Name: utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria at JoVE.com

The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1. 화학 <ol><li> 500 밀리미터의 NaH 2 PO 4 · 산성화의 H 2 O (137.99 g / mol)의 (PH 500 mM의 CEPA (144.49 g / 몰)의 용액에, 두 500 mM의 염화나트륨 (58.44 g / 몰)로 이루어진 용액을 준비 2.5) 초순수 0.1 N 염산. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 직렬 5 mM 내지 50 mM의 축적량을 획득하기 위해 동일한 용매 (10 배), 500 mM의 용액을 희석. </li><li> 초순수의 1-aminocyclopropane 카르 복실 산 (101.1 g / 몰 ACC)의 10 mM의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 살균 필터 -20 ° C에서 원액 저장할 분취한다. </li><li> 필터 - 소독 셀룰라아제를. 4 ° C에서 보관 씩. </li></ol> 2- 클로로 에틸 산 분해 2. 확인 에틸렌 생산 : 트리플 응답 분석 <ol><li> 기상 방법을 사용하여 생태형 컬럼비아 씨앗 장대 애기 장대를 표면 소독 : 주의 : 다음 단계는 t을 생산호기 염소 가스. 흄 후드에서 종자 소독을 실시한다. <ol><li> 종자 살균을위한 250 ml의 유리 비커를 수용하고 흄 후드에 배치 깊은 충분히 밀폐 용기를 얻습니다. </li><li> A. 추가 장대 미세 원심 관에 씨와는 랙에 튜브를 배치합니다. 밀봉 가능한 용기에 오픈 튜브를 포함하는 선반을 두십시오. 참고 : 염소 가스가 낮은 씨앗을 통과 할 수 있도록 반 전체에 걸쳐 개별 튜브를 기입하지 마십시오. </li><li> 밀봉 가능한 용기에 상업 표백제 100 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 비커를 놓습니다. 조심스럽게 표백제에 진한 염산 3 ㎖를 추가하고 즉시 뚜껑이있는 용기를 밀봉. 주의 : 표백제 HCl을 씨앗 표면 살균 작용 독성 염소 가스를 생성하는 반응. </li><li> fumehood 4 시간 동안 염소 가스의 존재하에 씨를 부화. 참고 : 긴 살균 시간은 발아 효율을 감소시킬 것이다. </li><li> 멸균 후, C 허용hlorine 가스는 적어도 1 시간 동안 흄 후드 벤트 microcentrifuge 관을 밀봉합니다. 폐기하기 전에 최소 24 시간의 fumehood에 표백제 및 염산의 혼합물을 둡니다. 주 : 소독 종자 즉시 사용을 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 장기 저장을 위해 4 ° C에서 씨앗을 보관하십시오. 응축을 방지하기 위해 microcentrifuge 관을 열기 전에 실온 씨앗을 가지고. 어둠에 보관 씨앗. </li></ol></li><li> 4 부문 페트리 접시 (90 X 15mm)에 한천 플레이트를 준비합니다 : <ol><li> A. 성장 배지 110 mL로 준비 장대 모종 : 1X 무라 시게 및 1 % 함유 스쿡 (MS) 기본 배지 (15) (4.33 g / L) (w / v)를 수크로오스 0.8 % (W / V) 한천. NaOH로 pH를 6으로 MS 매체를 조정합니다. </li><li> CEPA의 분해 박테리아 성장 배지 100㎖를 준비한다 슈람 및 Hestrin 16 1.5 %를 함유하는 (SH) 매체 (W / V) 한천. NaOH로 pH를 7로 SH 매체를 조정합니다. </li><li> 고압 증기 멸균 및 템피에 의해 미디어를 소독55 ° C의 물을 욕조에 연구. </li><li> MS는 한천이 강화되면, 멸균 플라스크에 40ml를 추가합니다. A.에 대한 양성 대조군 성장 배지를 제조 장대 모종 10 μM ACC의 최종 농도를 얻기 위해 10mM의 ACC 40 μL와 MS 한천의 40 ml의 분취 량을 보완. </li><li> 섹터 배양 접시 (그림 1)의 해당 사분면에 매체의 5 ML을 추가하고, 한천이 응고 할 수 있습니다. 세중의 모든 접시를 준비합니다. 