This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

참고 :이 프로토콜은 물 샘플링 및 metabarcoding 방법과 거래를하지 않습니다. 물은 연구 목적 (16)에 따라 다른 방식으로 샘플링 볼 미야 등. (12) MiFish 프라이머를 사용하여 metabarcoding 방법에 대한 자세한 내용은 될 수있다. 샘플링 된 물이 매우 추운 유지와 에드나의 저하를 방지하기 위해 몇 시간 내에 필터링해야합니다. 또한,이 프로토콜은 회전 진탕 배양기와의 사용을 포함 유의, 후자는 전자를 수용 할만큼 충분히 커야한다. 또한, 원심 분리기는 원추형 튜브 후 여과 필터에 남아있는 액체를 제거하고, 각각의 카트리지 내에서 추출 된 DNA를 수집 불가결 모두 15 mL 및 50 mL로 수용 할 수있다. 1. 스크류 캡과 1 L 플라스틱 가방 처리 참고 : 여과 볼륨&gt; 4 L. 경우이 단계를 건너 뛰 <ol><li> 나사 (C)의 중앙에 구멍을 뚫는다수형 루어 락 커넥터로부터 돌출 관과 동일한 직경 (4.8 mm)와 AP (L 1 회용 비닐 봉투에 부착). 대각선 집게를 사용하여 여과 한 후, 캡의 내부에 소량의 물 막힘을 방지하기 위하여 적절한 길이 (CA. 3mm)에 수형 루어 락 커넥터 튜브를 짧게. </li><li> 각각 수형 루어 락 커넥터의 바닥면 모두에 폴리에틸렌 (PE), 폴리 프로필렌 (PP)에 특화된 접착제 접착제를 적용하고 캡 스크류. 좋은 접착을위한 몇 분 (제조업체의 지침을 참조) 기다립니다. </li><li> 스크류 캡의 구멍에 남성 루어 잠금 커넥터를 삽입합니다. 두 부분 (보통&gt; 24 시간)을 완벽하게 접착 될 때까지 기다립니다. 사용하기 전에 10 % 상업 표백제 (캘리포니아. 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)와 남성 루어 잠금 커넥터와 스크류 캡을 소독. </li><li> MES에서 걸어하기 위해 1 L 플라스틱 가방의 두 하단 모서리에 두 개의 구멍 펀치시간 패널 (3 단계). 구멍의 직경은 메쉬 패널 프롱보다 크다는 것을 보장한다. </li></ol> 여과 시스템 2. 총회 <ol><li> 흡인기 펌프의 입력 커넥터에 높은 진공 튜브를 연결하고 매니 폴드에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 매니 폴드의 3 개의 빨간색 T- 밸브가 &quot;오프 위치&quot;(즉, 수평)에 있는지 확인하십시오. </li><li> 장갑 클린 세트 착용 각각 피팅 암형 루어를 삽입하고 여과 진공 고무 튜브의 상부 및 하부 단부에서 진공 커넥터. </li><li> 조심스럽게 필터 카트리지의 배출구 피팅 암형 루어 연결 및 실리콘 마개로 진공 커넥터를 연결. </li></ol> 필터 카트리지를 사용하여 물 샘플 (≤4 L)의 3 여과 참고 : 여과 볼륨&gt; 4 L.이 여과 시스템의 경우이 단계를 건너 뛰 자체 서 패널 F가 필요합니다또는 물 1 L로 가득 비닐 봉지에 매달려. 메쉬 패널, 여러 갈래 및 패널 용 스탠드, 온라인 상점에서 사용할 수있는 모든이 장치를 조립하는 데 유용 할 것이다. 입구를 압력솥 사용하기 전에 필터 카트리지 루어 캡을 출구. <ol><li> 비닐 봉지에 1 L 샘플링 물을 붓고 남성 루어 잠금 커넥터 나사 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 조심스럽게 비닐 봉투의 수형 루어 락 커넥터에 조립 된 필터 카트리지의 입구 포트에 연결한다. 루어 잠금 커넥터를 과도하게 조이지 마십시오; 펌핑이 시작되면 그렇지 않으면 기기가 누출됩니다. 