우리는 보호자의 분석에 그녀의 도움이 조언 박사 클라우디아 Cremers 감사합니다. 켄 완은 HdeB 정화에 자신의 기술 지원을 인정 받고 있습니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에서 제공하는 박사 연구 친교에 의해 지원됩니다 (JCAB에) 하워드 휴즈 의학 연구소 JCAB 및 UJJ-UD에 보건 부여 RO1 GM102829 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 발현 및 주변 세포질 HdeB의 정제 참고 : HdeB는 E. 표현했다 폴리 믹신 용해시의 페리 플라 즘에서 플라스미드 pTrc- hdeB 10 및 정제를 보유하는 대장균 세포. <ol><li> E.의 야간 문화를 준비 200 μg의 / ㎖의 앰피 실린 (LB 앰프)를 포함하는 30 ml의 LB에 플라스미드 pTrc- hdeB (10)를 숨겨 대장균 세포. 0.7 OD를 600 ㎚에 도달 할 때까지 LB 앰프 네 1 L 배양 물을 접종하고 37 ℃에서 성장을 200 RPM. 그리고, HdeB의 발현을 유도하고, 30 ℃로 성장 온도를 감소 300 μM IPTG를 추가한다. </li><li> 30 ℃에서의 단백질 발현을 5 시간 후에는 4 ° C에서 5 분 동안 8000 × g으로 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 8,000 XG에서 세포를 다시 A (50 mM 트리스 / 염산, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)와 원심 분리기 버퍼 100 ㎖로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 그 후,에 resuspend80 세포 펠렛은 용액 1 ㎎ / ㎖ 폴리 믹신 설페이트를 함유하는 버퍼. 외막의 효율적인 붕괴를 들어, 부드럽게 4 ° C에서 1 시간 동안 정지를 저어. </li><li> 세포질 분획 및 세포 파편을 제거하려면, 4 ℃에서 15,000 XG에서 20 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 이 ~에 용해 HdeB를 포함하는 60 ml의 상층 액을 발생합니다. </li><li> 6 kDa의 MW 갖는 투석막을 이용하여 버퍼 B (20 mM 트리스 / 염산, 0.5 mM의 EDTA, pH를 8.0)의 150 배 부피에 대해 밤새 주변 세포질 추출물을 함유하는 상청액을 투석 차단한다. 3 kDa의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 15 ml의 단백질을 농축시킨다. 0.2 ㎛의 기공 필터를 사용하여 단백질 용액을 필터. </li><li> 2.5 ㎖ / 분의 유속으로 5 컬럼 부피의 완충액 B로 평형화 한 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼 (컬럼 부피 5 ㎖)에 단백질을 적용한다. 단백질이 컬럼에로드되면, 10 분에 대한 버퍼 B와 열을 씻어/ 분으로 2.5 ㎖의 유속. 2.5 ㎖ / 분 (6)의 유량을 50 분의 시간주기 동안 버퍼 B에서 0.5 M 염화나트륨 0 내지 선형 구배로 용출 HdeB. </li><li> 15 % SDS-PAGE를 사용하여 HdeB을 포함하는 분획을 확인합니다. 5 ㎕의 5 배 감소 SDS 로딩 버퍼 20 μl의 샘플을 섞는다. 로드 (10) 젤 위에 μL 및 트리스 - 글리신 버퍼 (14.4 g / L의 글리신, 2.9 g / L 트리스 1 g / L 황산 도데 실 나트륨, 산도 8.3)에서 실행됩니다. 