주 : CEPA 나중에 프로토콜까지 성장 배지에 첨가되지 않는다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> 그림 1 :. CEPA와 트리플 응답 분석에 사용 한천 플레이트의 설치 개략도합니다 (음성 대조군 (A), 양성 대조군 (B)에 대한 특정 사분면, 실험 판을 보여줍니다C). 이 그림은 Augimeri과 스트랩 (9)에서 수정되었습니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 계층화 된 A. 장대 씨앗 동기 발아를 확인합니다 : <ol><li> 약 오십 A. 추가 MS 또는 MS + ACC 한천을 포함하는 각 사분면 상 장대 씨앗. 확인 씨가 균일하게 종묘 제거 및 분석을 용이하게하기 위해 배포됩니다. </li><li> 판 4에서 어둠 속에서 씨앗을 포함 품어 3~4일에 대한 C를 °. </li></ol></li><li> 트리플 응답 분석을 세균 성장 ​​중간에 CEPA (SH)를 분해 수행 <ol><li> 층화 한 후, 2 시간 동안 형광등에 씨앗을 노출. </li><li> SH 한천 함유 실험 판의 사분면에 500 mM의 CEPA 스톡 용액 10 μl를 확산 (PH 7;도 1) CEPA 최종 농도를 수득1 mm의. </li><li> 실험실 필름과 판을 밀봉하고 종자 어두운 환경을 만들기 위해 호일로 다룹니다. </li><li> 아래 한천 측면로 3 일 동안 23 ° C에서 어둠 속에서 판을 배양하여 씨앗을 발아. 주 : 매 적층 될 수 있지만, 에틸렌이 공기보다 가볍기 때문에 네거티브 컨트롤 아래쪽에 배치되어야한다. </li></ol></li><li> 트리플 응답 분석 데이터 분석 : <ol><li> 화염 소독 집게로, 해부 또는 디지털 USB 현미경으로 각 처리 및보기에 해당하는 플레이트에서 하나의 모종을 제거합니다. 상기 모종의 하단에 정렬 및 사진을 확인합니다. </li><li> 각 사분면에서 30 모종 (생물 복제 60 모종 및 치료 당 180 모종)를 제거합니다. 통치자와 검은 색 배경 사진으로 표면에 맞 춥니 다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여 복제 모종의 배축 길이 (mm)를 측정한다. 클릭하고 * 스트레이트를 드래그하여 크기를 설정 *도구 10 mm의 길이를 선택합니다. 은 &quot;분석&quot;탭에서 &quot;설정 규모&quot;를 선택하고 * * 분단 된 도구를 사용하여 (10)로 알려진 거리를 설정, 클릭 및 드래그 거리를 측정하기 위해 배축를 눌러 M의 길이를 선택할 수 있습니다. Tukey의 다중 비 교 검정으로 일방 ANOVA를 사용하여 생물학적 복제 수단을 비교한다. 차이는 &lt;0.05 중요한 경우 페이지 간주됩니다. </li></ol></li></ol> 세균의 성장을 통해 pH를 3. 분석 <ol><li> 세중 xylinus 스타터 문화를 성장 및 정량화 Komagataeibacter : <ol><li> K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 5 ㎖의 멸균 된 0.85 %와 NAC (/ V w)L 용액, 세포를 두 번 세척하고 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화. </li></ol></li><li> 산도의 분석을위한 문화 접종 : <ol><li> 호일 뚜껑 열두 500 ml의 플라스크에 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 국물 (PH 7) 150 ㎖를 추가합니다. K.와 플라스크를 접종 105 세포 / ml의 농도로 xylinus 종자 배양. 세 스타터 문화를 사용, 처리 당 세 생물학적 복제를 준비합니다. </li><li> 5, 50, 500 mM의 CEPA의 원액 300 μL와 보충 문화는 각각 1.0 mM의 0.01, 0.1의 최종 CEPA 농도를 획득하고있다. CEPA를 용해하는데 사용되는 용매 300 μL로 처리되지 않은 대조군 배양액을 보완. </li><li> 단단히 플라스크에 호일 뚜껑을 테이핑하여 플라스크를 밀봉하고 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 14 일 동안 문화를 품어. </li></ol></li><li> 매일 aseptica에서야 베드로 (10 분, 4 ° C 2,000 XG) 원심 분리하여 각각의 플라스크 및 펠릿 세포 5 ml의 샘플을 제거합니다. 