우리는 봉사자 측정에 관한 도움이 토론 아니카 Engbers과 우수한 기술 지원을위한 프랭크 커스 박사 마르쿠스 SCHAFER (nanoAnalytics GmbH의)에 감사하고 있습니다. 이 작품은, HW 및 LK, CRC TR128에 SFB1009 프로젝트 A03는 A08 돌출 독일 연구 협회 (DFG)에 의해 지원되었다; Z1 및 B01는 LK 및 LK에 HW 및 (뮌스터의 의료 학부) 임상 연구를위한 학제 ​​간 센터 허가 번호 KL2 / 14분의 2,015합니다.

동물 보호를위한 독일 가이드 라인에 따라 모든 실험에서, 쥐 사육하고 뮌스터 대학의 중앙 동물 시설에서 특정 병원균이없는 조건에서 유지했다. 모든 실험은 동물 실험 윤리위원회의 지침에 따라 수행 노르 트라 인베스트 팔렌, 독일 (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217)의 지방 당국에 의해 승인되었다. 1. MBMEC 분리 및 문화 참고 : 이전에 다음과 같이 수정하여 상세 (14)에 설명 된대로 MBMECs을 분리 : <ol><li> CO 2 흡입 (6-8 주 이전) (20) 성인 C57BL / 6 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는 그들의 죽음을 확인합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스를 씻어 가위를 사용하여 목을 벨; 집게와 가위를 사용하여 두피를 제거합니다. 난원 매그넘부터 두개골의 좌우에 절개를 만든다. 그것의 꼬리 측과 탁에서 두개골을 들어 올려집게로 뇌를 전자. </li><li> 층류 후드 만 피질 유지 페트리 접시에 뇌를 배치하고, 뇌간, 소뇌 및 시상을 제거 무균 핀셋을 사용한다. 참고 : 현미경의 사용이 단계의 필요하지 않습니다. </li><li> 멸균 웨스턴 블로 팅 종이 위에 피질을 놓고 수막 더 이상 볼 수 있습니다 때까지 핀셋으로 가볍게 롤하지 않습니다. </li><li> (프로토콜 14 아래) 기계적 및 효소 분해 후 긴 멸균 바늘과 5 ml의 플런저를 사용하여 밀도 구배에서 내피 세포를 수집한다. 내피 세포는 적혈구와 레드 링 위의 어두운 층으로 나타납니다. 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에이 계층의 양도 20 ~ 25 ml의; DMEM과 튜브를 맨. </li><li> 세탁기 (14)의 두 라운드 후, 퓨로 마이신을 함유 MBMEC 매체 (4 μg의 / ㎖)의 용액에 6 세포를 재현 탁하고, 24 웰 플레이트의 웰에 코팅 여섯을 시드; 조직에서 그들을 떠나37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 사흘 동안 (여기서부터 &quot;인큐베이터 &#39;이라 함). 참고 : MBMEC 코팅 용액의 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오. </li><li> 퓨로 마이신없이 신선한 MBMEC 매체의 각 웰에 1 ml에 첨가하여 배지를 변경; 두 개 더 일 다시 37 ° C와 5 % CO 2의 접시를 넣어. </li></ol> 2. 수확 MBMECs <ol><li> MBMEC 분리 후 5 일째에, MBMEC 코팅액으로 미리 도포 투과성 인서트 : 인서트 당 용액 80 μl를 첨가하고 3 시간 동안 CO 2, 37 ℃ 그대로두고 5 %. </li><li> 조심스럽게 코팅 용액을 피펫 30 분 동안 삽입 자연 건조를 할 수 있습니다. 매체 씻어 MBMECs을 사용하여 웰 플레이트의 각 실온 2 ㎖ (RT) PBS 추가; 이 단계를 반복합니다. 0.05 % 트립신 - EDTA (물론 당 300 μl를) 추가하고 5 ~ 10 분 동안 인큐베이터에서 접시를 둡니다. </li><li> 중지 각 웰에 MBMEC 매체의 2 ML을 추가트립신. 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 수집 된 세포를 전송하고 4 ℃에서 8 분 동안 700 XG에 그들을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 퓨로 마이신없이 MBMEC 매체의 1 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 세포를 계산; 0.04 % 트리 판 블루 90 μL (세포의 10 배 희석)와 세포 현탁액의 10 μl를 섞는다. 