브로 모 페놀 밴드가 젤 (~ 45 분)의 바닥에 가까운 마이그레이션 할 때까지 150 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 풀 모든 HdeB 함유 분획 4 L HdeB 저장 완충액에 대하여 밤새도록 4 ℃에서 투석 (50mM 트리스 / 염산, 200 mM의 염화나트륨, pH를 8.0), 및 분자량 원심 필터 유닛을 이용하여 약 300 μM로 단백질을 농축 컷 - 오프 3 kDa의의를. 흡광 계수 ε = 280 ㎚에서 15,595 M을 사용하여 280 nm에서 HdeB의 농도를 결정 -1 cm -1. 100 ㎕를 분취 및 플래시없는 준비액체 질소의 분취 량을 &#39;제. 주 : HdeB 적어도 6 개월 -70 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. 보호자 활동 분석 말 레이트 탈수소 효소를 펼쳐 열적으로 사용 (MDH) 주 : 열 상이한 pH 값에서 돼지 미토콘드리아 말산 탈수소 효소 (MDH)를 전개의 응집 그래피 HdeB의 영향을 아래와 같이 조사 하였다. 나열된 모든 단백질 농도는 단량체 농도를 참조하십시오. <ol><li> MDH를 제조 밤새 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대하여 4 ℃에서 MDH을 투석 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 100 μM로 단백질을 농축 kDa의. 참고 : MDH는 황산 암모늄 용액으로 전달 될 때 MDH의주의 투석이 필요합니다. </li><li> 집계를 제거하려면, 4 ℃에서 20,000 XG에서 20 분 동안 단백질을 원심 분리기. ε &lt;(280 nm에서 흡광도 MDH 농도를 측정서브&gt; 280 나노 미터 = 7950 M -1 cm -1). MDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 온도 조절 샘플 홀더 및 교반기가 장착 된 형광 분광 광도계에 1 ml의 석영 큐벳을 놓습니다. 설정 λ 전 / EM 350 nm이다. </li><li> 큐벳과 세트 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에 미리 예열 (43 ° C) 버퍼 D (150 mM의 인산 칼륨, 150 mM의 염화나트륨)의 적절한 볼륨을 추가 43 ° C에 큐벳 홀더의 온도. 총 부피는 1000 μL이다. </li><li> 0.5 μM의 MDH 첨가 한 후 상기 버퍼 12.5 μM HdeB (또는 대안 적으로, 버퍼 컨트롤 HdeB 저장 버퍼의 동일 부피)을 추가한다. 광산란 모니터링을 시작. MDH의 전개 충분한 수 있도록 360 초 동안 반응을 품어. </li><li> HPO 4 2 M 버퍼링 K 2의 0.16-0.34 볼륨을 추가하여 7 pH를 올리고 다시 계속또 다른 440 초 동안 광 산란 등에 이용. </li><li> 중화 이후 소정 시점에서 샤페론의 부재에 기록된다 MDH 응집의 정도를 100 %로 설정 (여기서는 MDH의 최대 광산란 관찰 하였다 500 초 후). 각각 나타낸 pH 값에서 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 HdeB의 활성을 정상화. </li></ol> 분석 초 원심 분리에 의해 HdeB-LDH 복합체 형성 3. 검출 (AUC) 주 : HdeB 단독으로 또는 열적 젖산 탈수소 효소 (LDH)를 전개로 복잡 침강 속도 실험 분석 초 원심 분리기를 사용하여 수행 하였다. <ol><li> 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대해 밤새 39 ° C에서 LDH를 투석, LDH을 제조 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 200 μM로 단백질을 집중 kDa의. 참고 : LDH의주의 투석이 LD로 필요H는 황산 암모늄 용액으로 전달된다. </li><li> 4 ° C에서 20,000 XG에 20 분 동안 집계, 원심 분리기 LDH를 제거합니다. 280 nm에서 흡광도 LDH 농도를 측정 (280 nm의 ε = 43,680 M -1 cm-1). LDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 41 ° C에서 15 분 동안 버퍼 D에 30 μM의 HdeB의 유무 (각각의 pH 4, 7)에서 3 μM의 LDH을 품어. 참고 : 완전한 집계에 높은 온도 결과에서 LDH의 배양 및 HdeB없이 보호자 효과를 관찰 할 수있다. </li><li> 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 그런 다음, 표준 분야를 포함하는 세포로로드 샘플은 1.2 cm 경로 길이와 2 채널 중앙 장식품을 형성. 초원 심 분리기에 세포를로드 전에 침전 적어도 1 시간 동안 22 ° C 평형. </li><li> 스핀 22 ° C에서 샘플을 12 시간 동안 각각의 로터에서 167,000 XG, 그리고 나오지도를 모니터링계속해서 280 nm에서의 단백질 imentation. 이미 증명 된 바와 같이 각 채널의 투과광 강도보다 오히려 흡광도를 측정 할 때, 신호 대 잡음비가 향상된다. 이는 또한 후속 데이터 피팅의 품질을 향상시킨다. </li><li> 연속 C (S) 배포 모델 (17)을 사용 SEDFIT (버전 15.01b 2015 12월)으로 데이터 분석을 수행. 방법 SEDFIT를 사용하는 설명하는 튜토리얼 참조 (18)에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 0.7에 ME (최대 엔트로피) 정규화에 대한 신뢰 수준을 설정합니다. </li></ol></li><li> SEDNTERP 19 사용하여 버퍼 밀도뿐만 아니라 점도를 계산합니다. 집계 클라이언트 단백질의 양을 추정 기준으로 pH 7로 pH를 4로 침강 LDH의 적분 값을 비교한다. 주 : 침강 분포도의 통합 SEDFIT에서 직접 수행 될 수있다. 침강 속도 데이터를 분석하는 다른 소프트웨어는 최근의 검토 (20)에서 찾을 수있다. &lt;/ 리&gt; </ol> HdeB의 존재 4. 모니터링 MDH 불 활성화 및 재 활성화 주 : pH의 펼친 MDH의 폴딩 그래피 HdeB의 영향에 MDH 중화 활성을 모니터링함으로써 측정 하였다. <ol><li> 부재 또는 25 μM의 HdeB의 존재에 37 ° C에서 1 시간 동안 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에서 버퍼 D 1 μM의 MDH을 품어. 그 후, 10 분 동안 20 ℃로 온도를 이동. 주 : MDH는 37 °의 C보다 높은 온도에서 배양했을 때 어떤 MDH의 폴딩 심지어 HdeB의 존재는 관찰되지 않았다. </li><li> 산 변성 된 MDH의 폴딩을 개시 0.5 M 인산 나트륨, pH를 8.0 0.13-0.42 양을 첨가하여 pH 7로 시료를 중화한다. </li><li> 20 ° C에서 2 시간 동안 배양 한 후, 340 nm의 구에서 NADH의 감소를 모니터함으로써 MDH 활성을 결정한다. 참고 : MDH는 L 말 산염에 옥 살로 아세테이트의 NADH 의존 감소를 촉매한다. <oL&gt; <li> 분석 완충액 950 μL의 (50 mM의 인산 나트륨, pH를 8.0, 1 밀리미터 옥 살로 아세테이트 및 150 μM NADH)와 인큐베이션 반응물 50 μl를 섞는다. 참고 : 분석 버퍼에 MDH의 최종 농도는 44 nM의해야합니다. </li><li> 20 ° C로 설정 펠티에 온도 제어 블록을 구비 한 분광 광도계 흡광도의 변화를 모니터한다. </li><li> pH를 7.0로 유지 된 44 nM의 기본 MDH에 MDH 활동 상대를보고합니다. </li></ol></li></ol> E.에 HdeB 과발현 5. 효과 산 스트레스에서 대장균 생존 참고 : E. 대장균 MG1655의 게놈 DNA가 발행 프로토콜 (21)을 사용하여 단리 하였다. <ol><li> E.에서 hdeB를 증폭 를 BamHI-레브 GGT의 GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA의 GTC의 AT &amp; T와 hdeB - -를 EcoRI-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C를 PCR 프라이머의 hdeB를 사용하여 대장균 MG1655 </li><li> 다음과 같이 50 μL의 PCR 반응 설정 : 10 μL 5 배 중합 효소 버퍼, 200 μM의 dNTPs, 0.5 μM 프라이머 JUD2, 0.5 μM 프라이머 JUD5, 150 ng를 게놈 DNA의 MG1655, 0.5 ㎕의 DNA 중합 효소를, DDH 2 O 50 μl를 추가합니다. </li><li> 다음과 같이 hdeB의 증폭을 수행 1 단계 : 95 ° C, 1 사이클에서 5 분; 2 단계 : 95 ° C에서 30 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C, 40 회에서 30 초; 3 단계 : 72 ° C에서 10 분. </li><li> 제한 부위 클로닝을위한 표준 방법을 이용하여 플라스미드를 EcoRI pBAD18의 I 및 I를 BamHI 부위로 PCR 단편을 생성 클론. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. 시퀀싱 (10)에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. </li><li> HdeB 또는 변형 BB7224에 빈 벡터 제어 pBAD18 (Δ rpoH) (유전자형 발현하는 플라스미드 변환 : F를 - λ - E14 - [araD139] B / r에 [6 (된 argF-락) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (SM R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: 테네시 (10) (TC S) suhX401 deoC1 아라드 + rpoH :: 관 + 16) 화학적으로 유능한 세포를 사용. 참고 :이 변형 온도를 구분합니다. </li><li> 45 초 42 ° C에서 열 충격과 이전에 도금을 한 후, 30 ° C, 200 rpm에서 세포를 배양한다. 긍정적 인 클론의 단일 콜로니 연속 아웃을 수행하고 하룻밤에 30 ° C를 품어. 50 ml의 LB 앰프에서 하룻밤 문화를 준비하고 200 rpm으로 30 ℃에서 세포를 배양. </li><li> 밤새 배양 물을 25ml의 LB 앰프로 40 배 희석하고 HdeB 단백질 발현을 유도하기 위하여 30 ° C 및 OD를 600 ㎚ 내지 200 RPM = 1.0 0.5 % 아라비 노스 (아)의 존재 하에서 박테리아 성장. </li><li> pH를 변화 실험에, LB를 사용앰프 + 아라는 0.5 OD의 600 ㎚로 세포를 희석 (여기서는의 pH 2.0, pH가 3.0, pH를 4.0) 각각의 pH 값을 조정합니다 (5) M 염산의 적절한 볼륨을 추가하여. </li><li> 표시된 시점 (하여 pH 3, 2.5 분; pH를 2, 1 분, 4의 pH, 30 분) 한 후, 5 M NaOH를 적절한 양을 첨가하여 배양을 중화. </li><li> OD 측정을 사용하여 30 ℃에서 12 시간 동안 액체 배양에서 중화 문화의 성장을 모니터링합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

<html> 활성화 및 HdeB의 샤페론 기능의 메커니즘을 연구하기 위해, HdeB 다량이 발현되고 정제 될 수있다. 발현 벡터 시스템의 숫자는이 연구에 사용 하였다 둘 PTRC 또는 pBAD 벡터를 포함하는 목적 단백질의 높은 수준의 생산에 사용할 수있다. 발기인은 E.에 대해 쉽게 접근 할 수 있습니다 대장균 RNA 중합 효소 및 E.에서 HdeB의 이렇게 강하게 상향 조절 허용 식 대장균 균주. ?...

미생물 병원체가 산에 의한 단백질 전개 상황을 경험하는 일반적인 자연 환경은 그 산성 pH 식중독 병원균 1에 대한 효과적인 장벽 역할을하는 포유류 위 (pH 범위 1-4)입니다. 아미노산 측쇄 양성자로 인한 단백질 응집 펼쳐지는 생물학적 과정, 손상 세포 구조에 영향을 미치며, 결국 세포 사멸 1,2-시킨다. 박테리아 페리 플라 즘의 pH 의한 다공질 외측 막을 통한 양성자의 자유로운 확산을 거의 즉시 환경 pH를 평형화하기 때문에, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질과 내막 단백질 산 스트레스 조건 3 하에서 가장 취약한 세포 성분이다. 빠른 산 - 매개 손상에 대한 자신의 주변 세포질 프로테옴을 보호하기 위해, 그람 음성 세균은 산 활성화 주변 세포질 보호자 HdeA 및 HdeB을 사용한다. HdeA는 조건 흐트러 보호자입니다 <sup&gt; 4,5 : 중성 pH에서 HdeA가 접혀, 보호자 - 비활성 이합체로 존재한다. pH가 3 이하의 pH 변화에 따라, HdeA의 보호자 기능은 신속 6,7 활성화됩니다. HdeA의 활성화는 단량체 6-8의 전개 깊은 구조 단량체로는 해리를 포함하여 변경 및 부분이 필요합니다. 활성화되면, HdeA은 산성 조건 하에서 전개 단백질에 결합한다. 그것은 효과적으로 낮은 pH에서 배양하는 동안뿐만 아니라 pH를 중화에 모두 자신의 응집을 방지 할 수 있습니다. pH가 7.0 반환에, HdeA는 ATP 독립적 인 방식으로 자사의 클라이언트 단백질의 접힘을 용이하게하고 이량 체, 샤페론 비활성 형태 9로 다시 변환합니다. 마찬가지로, 동성 보호자 HdeB은 샤페론 비활성화되어 pH가 7.0에서. HdeA 달리, HdeB의 보호자 활동, pH가 4.0에서 HdeB 여전히 크게 접힌 10 이량되고있는 조건을 겉보기 최대에 도달한다. 또한, 상기 pH를 저하 CAUSHdeB의 비활성화 말이지. 이러한 결과는 광범위한 유사성에도 불구하고 HdeA HdeB은 그들의 보호 샤페론 기능 넓은 pH 범위를 커버 할 수 있도록 기능을 활성화 모드들이 다르다는 것을 제시한다. E.의 내산성에 관여 한 또 다른 보호자 대장균은 중립 상태가 복원 될 때까지 펼쳐진 클라이언트 단백질을 안정화 나타나는 세포질 Hsp31이다. Hsp31의 작용의 정확한 모드는, 그러나, 12 수수께끼 남아있다. 살모넬라와 같은 다른 장내 유해 세균이 hdeAB 오페론이 부족한 점을 감안, 다른 아직 미확인 주변 세포질 보호자가이 박테리아 (11)의 내산성에 관여하는 것을있을 수 있습니다 가능성이 높다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 열 관내 및 HdeB에서의 pH 의존성 샤페론 활성을 모니터링 할 수 있도록 다른 샤페론을 조사하기 위해 적용 할 수있다Hsp31 등. 대안 적으로, hdeAB의 발현을 조절하는 전사 인자의 복잡한 네트워크는 잠재적으로 생체 내 응력 분석에 의해 조사 할 수있다. 생체 내에서 단백질의 샤페론 기능을 특성화하기 위해 상이한 실험 설정을 적용 할 수있다. 하나의 경로는 단백질 전개 응력 조건을 적용 표현형 중 관심의 유전자를 과발현 또는 유전자의 삭제를 수행하는 변이주를 특징 화하는 것이다. 프로테오믹스 연구가 보호자가 존재하면 응력 조건 집합을 더 이상 어떤 단백질들을 식별하기 위해 수행 될 수도 있고, 특정 효소의 샤페론의 영향 효소 분석법 14-16을 사용하여 응력 조건에서 측정 할 수있다. 이 연구에서 우리는 모든 주요 E.의 발현을 제어 RpoH 열 충격 시그마 인자 (32)이 부족 rpoH 삭제 변형에 HdeB를 과발현하기로 결정했습니다 콜라이 샤페론 및 삭제는 SENS 증가하는 것으로 알려져단백질 (15)을 전개 발생할 환경 스트레스 조건 itivity. HdeB의 생체 샤페론 활성은 Δ rpoH 균주의 pH 민감성을 억제하는 능력을 모니터하여 측정 하였다. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 시험 관내에서뿐만 아니라 생체 내 환경에서 산 활성화 샤페론 활성을 특성화하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth mix, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate&amp;nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>100565</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m pore sterile Syringe Filter</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malate dehydrogenase (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Monobasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Dibasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 fluorescence spectrophotometer</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Lactate dehydrogenase (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&#039;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_windowLabel=UCM_RENDERER&amp;amp;_urlType=render&amp;amp;wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/&#039;&gt;392764&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>used for plasmid purification (Protocol 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Cell cuvette</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 spectrophotometer</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of the ph-dependent activity of escherichia coli chaperone hdeb in vitro and in vivo

박테리아 흔히 pH의 변화, 온도, 산화 환원 상태, 노광 또는 기계적 힘 등의 환경 변화에 노출된다. 이러한 조건 중 많은 셀 전개 단백질 원인 유기체의 생존에 불리한 영향을 미친다. 무관 스트레스 특정 분자 샤페론의 그룹이 스트레스 조건의 생존에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 완전히 접혀 및 보호자 - 비활성 스트레스 전에,이 단백질은 빠르게 전개 및 특정 스트레스 조건에서 chaperone 단백질을 활성화하는 동안. 일단 이들 조건 무질서 샤페론 다른 응집 경향 많은 단백질에 결합 활성, 그 응집을 방지하고, 직접 또는 간접적으로 비 응력 조건에 따라 반환 폴딩 단백질을 용이하게한다. 자신의 활성화 및 클라이언트 인식의 메커니즘에 대한 자세한 이해를 얻기위한 기본 접근 방식은 정화 및 subsequen을 포함시험관 샤페론 분석에서 사용하는 이들 단백질의 t 특성화. 생체 스트레스 분석에 후속 독립적으로 시험 관내 결과에서 얻어진 확인할 절대적으로 필수적이다. 이 프로토콜은 E.의 샤프론 활성을 특성화하기 위해 시험 관내 및 생체 내 방법에 대해 설명 콜라이 HdeB, 산 - 활성화 된 샤페론. 광산란 측정은 시험 관내에서, 설정된 모델 클라이언트 단백질 MDH의 산 - 유도 된 응집을 방지하기 HdeB 용량 편리한 판독을 사용 하였다. 분석 초 원심 분리 실험은 아닌 스트레스 조건에 자신의 복귀에 따라 클라이언트 단백질의 운명에 빛을 창고에, HdeB 및 클라이언트 단백질 LDH 사이의 복합체 형성을 나타 내기 위해 적용되었다. 클라이언트 단백질의 효소 활성 분석법을 pH 유도 클라이언트 비활성화 및 활성화에 HdeB의 효과를 모니터링하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 생존 연구 과정 제어하는 ​​데 사용 된생체 내에서 HdeB의 보호자 기능의 영향을 r에.

HdeA 및 HdeB는 E. 상동 있습니다 산 스트레스 조건 (10)에 대해 주변 세포질 단백질을 보호하는 것으로 알려져 대장균 단백질. 우리의 작업은 산 분자 보호자 활성화로 HdeA 유사은 HdeB 또한 기능 것으로 나타났습니다. 그러나, 여전히 잠재적 살균하지만 HdeA 6,9,10,22의 pH 최적보다 상당히 더 높은 pH에서 HdeA, HdeB 기능 대조적이다. 체외 HdeB의 ?...

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

10.3K 조회수.  University of Michigan.  이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다. 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Escherichia coli dnaK756 세포를 사용한 Hsp70 Chaperone 활성 평가

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

저자 스포트라이트: 말라리아 및 결핵 감염에서 열 충격 단백질 탐구

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

세포 Refolding 분석

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

의 pH에 의존 활동의 검출

요약

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에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

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