모든 연결이 메쉬 패널에서 비닐 봉투를 끊기 전에 안전한지 확인하십시오. </li><li> 조심스럽게 메쉬 패널 개의 프롱으로부터 필터 카트리지와 비닐 백을 중단하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다. </li><li> 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 t, 매니 폴드를 실행암탉은 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다. </li><li> 물을 원하는 금액을 여과 될 때까지 3.1-3.4 단계를 반복합니다. 참고 : 아열대 산호초에서 가져온 물 1 L를 들어,이 여과 약 3 분 소요됩니다. </li><li> 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다. </li><li> 입구 및 출구 루어 캡 카트리지의 양쪽 끝을 모자. </li><li> 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블. </li><li> DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장합니다. </li></ol> 물 4. 여과 (&gt; 4 L) 필터 카트리지를 사용하여 샘플 참고 : 물 여과 볼륨 L.이 여과 시스템은 밸브와 일회용 10 ml를 피펫 팁이 장착 된 10 L 책 병을 필요로 ≤4 경우이 단계를 건너 뜁니다. 10 ml의 피펫 팁 (15.0 mm)의 내경과 선단의 테이퍼끝은 각각 필터 카트리지의 상기 밸브 (15.0 mm)의 외경과 입구 포트에 적합해야한다. 두 연결은 마찰에 맞는에서 여과하는 동안 안전하게 유지됩니다. 사용 전에 10 %의 상업용 표백제 (약 0.6 %의 차아 염소산 나트륨)가있는 피펫 팁을 소독. <ol><li> 북 병에 샘플링을 적당량의 물을 준비한다. 단단히 10 L 책 병의 밸브에 10 ml를 피펫 팁을 삽입합니다. </li><li> 단단히 피펫 팁 단부에 필터 카트리지의 출구를 삽입하고, 매니 폴드의 유입구로 실리콘 마개를 삽입한다. 흡입기를 켭니다. 여과를 위해 빨간색 - 밸브를 엽니 다. 필터 카트리지가 건조 될 때까지 매니 폴드를 실행 한 후 오프 위치로 빨간색 - 밸브를 켭니다. 참고 : 아열대 외부 산호초에서 가져온 해수의 10 L를 들어,이 여과 약 30 ~ 40 분 소요됩니다. </li><li> 조심스럽게 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 필터 카트리지를 제거합니다. 모자 모두입구와 출구 루어 모자와 카트리지의 끝납니다. 적절하게 빠른 건조 및 비 도포 라벨에 대한 용매 증거 펜을 사용하여 카트리지 입구 루어 캡 레이블. DNA 추출하기 전에 -20 ℃에서 필터 카트리지를 저장한다. </li></ol> 필터에서 에드나 5. 추출 참고 : 4 단계와 5 단계에서 우리는 크게 키트에서 제공하는 &quot;핵 피&quot;에 대한 프로토콜 다음, 상용 키트를 사용합니다. 단순성을 위해, 우리는 개별 카트리지를 처리하기위한 절차를 설명한다. 실제로, 우리는 한 번에 8 공정 (또는 원심 분리기의 최대 수) 이하의 필터를 추천한다. <ol><li> 56 ° C에서 인큐베이터를 예열. </li><li> 튜브에서 힌지 캡을 절단하여 2.0 ML 튜브를 준비합니다. 뚜껑을 폐기하십시오. 참고 :이 튜브는 필터에 남아있는 액체 수집 관으로 사용됩니다. </li><li> 필터 카트리지의 입구 (NOT 출구) 루어 캡을 제거하고, 입구 포트 나 삽입포집 관 NTO. 밀접 자기 접착 필름을 이용하여 카트리지와 수집 튜브 사이의 연결을 밀봉. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 원심 분리기 어댑터에 결합 된 장치를 삽입합니다. 필터에 남아있는 액체를 제거하기 위해 1 분 동안 5,000 XG에서 카트리지를 원심 분리기. </li><li> 필터 카트리지로부터 포집 관을 제거하고 관 버린다. 다시 캡 카트리지의 입구. </li><li> (그렇지 키트에서 제공하는 인산염 완충 생리 식염수) 및 200 μl의 AL 버퍼 20 ㎕의 단백질 분해 효소-K 용액의 혼합물 220 μl의 PBS를 준비합니다. 참고 : 필터 카트리지 혼합물을 4 배 볼륨을 수용 (. CA 1.8 ㎖). </li><li> 입구 캡을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 필터 카트리지에 혼합물 (440 μL)를 추가합니다. 피펫 팁 그냥 막 위의 카트리지 내부 볼 수 있도록 입구 포트에 완전히 피펫을 삽입합니다. </li><li> 캡 재 유입 포트와 필터 차 배치회전 진탕에 카트리지. </li><li> 56 ℃에서 예열 된 인큐베이터에서 회전 진탕를 놓고 20 분 동안 20 rpm의 속도로 통 켭니다. </li><li> 배양하는 동안, 새로운 2.0 ML 튜브를 준비 적절한 용매 방지 펜을 사용하여 튜브 라벨과 50 ML 원뿔 튜브에 넣습니다. 주 : 전 (2.0 mL) 및 후자의 튜브 (50 ㎖) 추출 DNA의 컬렉션에 대해 각각 2.0 ㎖의 튜브를 유지하기 위해 사용된다. </li><li> 배양 후, 입구 캡을 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 내에서 2.0 ML 튜브로 (출구 NOT) 카트리지의 포트 입구를 삽입합니다. 스크류 캡으로 50 ml의 원뿔 관을 닫습니다. </li><li> 1 분 카트리지에서 추출 된 DNA를 수집하기 위해 5,000 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 필터 카트리지 멸균 집게를 사용하여 2.0 ㎖의 튜브를 제거하고 튜브 캡. 필터 카트리지를 폐기하십시오. </li></ol> 추출 된 DNA의 6 정화 참고 : 우리는 100 μL 버퍼 AE 대신 상업 키트의 설명서에 지정된 200 μL와 에드나을 용출. <ol><li> 상기 단계 (약 440 μL)에서 2.0 ML 튜브에서 추출 된 DNA에 200 ㎕의 에탄올 (96~100%)를 추가하고 텍싱에 의해 철저하게 섞는다. </li><li> 피펫 2 ml의 수집 튜브에 넣고 스핀 열에 혼합물. 1 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 5,000 x g에서 1 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW1, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> g, 새로운 2 ㎖의 포집 관에서 스핀 컬럼을 놓고 X 2 만에서 3 분 동안 500 ㎕의 버퍼 AW2, 원심 분리기를 추가합니다. 유동 통해 수집 튜브를 폐기하십시오. </li><li> (안 키트에서 제공) 새로운 1.5 ML 튜브를 준비하고 적절하게 빠른 건조 및 라벨을 비 도포를위한 방수 펜을 사용하여 튜브 라벨. 스핀 열 t 이동1.5 ML 튜브 오. </li><li> 스핀 컬럼 막 중심에 100 ㎕의 완충액 AE를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 실온에서 1 분 동안 배양 한 후 1 분 동안 6000 × g으로 원심 분리기. </li><li> 스핀 열을 취소하고 튜브를 모자. -20 ° C에서 정제 된 DNA를 저장합니다. </li></ol>

