 조회수.  Mississippi State University.  이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다. 

비디오: The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

연구

발생학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

생물학

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

화학

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

제브라피시 배아에서 나이브 Blastoderm 의 세대

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

단순함의 힘 : 같은 성게 배아

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