깨끗한 튜브로 상청액을 옮기고 pH 미터를 이용하여 각 생체 복제의 pH를 측정한다. </li><li> 생물 복제의 평균 pH는 그래프에 의해 시간 코스 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 문화의 pH가 3.5 이하로 떨어지지 않도록하는 것이 중요하다; (5)의 문화 pH는 크게 CEPA에서 에틸렌 방출을 감소시키고, 3.5 이하의 pH는 완전히 에틸렌 방출을 억제한다. </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li></ol> 4. 식민지 형태학 <ol><li> K. 성장 세중 xylinus 스타터 문화 : <ol><li> K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. Incuba0.4-0.3의 OD 600까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 TE 배양 (약 72 시간)에 도달한다. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로 세포를 세척 한 다음 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 1.5 %의 SH 25 ml에 포함 된 24 한천 플레이트 (PH 7) 매체를 준비 (W / V) 한천. </li><li> 한천은 고형화되면, 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5, 50 μL의 50 및 500 mM의 한천 CEPA 스톡 솔루션 확산. No 변경 구성하고, 용매를 50 μL 확산 설정 미처리 용매 제어 플레이트는, 시험 화합물을 용해시키기 위해 사용된다. </li><li> K.의 루프 전체 (~ 5 μL) 절연 식민지에 대한 킬 판 xylinus 스타터 문화와 파라핀 필름을 밀봉. 세중의 모든 판을 접종한다. 30 ° C에서 5 일 동안 번호판을 품어. </li><li> 포트질적으로 디지털 USB 현미경을 사용하여 20X 배율에서 ograph 식민지는 고체 배지에 식민지 형태와 셀룰로오스 생산을 평가합니다. 참고 : 셀룰로오스는 식민지의 여백을 따라 불투명 한 물질로 나타납니다. </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li></ol> 5. 펠리클 분석 실험 <ol><li> 성장 및 정량화 K. 세중 xylinus 스타터 문화 : <ol><li> 세중에서, K.의 단일 콜로니를 접종 xylinus 0.2 % (v / v)의 필터 살균 셀룰라아제 보충 SH 배지 5 ㎖ (pH를 5)로. 0.4-0.3 (600)에 도달하는 OD (약 72 시간)까지 150 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양 물을 인큐베이션. </li><li> 원심 분리하여 수확 스타터 문화 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분). 멸균 생리 식염수 5 mL로, t 씻어그 세포를 두번 세포 펠렛을 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> Petroff-Hausser 계산 실을 사용하여 세포를 정량화. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에 접종하는 마스터 믹스를 준비합니다 : <ol><li> 각각 0.01, 0.1, 1.0 mM의 최종 CEPA 농도를 얻기 위해 5 50 120 μL, 500 mM의 CEPA 축적량 SH 배지 60 ㎖ (pH가 7)를 보완. CEPA를 용해하는 데 사용되는 용매의 120 μL와 SH 매체 (PH 7)의 또 다른 60 ml의 보충. 소용돌이는 혼합한다. </li><li> 사 14 ml의 분취 량으로 CEPA 함유 매체의 각 60ml를 나눈다. 105 세포 / ml의 농도로 배양 스타터 생물학적 복제와 14 ml의 분취 량 세 접종. 