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Genet. 17, 1-17 (2016).</li><li>Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymers+for+sample+collection,+protection,+and+preservation.">Biopolymers for sample collection, protection, and preservation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).</li><li>Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+room+temperature+preservation+of+filtered+environmental+DNA+samples+and+assimilation+into+a+Phenol-Chloroform-Isoamyl+alcohol+DNA+extraction.">The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction.</a> Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

물, 토양 등의 환경 시료를 사용하여 많은 metabarcoding 연구를 다음과 같이, 필터 카트리지의 후 여과 처리는 일반적으로 24, 25 : 1)로 개방 절단 또는 손 도구 (튜브 커터 치)와 하우징 분해; 2) 필터 카트리지에서 제거; 3) DNA 추출을위한 면도날 작은 조각으로 절단 필터. 널리 사용되는 저가의 상용 키트를 사용하여 필터 카트리지의 하우징 내에 이러한 귀찮고 시간 소모적 인 실험실 오염되기...

수생 환경에서 환경 DNA (에드나)는 물 칼럼에서 발견 된 유전 물질을 의미한다. 최근의 연구는, 연못 1-3, 강, 4-8 등 다양한 수생 환경에서 물고기를 검출하는 에드나의 유용성을 입증 9 스트림, 해수 10-14. 최근의 연구는 생선 커뮤니티 7,9에서 여러 종의 동시 검출을 시도하면서 이러한 연구의 대부분은, 3,9 종 단일 또는 소수의 침략 1,4-6,8,14 희귀 또는 위협의 탐지에 초점을 맞춘 12,13,15 및 반 폐쇄 생태계 (11, 12). 후자의 방법은 &quot;metabarcoding&quot;라고하며 에드나의 metabarcoding은 분류 학적으로 다양한 샘플에서 유전자 영역을 coamplify하는 PCR 프라이머의 하나 또는 여러 개의 세트를 사용합니다. 이것은 인덱싱 및 어댑터 첨가 라이브러리를 제조 하였다되고 인덱싱 라이브러리는 높은 처리량 병렬 염기 서열 분석플랫폼. 최근 미야 등. (12) ( &quot;MiFish&quot;라고합니다) 물고기에서 에드나를 metabarcoding에 대한 보편적 인 PCR 프라이머를 개발했다. MiFish 프라이머는 분류 학적 가족, 속 일부 밀접하게 관련 동족체를 제외하고 종 물고기를 식별하는 데 충분한 정보가 들어있는 미토콘드리아 12S rRNA 유전자 (163-185 BP)의 가변 영역을 대상으로. 에드나의 metabarcoding에서와 프라이머를 사용하여, 미야 등. (12)는 수족관 근처 알려진 종 조성과 산호초 수족관 탱크에서 230 개 이상의 아열대 해양 종을 발견했습니다. metabarcoding 프로토콜을 최적화하는 물고기에서 에드나 농도 다양한 수준의 천연 해수를 수용 할 수 있지만, 우리는 MiFish 프라이머 가끔 후속 라이브러리 준비를위한 대상 영역을 증폭하지 못한 것으로 나타났습니다. 이 실패한 PCR 증폭 용 가능성 이유 중 하나는 TE 충분한 양의 부족여과 물 소량에 포함 mplate DNA (즉, 1-2 L). 특정 분류 학적 그룹에서 에드나 농도가 큰 물 볼륨 (&gt; 1-2 L)의 여과가 증폭되기 전에 알 수없는하지만 것 희귀 물고기의 풍부한 바이오 매스, 같은과 수생 환경에서 더 많은 에드나를 수집 할 수있는 간단하고 효과적인 수단이 될 오픈 바다와 심해 생태계. 디스크 섬유 필터에 대하여 종래에 물고기 에드나 연구 (16)의 수에 사용 된 필터 카트리지 (17)를 폐색하기 전에 물 큰 볼륨을 수용하는 장점을 갖는다. 사실, 최근의 연구는 많은 양의 (&gt; 20 L) 필터 카트리지 (18)를 사용하여 연안 해수 시료의 여과를 보였다. 또한, 이들은 개별 포장 및 멸균하여 실험 워크 플로우의 여러 단계가 이에 해당 기관 (19)로부터의 오염 가능성을 감소시키는 필터 하우징에서 수행 될 수있다. 후자의기능은 가장 큰 실험은 20, 21에 도전 중있는 오염의 위험이 남아 에드나의 metabarcoding 중요합니다. 필터 카트리지의 이러한 기술적 장점에도 불구하고, 그것은 두 가지 예외 8,15와 물고기 에드나 연구에 사용되지 않았다. 여기에서 우리는 주택을 열 절단 할 필요없이 필터에서 에드나의 필터 카트리지 및 추출 물 샘플의 여과를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 물 볼륨 (≤4의 L 또는&gt; 4 L)에 따라 두 가지 대체 물 ​​여과 시스템을 제공합니다. 새로 개발 된 프로토콜의 성능과 우리의 연구 그룹 12,14,22,23에서 유리 섬유 필터를 사용하여 이전에 사용되는 프로토콜을 비교하기 위해, 우리는 에드나는 거대한 수족관 탱크에서 해수의 분석을 metabarcoding 실시합니다 (7,500m 3 ) 알려진 종 조성물과 대표적인 결과로서 두 프로토콜로부터 유도 검출 종의 수를 나타낸다. 이 프로토콜의 시간으로는 물고기에서 에드나를 metabarcoding 위해 개발하지만, 다른 생물체에서 에드나에도 적용되었다.