피펫 유리 커버 셀 카운팅 챔버 (혈구) 사이 혼합물 10 μL. 챔버 (N)의 네 사분면에 트리 판 블루 무료 세포를 카운트하고 카운트 세포 (N &#39;)의 평균 수를 결정 다음과 같이 N&#39;= N / 4. </li><li> 다음 식을 사용하여 (106 세포 / ㎖로) 세포 농도를 계산 : C = N &#39;× 104는 혈구의 크기에 의해 지정된 10 단계 2.4에서 희석 계수이다 × 10 × 104. </li><li> 시드 인서트 당 260 μL의 부피에 2 × 104 세포. 물론 각각의 하부 구획에 MBMEC 매체의 810 μl를 추가. 섹션 4를 진행 준비가 될 때까지 인큐베이터에 삽입와 함께 접시를 놓습니다. 참고 : 상부 및 하부 구획의 볼륨을 삽입 특정하고 모든 24 웰 형식에 대해 작동하지 않습니다. </li></ol> 3. CD4 + T 세포의 분리 및 자극 <ol><li> CD4 + T 세포 분리 <ol><li> CO 2 흡입에 의해 (6-8 주 이전) 성인 마우스를 희생 심장 및 호흡 정지를 확인하는하여 죽음을 확인합니다. </li><li> 깨끗한 절개 보드의 뒷면에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 씻어; 비장과 림프절 (사타구니, 겨드랑이, 상완과 자궁 경부를) 복막을 열고 제거 멸균 가위와 집게를 사용; 마지막으로, 얼음 PBS 5 ㎖를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 조직을 옮긴다. </li><li> 층류 후드에서 상부에 70 μm의 셀 스트레이너와 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 조직을 PBS로 경사 분리하여 조직을 전송; 균질화스트레이너를 통해 1 ML의 플런저를 눌러 조직. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 30 ML을 추가합니다. 상청액을 폐기하고 FACS 완충액 10ml에 세포를 재현 탁. 튜브에 FACS 버퍼의 또 다른 20 ㎖를 추가, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 정지를 필터링합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 그것을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼 500 μL의 세포를 재현 탁. </li><li> 마우스 CD4 자기 마이크로 비즈의 20 μl를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 15 분 동안 품어. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기를 25 ML을 추가합니다. </li><li> 한편, 자석 내로 LS 분리 컬럼을 배치하고 FACS 완충액 3 ㎖로 씻어. 뜨는을 취소하고 FACS 버퍼의 3 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> 컬럼에 셀을 추가합니다. 세 번 버퍼 FACS 3 ㎖에 열을 씻으십시오. 자석에서 열을 제거하고 새 15 ML의 센트리에 배치fugation 튜브. , FACS 버퍼의 5 ML을 추가 5 분 4 °에 C 500 XG에 열 플런저와 원심 분리기를 가진 레이블 세포를 세척합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 T 세포의 배지 3 ㎖에 세포를 재현 탁. 웰당 배지 100 ㎕에 2.4 종자에 1 × 105 세포를 바와 같이 세포를 카운트. </li></ol></li><li> CD4 + T 세포 자극 <ol><li> 클론 성 CD4 + T 세포 자극 <ol><li> 사전 코트 원하는 최종 농도에서 정제 된 항 - 마우스 CD3 항체 PBS에서 (복제 145-2C11)와 둥근 바닥 96 웰 플레이트. 