셀룰로오스 생산을 방지하기 위해 얼음에 세포와 튜브를 유지합니다. 주 : 나머지 14 mL를 분취 멸균 대조군 웰에 대해 사용된다. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에 접종 : <ol><li> 세 생물 복제의 행과 함께 자신의 접시에 각각의 처리를 테스트멸균 컨트롤의 행 (그림 2). </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> 그림 2 :. 펠리클 분석 및 분석 주식 CEPA 보충 된 pH가 7 SH 매체 (60 ㎖)에 사용되는 프로토콜을 나타낸 플로우 차트는 세 개의 분리 된 생물학적 복제 예방 접종 및 살균 제어 (14 씩으로)을 위해 분주합니다. 이러한 배양 물은 24 웰 플레이트 여섯 기술 복제 (2 mL)에 분주 한 후 파라핀 필름으로 밀봉된다. 30 ℃에서 7 일간 배양 한 후, 펠리클은 수확 및 FT-IR에 의해 습 중량, 두께, 건조 중량 및 결정 성을 결정하는 것이 특징. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 14 ml의 마스터 믹스를 사용하여, EAC로 2를 가하여멸균 24 웰 플레이트의 여섯 우물의 시간. 세 가지 생물학적 복제 및 살균 제어 (그림 2)에 대한 완료합니다. 각 치료를 반복합니다. </li><li> 파라핀 필름 인감 접시와 30 ℃에서 7 일간 정적을 품다. </li></ol><ol start="4"><li> 수확 및 측정 펠리클 젖은 무게, 두께, 건조 중량 (셀룰로오스 수율) 및 결정화도 (그림 2) <ol><li> 대향 펠리클 에지 올리고 집게 개별 펠리클을 제거하는 펠리클의 일측 우울. 그립을 유지하면서, 자신의 젖은 가중치를 결정하기 위해 무게 전에 초과 매체를 제거하기 위해 3 초 동안 신선한 종이 타월에 배치. </li><li> 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 측면에서 통치자와 사진에 인접 펠리클을 맞 춥니 다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (17)를 사용하여, 왼쪽 어깨, 오른쪽 어깨와 각 펠리클의 중심 펠리클의 두께를 측정한다. 각 생물 replicat에 대한 모든 기술 복제 평균이자형. </li><li> 개별적 6- 웰 플레이트의 웰에 펠리클을 전송. 20 분 세포 용균을 위해 80 ℃에서 0.1 N의 NaOH 12 ㎖로 펠리클 치료. </li><li> 의 NaOH를 제거하고 교반과 함께 24 시간 동안 초순수로 세척하여 펠리클을 중화. 물마다 6 시간을 변경합니다. 주 : 펠리클이 세정 공정 완료시 백색이어야한다. </li><li> 장소 실리콘 매트에 펠리클과 일정 중량으로 48 시간 동안 50 ° C에서 건조. 건조되면, 박테리아 셀룰로오스 수율을 결정하기 위해 분석 규모의 페리 클 가중치를 매트에서 제거하고 측정한다. </li><li> 4000 ~ 650 cm의 범위에있는 적외선 분광기 (FT-IR) 32 스캔을 사용하여 4 cm의 해상도 -1 푸리에 변환을 이용하여 펠리클 결정 분석 -1. 1437 / A (895) 사용의 결정 지수 CI (IR)를 계산하게하고; 은 &quot;결정 밴드&quot;와 &quot;비정질 밴드&quot;의 흡광도 비는 앞서 설명한 18. </li></올&gt; </li><li> 염소 인산염 레벨 제어, 0.01, 0.1를 이용하여 동일한 실험을 수행하고, 각각 5, 50, 및 500 mM의 축적량을 이용하여 염화나트륨-의 NaH 2 PO 4 수용액 1.0 mm로. </li><li> 펠리클 데이터 분석 : <ol><li> 펠리클 습윤 중량 및 건조 중량 사이의 차이를 결정하여 펠리클 수화를 계산한다. </li><li> 통계적 분석을 위해 각각의 생물학적 복제에 대한 단일 값을 얻기 위해 모든 기술 복제의 값을 평균. Tukey에의 다중 비교 시험으로 일방 ANOVA를 사용하여 치료를 비교한다. 차이는 P의 경우 &lt;0.05 중요하다. </li><li> 처리되지 않은 컨트롤의 비율로 데이터를 정상화 생물 복제의 수단을 플롯. </li></ol></li></ol>