<table><tbody><tr><td>Mesh panel</td><td>Iris Ohyama</td><td>MPP-3060-BE</td><td></td></tr><tr><td>Metal prong</td><td>Iris Ohyama</td><td>MR12F</td><td></td></tr><tr><td>Stand for the mesh panel</td><td>No brand</td><td>4184-9507</td><td>available from Amazon Japan</td></tr><tr><td>1 L plastic bag with screw cap</td><td>Yanagi</td><td>DP16-TN1000</td><td></td></tr><tr><td>Male luer-lock connector</td><td>ISIS</td><td>11620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette tip</td><td>Eppendorf</td><td>0030 000.765</td><td></td></tr><tr><td>10 L book bottle with valve</td><td>As One</td><td>1-2169-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-HV filter</td><td>Millipore</td><td>SVHVL10RC</td><td>denoted as &quot;filter cartridge&quot; throughout the ms and used in the protocol</td></tr><tr><td>Male luer fitting</td><td>As One</td><td>1-7379-04</td><td></td></tr><tr><td>Female luer fitting</td><td>As One</td><td>5-1043-14&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inlet luer cap</td><td>ISIS</td><td>VRMP6</td><td></td></tr><tr><td>Outlet luer cap</td><td>ISIS</td><td>VRFP6</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum tubing</td><td>As One</td><td>6-590-01</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum connector</td><td>As One</td><td>6-663-02</td><td></td></tr><tr><td>Silicone stopper</td><td>As One</td><td>1-7650-07</td><td></td></tr><tr><td>Manifold</td><td>As One</td><td>2-258-01</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-GAS-1</td><td>As One</td><td>1-7483-21</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>14600-50-NF</td><td>denoted as &quot;optional kit&quot; in the ms</td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Kubota</td><td>Model 4000</td><td>Maximum speed 6,000 rpm</td></tr><tr><td>Fixed-angle rotor</td><td>Kubota</td><td>AT-508C</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor for a 15 ml conical tube</td><td>Kubota</td><td>055-1280</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>denoted as &quot;self-sealing film&quot;</td></tr></tbody></table>

use of a filter cartridge for filtration of water samples and extraction of environmental dna

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes &#8804;4 L or &gt;4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

그것은 MiFish 프라이머는 조류와 포유류와 같은 일부 비 물고기 척추 동물에서 대상 지역을 coamplify 때문에 같은 크기의 PCR 제품, 분리 및 추출 된 대량 에드나 만 물고기 에드나를 정량화하는 것은 기술적으로 어렵다 (캘리포니아. 170 bp의 ) 12. 대신 물고기 에드나를 정량화, 우리는 여과 및 DNA 추출의 두 가지 방법을 사용하여 알려진 종 구성 수족관 탱크에서...

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Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

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Research

JoVE Journal

Environment

24.9K 조회수.  Natural History Museum and Institute, Chiba. We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

연구

환경과학

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column. The protocol is an extension of the large volume sampling protocol described earlier, with one major difference: here, there is no pre-filtration step, so all size classes of biomass are collected down to the 0.22 &mu;m filter cut-off. Samples collected this way are ideal for nucleic acid analysis. The set-up, filtration, and clean-up steps each take about 20-30 minutes. If using two peristaltic pumps simultaneously, up to 8 samples may be filtered at the same time. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use.

Small Volume 1-3L Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents small volume (~1 L) filtration of microbial biomass from the water column.

연안 해수 샘플을 소량 (1 - 3L)은 여과

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For today s ...

생물학

Capture of Environmental DNA (eDNA) from Water Samples by Flocculation

The analysis of environmental DNA (eDNA) has become a widely used approach to problem solving in species management. The detection of cryptic species including invasive and (or) species at risk is the goal, typically accomplished by testing water and sediment for the presence of characteristic DNA signatures. Reliable and efficient procedures for the capture of eDNA are required, especially those that can be performed easily in the field by personnel with limited training and citizen scientists. The capture of eDNA using membrane filtration is widely used currently. This approach has inherent issues that include the choice of filter material and porosity, filter fouling, and time required on site for the process to be performed. Flocculation offers an alternative that can be easily implemented and applied to sampling regimes that strive to cover broad territories in limited time.

Capture of Environmental DNA eDNA from Water Samples by Flocculation

Environmental DNA (eDNA) is typically captured from water samples using alcohol precipitation, filtration, or flocculation. Presented here is an alternative protocol that uses lanthanum chloride to enable collection of dissolved and particulate-bound nucleic acids from water samples containing eukaryotic cells, prokaryotic cells, and virus.

The analysis of environmental DNA (eDNA) has become a widely used approach to problem solving in species management. The detection of cryptic species ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

미생물 분자 서명을 사용하여 스트림에 유압 골절의 영향 평가

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Modified Kit를 사용한 경제적인 규조류 DNA 추출

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

저자 스포트라이트: 법의학 익사 검사를 위한 규조류 검사 

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

요약

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이 비디오의 챕터

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

연안 해수 샘플을 소량 (1 - 3L)은 여과

Capture of Environmental DNA (eDNA) from Water Samples by Flocculation

미생물 분자 서명을 사용하여 스트림에 유압 골절의 영향 평가

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

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미생물 분자 서명을 사용하여 스트림에 유압 골절의 영향 평가

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀​​도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

물 샘플 및 조직에서 규조류 DNA 추출

0.22 μm의 Sterivex 필터 및 세슘 클로라이드 밀도 기울기 원심 분리 장치에서 DNA 추출