예를 들어, 1 μg의 / ㎖에서 α-CD3와 전체 판 코트를 미리하는 PBS, 소용돌이의 5 ml의 항체의 10 μL (주 농도 = 0.5 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 혼합의 50 μl를 추가 잘 멀티 채널 피펫 각. </li><li> 3 시간 동안 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. T 세포를 분리 한 후, PBS로 두 번 프리 코팅 된 플레이트를 세척한다. (복제 정제 된 항 CD28 항체 추가원하는 최종 농도 절연 T 세포 (행 37.51) 예를 들면, 1 μg의 / ㎖)에서; 잘 섞다. T 세포를 시드 및 2-3 일 동안 인큐베이터에서 그들을 떠난다. </li></ol></li><li> 수지상 세포와 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극 참고 : DC가 항원 제시 세포 (장갑차)로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오 <ol><li> 비장을 균질화하기 전에, 0.5 ㎎ / ㎖로 PBS에 콜라게나 형 IA 1 ㎖로 주입하고, 15 mL의 원심 분리 튜브로 옮긴다. </li><li> 15 분간 37 ℃ 수조에서 인큐베이션. PBS로 세척 한 후, FACS 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 20 마우스의 CD11c 자성 마이크로 비즈의 μL 대신 CD4 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 석사 분리 컬럼 및 적절한 볼륨을 사용하여 FACS 버퍼 1 ㎖에 열을 씻어; FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 세포를 FACS 완충액 3 회 1 ㎖로 칼럼을 세척 하였다. </li><li> 광고수지상 세포 (예를 들면, 수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG) AA 35-55 20 μg의 / ㎖)에 대한 선택의 D 항원이 잘 혼합 종자 5 × 104 세포 T 세포 배양액 100 ㎕에 당 96 라운드 - 바텀 잘. </li><li> 프로토콜 T에 대한 세포 분리에 기재된 바와 같이, 끝 부분 96 둥근 바닥 웰 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가한다. </li></ol></li><li> B 세포 항원 특이 적 CD4 + T 세포 자극 참고 : B 세포 장갑차로 사용하는 경우, 이러한 예외를 제외하고, T 세포 분리를위한 프로토콜을 따르십시오 <ol><li> 누구의 B 세포 (B 세포 특히 MOG 35-55을 인식 예를 들어, IGH MOG (목) 마우스,) 항원 - 특정 형질 전환 마우스에서 비장을 사용합니다. </li><li> (TCR MOG (2D2) 생쥐에서 예) 항원 특이 적 T 세포를 사용한다. 마우스 CD19 자기 마이크로 비드 대신 CD4 마이크로 비드의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 는 B CEL에 선택의 항원을 추가LS (예, 20 μg의 / ㎖에서 MOG 35-55)은 96 둥근 바닥 웰 당 B 세포 배양액 100 ㎕를 5 × 104 세포를 잘 혼합 종자. </li><li> 당 T 세포 배양액 100 ㎕에 1 × 105 T 세포를 추가 96 둥근 바닥 웰, T 세포의 분리를위한 프로토콜에 기술 된 바와 같이. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 설치 및 봉사자 측정을 수행 <ol><li> 층류 후드 아래 봉사자 상품의 24 웰 모듈을 놓습니다. 집게를 사용하여 기기에 MBMECs으로 뚜껑과 장소 삽입물을 제거합니다. </li><li> 모듈 우물의 하부 구획에 새로운 매체의 810 μl를 피펫 : 삽입 잘 모듈의 벽 사이에 조심스럽게 추가합니다. </li><li> 뚜껑을 닫고 인큐베이터에서 악기를 배치합니다. 그 컴퓨터에 기기를 연결; 악기 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 팝업 창에서 &#39;새로운 측정&#39;을 선택합니다. 체CK &#39;쇼 봉사자&#39;와 &#39;쇼 CCL&#39;상자; 다음 Enter 키를 눌러 &#39;시작&#39;. 첫 번째 측정을 완료 한 후, 모든 봉사자 및 CCL 값을 볼 수있는 &#39;결과&#39;탭에서 &#39;모든 우물을 검사&#39;를 선택합니다. </li><li> &#39;파일 이름&#39;&gt; 다른 이름으로 저장&gt; 파일 : 파일을 저장합니다. 주 : 티이 및 CCL 연속적 자동화 된 방식으로 측정 된 바와 같이, 3 내지 5 일의 기간에 걸쳐 이들 값을 감시한다. 