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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+cellulose-structure+and+characterization.">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 방법은 모델 생물, K.를 사용하여 세균 에틸렌 반응의 연구 CEPA에서 에틸렌의 생산 현장에서 개요 xylinus. 에틸렌의 pH를 CEPA 순수한 에틸렌 가스 또는 전문 실험실 장비에 대한 필요성을 부정하는 이상으로 3.5 10,11이있는 수성 매체를 보충함으로써 제조 할 수 있으므로이 방법은 매우 유용하다. 이 방법은 세균에서 유래 CEPA 에틸렌의 효과를 연구에 국한?...

올레핀 에틸렌 (C 2 H 4)는 석탄 가스 램프를 사용하여 실험실에서 성장 완두콩 모종, (배축)이 짧았다 유래 된 비정상적인 형태를 나타낸다 관찰되었을 때 제 1901 식물 호르몬으로 발견 두꺼운 정상 완두콩 모종에 비해 옆으로 구부러진; 표현형 나중에 트리플 응답 1,2라고. 후속 연구는 에틸렌은 성장, 스트레스 반응, 과일 숙성 및 노화 3. 애기 장대 식물 생물학 연구를위한 모델 생물로 다수의 발달 과정을 조절하는 중요한 phytohormone가 잘 에틸렌에 대한 응답에 관해서 연구되어왔다 있음을 보여 주었다. 몇몇 에틸렌 반응 돌연변이 어두운 자란 A. 관찰 트리플 반응 표현형을 이용하여 분리 된 에틸렌 1,4,5의 존재 장대 모종. 식물에서 에틸렌 생합성 제조를위한 전구체는 1-A 인minocyclopropane 카복실산 (ACC) (6)과 공통 트리플 응답 표현형 1,4,5 리드 내생 에틸렌 생산을 증가시키는 트리플 응답 분석시 사용된다. 에틸렌 반응은 식물에 널리 연구되고 있지만, 세균에 외인성 에틸렌의 효과는 크게 식물 세균의 확대에도 불구 파악 하였다 연관된다. 한 연구는 특정 슈도모나스 균주는 탄소와 에너지 (7)의 유일한 소스로 에틸렌을 사용하여 살아남을 수 있다고보고했다. 그러나,이 연구는 박테리아가 에틸렌에 반응 것을 증명하고있다. 첫 번째 연구는 보여 주었다 녹농균, P.의 균주 fluorescens, P. 푸티 및 P. syringae 용융 아가 순수한 에틸렌 가스 (8) 평형화 화성 완충액과 혼합 한 아가 플러그 어 세이를 사용하여 에틸렌을 향해 주 화성이었다. 그러나, 우리의 지식, 더 푸르트는 없었다순수한 에틸렌 가스를 사용하여 응급실 보고서 때문에 특별한 장비없이 실험실 가스 운반의 성사 때문일 세균 에틸렌 응답을 특성화한다. 세균 에틸렌 반응의 두번째 보고서 에틸렌 9 xylinus 과일 관련 세균 Komagataeibacter (이전 Gluconacetobacter)에서 박테리아 셀룰로오스 생산 영향 유전자 발현이 증가하는 것이 보였다. 이 경우에, 에틸렌 - 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 포스 폰산 (에 CEPA)은 순수한 에틸렌 가스 또는 특수 장비에 대한 필요성을 우회하여 박테리아 성장 배지 내에서 동일계 에틸렌을 제조 하였다. - 14 염기 - 촉매, 일차 반응 pH를 3.5 내지 12 10,11 전술 한 몰 비율은 1 CEPA 에틸렌을 생성한다. CEPA의 열화가 긍정적 에틸의 제조에서 pH와 온도를 13, 14 및 결과와 상호 관련엔, 염화 인산염. CEPA는 기체 에틸렌 편리한 대안 에틸렌 박테리아 응답을 공부에 관심있는 연구자를 제공합니다. 다음 프로토콜의 전반적인 목적은 박테리아의 에틸렌 반응을 연구하는 간단하고 효율적인 방법을 제공하는 박테리아 성장 배지의 CEPA 분해로부터 에틸렌 생산의 생리 학적 관련성 레벨 검증을 포함하는, 배양 pH를 분석 CEPA 분해가 동안 손상되지 않게하려면 세균의 성장 및 박테리아 형태 및 표현형에 에틸렌의 효과 평가. 우리는 K.을 사용하여 이러한 프로토콜을 보여 xylinus 그러나, 이러한 프로토콜들은 적절한 성장 배지를 사용하여 표현형 분석하여 다른 세균에서 에틸렌 반응을 연구하기 위해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

트리플 응답 분석하여 SH 배지에서 CEPA에서 에틸렌 해방 (PH 7)의 검증을위한 개략도 판 설치는 그림 1A에 표시됩니다 - C를. 펠리클 프로토콜을 도시하는 흐름도는도 2 다크 성장한 A. 같다 장대 모종 ACC의 존재 및 SH 매체 CEPA의 분해를 통해 제조 된 에틸렌 (pH가 7)의 존재하에 삼중 반응 표현형 (과장 정점 후크 짧고 두꺼운 ?...

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Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

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Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

연구

면역학 및 감염병학

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

생화학

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

생물학

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

애기장대(Arabidopsis)의 박테리아 침입에 대한 자동 기공 반응 측정

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

저자 스포트라이트: 자동 조리개 측정을 통한 기공 연구 발전

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

요약

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을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

의 수집과 분석

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용: