Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
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This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

알긴산 디스크의 형성 1. 준비 <ol><li> 4 % 준비 (W / V), 37 ° C 수조 첨가 염화칼슘 또는 염화 마그네슘이없는 장소 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 알지네이트 용액. 알지네이트 용액의 농도는 다를 수 있지만, 1~4% (W / V) 알긴산 용액을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 원하는 세포 유형 따뜻한 세포 배양액베이스로 한 (예를 들면, 둘 베코 변형 이글 매체.) : 1의 비율로 알지네이트 용액을 혼합한다. 알기 네이트 농도가 이제 원래 농도의 절반 즉., 2 % (W / V). 멸균 된 0.2 ㎛의 나일론 주사기 필터를 사용 알긴산 / 미디어 용액 살균. </li><li> (- 300㎖의 ~ 200)을 주형 잠수함 충분한 용액을 멸균 무균 102 mM의 염화 칼슘 이수화 물 목욕을 준비한다. </li><li> 멸균 &quot;겔 형성 금형&quot;알루미늄 플레이트 × 3의 3 (6mm 직경 X 3mm 높이의 원통형 우물을 수집, 참조 <strong&gt; 그림 1)과 종판 (바닥 : 하나의 알루미늄 판에 × 3에서 3 위 : 알루미늄 플레이트 × 3 한 1.5) 다음과 같이 금형을 준비 : <ol><li> 약 1 분 두꺼운 종이 필터 (흡착 여과지) 및 상부 및 하부 종판의 크기의 셀 마이크로 시브 막 (10 ㎛의 공극 크기)을 차단시키고, 포화 될 때까지 염화 칼슘 욕에 배치. 필요하다면, 사용하기 전에 30 분 동안 오토 클레이브 또는 자외선을 통해 두꺼운 종이 필터와 마이크로 시브 막 살균. </li><li> 설정 금형 구조의 절반 (하단 참조). <ol><li> 다음 순서에 따라 서로 꼭대기 다음 항목을 넣고 멸균 주걱을 사용하여 부드럽게 : 큰 단부 판 두께 여과지하고 마이크로 시브 막 (3 × 3의 단위). </li><li> 전환 과량의 염화칼슘 용액의 손실을 보장하기 위해 종이 타월의 스택 상에 몰드를 누른다. </li><li> ㄴ 위에 원통형 웰과 &#39;겔 형성 몰드 &quot;놓고엘의 마이크로 시브 막 부드럽게 좌우 양측에 바인더 클립을 이용하여 양면에 함께 몰드를 고정. 완전히 나중에 우물을 충당하기 위해 (의 × 3 1.5) 상단 엔드 플레이트에 대한 충분한 공간을두고 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 설정 금형 구조 하반기 (위쪽 절반). <ol><li> 다음과 같은 순서로 서로 꼭대기 다음 항목을 놓고 부드럽게 : 작은 엔드 플레이트, 두꺼운 종이 필터, 마이크로 시브 막을. </li><li> 반전 및 초과 염화칼슘 용액의 손실을 보장하기 위해 종이 타월의 스택에 금형이 절반을 누릅니다. 이 때 바인더 클립을 사용하여 금형의 끊임 고정하지 마십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 문화 전지는 제조업체의 지침에 따라 권장합니다. 층상 알지네이트 하이드로 겔에 포함 할 원하는 세포를 수확. 권장 세포 밀도는 1 - 2 × 106 세포 / ㎖, 그러나 이것은 실험 목적에 따라 변화 될 수있다. 참고 :이 방법을 사용하는 경우다른 세포 유형의 레이어를 만들기 위해, 레이어에 대한 병렬 문화 두 가지 세포 유형을 확인합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 1 × 106 세포의 세포 밀도로 접종 / ㎖가 다음과 같은 프로토콜을 일례로서 사용한다. 필요에 따라 휴대폰 번호 및 디스크 번호는 실험을 위해 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 기저 성장 배지 10 ㎖ (둘 베코 변형 이글 중간 10 % 태아 소 혈청, 2 % L 글루타민, 1에서 5,000 세포 / ㎠ - 1 ~ 2 주 전에 3000의 세포 밀도에서 시드 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 T-75 플라스크 % 비 필수 아미노산, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). </li><li> 3 일 세포가 80 때까지 기저 성장 미디어 10 ㎖로 교체 - - 매 2 소모 된 용지를 제거 90 % 합류. </li><li> 추가 염화칼슘 또는 세포를 세척하는 염화 마그네슘없이 1 배 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 3 ㎖를, 세포를 수확 동안 미디어를 제거하고, 피펫합니다. 피펫, 0.25 %의 시도 3 ㎖를이 솔루션을 제거T-75 플라스크에서 성장 세포 상에 psin-EDTA를, 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 기저 성장 미디어의 9 ml의 - 세포가 부착 표면에서 해제 한 후, (6)을 추가합니다. </li><li> 원심 엽 줄기 세포는 실온에서 5 분 동안 600 XG에서, 상등액을 흡인하고, (1)에 다시 일시 - 기저 성장 배지 5 ㎖. 디바이스 명령어를 이용하여 혈구를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 원심 동일한 조건을 이용하여, 총 부유 셀에서 1 × 106 세포를 제거하고, 상층 액을 흡인. </li></ol></li></ol> 셀 시드 알긴산 디스크 2. 형성 <ol><li> 1 × 106 세포 / ml의 세포 밀도를 달성하기 위해 무균 알긴 / 미디어 용액 1 ㎖로 세포 펠렛을 다시 일시. 세포가 적절하게 혼합되면, 셀 알긴산 혼합물 외관 균일 흐린 것이다. </li><li> 피펫 금형의 하단에 여섯 6mm 직경 X 3mm 높이 우물에 세포 알긴산 혼합물의 130 μL기포를 생성하지 않도록 적하를 구성. 약간 볼록 메 니스 커스가 아니라 각각의 가장자리 위에 표시해야한다. </li><li> 조심스럽게 멸균 주걱을 사용하여 금형 구조의 위쪽 절반을 부드럽게하고 셀 마이크로 시브 멤브레인은 우물의 상단에 위치하도록 뒤집습니다. 몰드 셀 완전히 알긴산 혼합물을 함유하는 웰을 덮 확인한 웰 위에 구축 놓는다. </li><li> 중앙에 단단히 누른 상태에서,로드 된 금형 구조를 올리고, 바인더는 금형 구조의 상단과 하단 반쪽을 고정하는 나머지 두 측면 (상단과 하단)를 클립. 세포 - 알지네이트 용액을 안전하게 이때 우물에 자리한다. </li><li> 전체 구조가 침수되어 있는지 확인하고, 102 mM의 염화칼슘 화장실에서 고정 금형 구조를 담가. 90 분 동안 실온에서 세포 배양 후드에서 인큐베이션. </li><li> 90 분의 끝에, 102 mM의 염화칼슘의 금형 구조를 제거세포 배양 후드에 종이 타월의 스택에 목욕 및 장소. 네 바인더 클립을 제거하고 금형 구조의 두 부분을 분리합니다. 우물에 형성된 하이드로 겔은 거품이 안 완전히 우물을 작성해야합니다. </li><li> 주걱을 사용하여 조심스럽게주의 깊게 풀고 하이드로 겔을 쐐기 하이드로 겔을 함유하는 웰의 에지를 추적. 