세포 생존 능력이 최적이 아닌 봉사자의 증가의 부족에 의해 시각으로 매체를 변경하면, 필요하지 않습니다. </li><li> CCL은 안정 미만 1 μF / cm 2이고, 티이가 최대 레벨에 도달 할 때 T 세포 MBMECs 공동 배양하기위한 시점을 선택한다. </li><li> 조심스럽게 절대 봉사자 및 CCL 값을 검사하고 MBMECs는 우물을 취소하여 합류 충분히 단일 층을 개발하지 않은있는 우물을 제외 할 수 있습니다. </li><li> 그룹 우물의 나머지 : 잘 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &#39;새 평균 아니라 잘 추가&#39;를 선택합니다. 남팝업 창에 전자; 모든 개별 웰 그룹화하는 동일한 기능을 수행. </li><li> 그들 모두가 공동 문화 이전과 같은 초기 조건이 있는지 확인하기 위해 평균 우물을 확인합니다. 어떤 유의 한 차이의 절대 값 티이 있거나 티이 경사면, 또는 표준 오차가 너무 큰 경우, 그룹핑을 다시. 참고 : 우물의 최적의 그룹 내에서 실험 그룹 사이에 모두 봉사자 값에 최소한의 변화를 제공합니다. </li><li> &#39;실험&#39;탭을 눌러 &#39;일시 정지&#39;, 악기를 분리하고 인큐베이터 밖으로 가져 가라. 층류 후드 아래에 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 준비 미리 활성화 원하는, 또는 특정 사이토 카인, 항체 또는 다른 물질없이 그리고 / 또는 나이브 T 세포 : 제조 T 그래피 믹스 NA / LE 래트 항 마우스 IFN-γ 항체 (클론 XGM1.2) 예를 들어 세포의 봉사자 악기의 웰 당 20 μg의 / ㎖에서. 참고 사항 : 그랜 자임 B 억제제 같은 물질을 사용하는 경우, 그들은되는T 세포 자극의 처음에 T 세포 배양 dded : 예, 그랜 자임 B 억제제 II (Calbiochem 사)를 DMSO 10 μM의 최종 농도 절연 T 세포와 혼합된다. 자세한 내용은 재료 및 장비를 참조하십시오. </li><li> 삽입의 매체 (상부 잘 함)의 일부를 제거 (가 MBMEC 단일 층을 방해 할 수있는 모든 매체가 피해야한다 제거) 예를 들어, 조심스럽게 150 μL를 피펫. </li><li> 조심스럽게 2 × 10 5 세포 / 삽입을 포함하는 배지 150 μl를 피펫 팅에 의해 MBMECs에 T 세포를 추가합니다. 주 : 사전 활성화 된 T 세포를 수확하는 경우에만, 트리 판 블루 세포 무 발파를 계산. </li><li> 뚜껑을 닫고 다시 인큐베이터에 악기를 배치합니다. 악기를 눌러 &#39;이력서 측정&#39;을 다시 연결합니다. 하고 &#39;실험&#39;탭에서 24 시간을 눌러 &#39;정지&#39;후 파일 (파일&gt; 저장)를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 내보내기 및 통계 분석 <ol><li>[파일]&gt; [내보내기]를 선택하여 결과를 내 보냅니다. </li><li> 팝업 윈도우의 &quot;설정&quot;탭에서 &quot;필드 구분 기호&quot;옵션에서 &quot;소수 구분&quot;옵션 &quot;을 .dot&quot;와 &quot;도표 작성&quot;을 선택합니다. </li><li> &quot;내보내기 결과&quot;탭에서, 파일 이름을 모든 우물을 내보낼 확인하고 &quot;데이터 선택&quot;옵션에서 &quot;봉사자&quot;및 &quot;CCL&quot;확인란을 선택합니다. </li><li> 보도는 &quot;수출 데이터는&quot;내 보낸 파일을 열고, 스프레드 시트에 데이터를 복사합니다. </li><li> 공동 문화 전에 마지막 시점의 설정 봉사자 및 CCL 값을 100 %로 다른 모든 위해 따라 값을 변경 : (각 실행 (측정 주어진 봉사자 및 CCL 값으로, 각 복제으로 분류)) 내 보낸 데이터를 정상화 &#39;100 %&#39;실행에 대해 실행됩니다. </li><li> 개별 웰을 이용하여 각 처리 군에 대한 평균의 표준 오차를 표시하는 그래프를 생성하기 원하는 소프트웨어 정규화 된 데이터를 복사한다. </li><li> 피선택의 통계 소프트웨어를 사용하여 다중 비교에 대한 페로 니 보정과 양방향 ANOVA 통계 테스트를 erform. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

기술 된 프로토콜의 여러 단계를 성공적으로 실험에 필수적이다. 초기 MBMEC 분리 및 배양 동안, 작업 진균 포자 또는 세균 세포 배양의 오염을 방지하기 위해, 가능한 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요하다. 내장 컴퓨터의 순수 배양을 얻기 위해서는이되는 EC 생존 가능 제 사흘 퓨로 마이신을 함유하는 배지가 아닌 다른 세포 유형 (특히 혈관 주위 세포) (41, 42)을 사용하도록 권장한다. ...

3 - 혈액 - 뇌 장벽은 중추 신경계 (CNS) 1 전신 순환을 분리한다. 그것은 세포의 자유 운동과 수용성 분자의 확산을 억제하고 병원체 및 잠재적 유해 물질로부터 뇌를 보호하는 물리적 장벽을 제공한다. 그 장벽 기능에 더하여, BBB는 신경 조직의 적절한 작동을 보장 뇌 실질 조직에 산소와 영양분의 전달을 가능하게한다. BBB를의 기능적 특성은 높은 고도로 전문화되는 EC는 주요 구조 부재 인 상태의 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 조절된다. BBB를되는 EC의 꽉 접합 (TJ) 착체, fenestrations의 부족 pinocytic 매우 낮은 활성 및 완전히 활성 전송 메커니즘의 존재를 특징으로한다. 내피 세포, 성상 세포 엔드 피트 = 관련된 파를 포함 기타 BBB의 구성 요소 EC 기저막, 혈관 주위 세포enchymal 기저막 또한 BBB 2,4의 개발, 유지 보수 및 기능에 기여 - (6)과 함께 뉴런과 마이크로 글 리아와 상기 CNS (7)의 적절한 기능을 가능하게하는 뇌 혈관 부 (NVU) 형성 - 9. 이러한 신경 변성, 염증 또는 감염 질환과 같은 신경 질환의 다양한에서 BBB의 기능을 손상 2,5,10. TJ 복합체 분자 반송기구의 이상 조절은 BBB 침투성 백혈구 혈관 외 유출, 염증 및 신경 손상을 증가하도록 이끈다. 이러한 병태 생리 학적 조건에서 BBB 특성을 연구하기 위해, 다양한 시험 관내 BBB 9,11,12 모델을 확립 하였다. 이들은 장벽 무결성, 투과성뿐만 아니라 전송 메커니즘의 변화에 ​​귀중한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 모델은 인간, 마우스, 쥐, 돼지 또는 b의 내피 세포를 사용양의 기원 13-18; 25 - 기본 내피 세포 또는 세포주 생체 (19)보다 밀접 BBB를 모방하기 위해 혈관 주위 세포 및 / 또는 성상 세포와 단종으로 또는 함께 두 배양한다. 최근 몇 년 동안, transendothelial 전기 저항 (봉사자)의 측정은 내피 차단 성 (26, 27)을 평가하기 위해 널리 허용 도구가되었습니다. 티이은 세포 단층을 가로 질러 이온 플럭스 임피던스를 반영하고 그 감소 손상된 내피 장벽 완전성 따라서 증가 된 투과성 민감한 척도를 제공한다. 30 - 다양한 티이 측정 시스템은 상피 Voltohmmeter (EVOM), 전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS), 실시간 세포 분석 15,28 등이 개발되었다. 티이 인접되는 EC의 이온 플럭스 (paracellular 행)에 대한 내성을 반사하고 정비례장벽의 무결성. 임피던스 분광 27,31에서는 복잡한 총 임피던스 (Z)가 CCL을 측정함으로써 배리어의 무결성에 대한 추가 정보를 제공하는 측정된다. CCL은 세포막 (세포 횡단 경로)를 통해 용량 성 전류에 관한 것으로, 셀 층은 막의 양쪽에 전하를 분리하는 등가 전기 회로에 캐패시터와 같은 역할을하고 역 장벽 완전성에 비례한다. 투과성 인서트 상에 성장하면되는 EC가 부착 증식 미다 공막에 걸쳐. 이것은 (자체 커패시터처럼 동작)과 그것의 최소 레벨에 도달 할 때까지, 용량의 감소로 연결 삽입물의 배경 전류 용량 저항. 이것은 TJ의 설립 뒤에 것은 인접되는 EC 사이의 공간 떨어져 그 인감 복합체. 이 paracellular 경로를 통해 이온 플럭스를 제한하고, 그것의 고원에 도달 할 때까지 봉사자는 증가한다. 염증성 조건 하에서, 그러나, endotheli알 배리어가 손상되어 TJ가 방해받을 착물 삽입물의 용량 성 성분이 다시 상승을 CCL 증가로 티이 감소한다. 우리 티이 측정은 자동 세포 모니터링 시스템 (32)을 사용하여 그 임피던스 분광법의 원리를 따르고 이전 어플리케이션을 확장한다. 여기, 우리는 면역 세포와 뇌 내피 세포의 상호 작용을 포함하는 차단 성 연구를 가능하게하는 생체 외 BBB 모델을 설명; 특히 활성화 된 T 세포이다. 37 - 이러한 병태 생리 학적 조건은 다중 경화증 및 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염 (33)와 CNS의자가 면역 질환에서 관찰된다. 여기서, 중요한 단계는 전역 BBB encephalitogenic, 미엘린 특정 T 세포의 윤회이다. 이것은 뇌 실질에 혈관 주위 공간과 항목에서의 재 활성화 뒤에, 그들은 다른 면역 세포를 모집하고 저 곳diate 염증 및 후속 탈수 초화 1,35,38. 그러나, 이러한 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용의 분자 메커니즘은 BBB의 주성분은 잘 이해되지 않는다. 우리의 프로토콜은이 격차를 작성하고 활성화 된 T 세포와의 직접 접촉하고 복잡한 상호 작용에 따라 내피 세포 (즉, 장벽 무결성 및 투자율)의 결과에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 것을 목표로하고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 미세 다공성 멤브레인 투과성 인서트에 단층으로 성장 기본 마우스 뇌 미세 혈관 내피 세포를 사용한다. 내피 세포를 공 배양된다 polyclonally 또는 항원 특이 적 방식으로 어느 사전 - 활성화 될 수있는 CD4 + T 세포와. 활성화 미리 아니지만 나이브 T 세포 MBMECs 공동 배양 티이 감소하고 MBMEC 부전 및 장벽 파괴의 정량적 측정 값을 제공 CCL의 증가를 유도한다. 기술비 침습적이다 : 그것은 내장 대신 EC 단층의 주요 교란을 방지 젓가락 전극의 사용; 세포 마커의 사용없이 장벽 기능을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 이 자동화 된 방식으로 연속적인 계측을 동시에 시간에 따른 두 개의 장벽 파라미터 (티이 및 CCL)의 독립적 인 평가를 가능하게한다. 상기 방법은 또한 다른 T 세포 활성화의 수준 및 EC를 그러한 T 세포의 효과를 구별 할 정도로 민감하다. 그것은 기능 분석의 넓은 범위에서 사용할 수있다 : 염증 과정에 연루 다른 사이토 카인 및 / 또는 케모카인은 MBMECs 및 T 세포의 공동 배양에 첨가 될 수있다; EC의 또는 T 세포 양측에 세포 부착 분자에 대한 차단 항체를 사용할 수있다; 및 T 세포 활성화 마커 또는 세포 용해 특성의 억제제는 T 세포 프라이밍 또는 내장 컴퓨터와의 공동 - 배양 동안 첨가 될 수있다. 분석은 T 세포 윤회에 유용분석법은 T 세포를 첨가하기 전에 MBMEC 단층 무결성 품질 관리 역할을 할 수있다. 이 모든 것은이 방법을 EC 단층 무결성 활성화 T 세포의 효과에 초점을 시험 관내에서 BBB를 연구하는 다용도 공구를 신뢰할 수있다. 이것은 자기 반응성 encephalitogenic T 세포는 BBB를 통과 염증 및 신경 손상을 일으킬 MS 및 동물 모델 EAE 같은자가 면역 질환의 발병 기전에서 BBB 중단의 메커니즘을 이해하는데 특히 중요하다.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

도 1은 T 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되는 시험 관내 BBB 모델의 일반적인 개요를 제공한다. 실험은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계는 뇌 피질에서 기본 MBMECs 단리하고, 5 일 동안 문화이다. 이들이 세포 배양 접시에서 컨 플루 언스에 도달하면 MBMECs는 트립신 처리하고 티이 구에 배치 투과성 인서트로 시드된다. 봉...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K 조회수.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

비디오: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

연구

의학

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

면역학 및 감염병학

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

면역형광 염색을 통한 혈액-뇌장벽 모델 분석

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

저자 스포트라이트: 인체 조직 연구를 위한 조직 칩 기술의 사용 발전 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

생체공학

세포 장벽 무결성을 평가하기 위한 경내피 저항성 측정

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

저자 스포트라이트: 세포 장벽 무결성을 평가하기 위한 TEER 검출의 응용 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

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경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

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