몰드 구조체에서 하이드로 겔을 분리 한 후, 직접 칼슘, 염화 마그네슘과 1X 둘 베코 인산염 완충 염수 욕조로 하이드로 놓는다. 5 분 - 1 초과 염화칼슘 용액을 씻어 완전히 겔을 커버. </li><li> 완전히 하이드로 겔을 포함 원하는 요리의 기초 성장 미디어 솔루션 (예., 6 웰 플레이트)에 하이드로 겔을 전송합니다. 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에 최소한 1 시간 5 % 축성 단계를 계속하기 전에 CO 2 품어. 주 : 세포를 함유하는 하이드로 겔을 유지할 수있다3 일 - 다른 세포 집단으로 겔 레이어까지 이때 무한정 세포 배양기는 매체마다 변경이 완료되었는지 제공 요구된다. </li></ol> 알긴산 디스크의 3 레이어링 <ol><li> 1 시간 보육의 마지막 시간 반 동안 수집하고 젤을 어닐링에 대한 멸균 금형 및 솔루션을 준비합니다. <ol><li> X는 (AN 단부 판에 3 (알루미늄 판에서 X 3 3 6 mm 직경 X 1.5 mm 높이 웰)은 &quot;겔 형성 몰드&quot;의 높이 웰 반을 갖는 금형을 체결하여 &quot;절단 금형&quot;준비 좌우의 바인더 클립을 사용하여 알루미늄 판 3). </li><li> X에서 ((알루미늄 판에 × 3의 3 9mm 직경이 X 3mm 높이 우물)는 단부 판에 &quot;겔 형성 금형&quot;보다 직경이 3mm 큰 금형을 체결하여 3은 &quot;열처리 금형을&quot;준비 좌우의 바인더 클립을 사용하여 알루미늄 판 3). </li><li> 의 솔루션을 준비100 mM의 시트르산 나트륨 / 30 mM의 EDTA 멸균 수 (구연산 나트륨 이수화 물, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 테트라 나트륨 염 이수화 물). </li></ol></li><li> 원하는 세포 인구의 젤 제거합니다 (이 예에서, 두 중배엽 줄기 세포의 디스크) 접시에있는 미디어에서, 그리고는 &quot;절단 금형&quot;우물에 배치합니다. 각 겔 금형 위에 돌출 겔의 절반 우물에 잘 맞도록해야한다. </li><li> 메스를 사용하여, 금형의 표면을 따라 겔 (이 반 하이드로 겔을 절단한다) 조각. 겔의 상단 절반 플립 오픈 금형 우물에 배치합니다. 겔의 절반도 잘 금형에 잘 맞해야하지만, 지금은 모두 반 겔은 보이는 잘라 내면 몰드의 높이를해야한다. 두 번째 젤 반복합니다. 참고 : 경고 : 만 내부 절단면은 레이어 디스크를 형성 할 것이다. 외면을 사용하면 반 분리 될 것이다. 이 겔 표면 방지에 전사 마이크로 시브 막에서 그 질감을 의심어닐링 공정의 성공. </li><li> 마이크로 시브 막을 어닐링하는 겔 절반 모두와 접촉하는 것을 확인하고 완전히 덮어서 웰의 상부에 건전지 마이크로 시브 막 조각을 놓는다. 완전히 젤을 포함해야하고, 마이크로 시브 막 위에 두꺼운 종이 필터를 놓습니다. </li><li> 이 포화 될 때까지 필터 두꺼운 용지에 100 mM의 시트르산 나트륨 / 30 mM의 EDTA (구연산 나트륨 이수화 물, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 테트라 나트륨 염 이수화 물)의 용액을 피펫. 약 750 ㎕의 네 우물에 충분하다. </li><li> 실온에서 1 분 동안 인큐베이션 젤. 이어서, 세포 마이크로 시브 막 두께 여과지를 제거하고 폐기. 바인더 클립을 제거하고 곰팡이를 엽니 다. </li><li> 각 어닐링 젤, 절단면이 위쪽으로 향하도록 준비 &quot;어닐링 몰드&quot;로 하이드로 겔의 일 시트르산 나트륨 / EDTA 처리 반 옮긴다. 이것은 어닐링 CONST의 절반 것ruct. </li><li> 절단면이되어 있으므로,이 후반 겔을 내리고, 이미 &quot;어닐링 몰드&quot;의 겔상에서 (다른 셀 타입을 포함 할 수있다) 주걱, 리프트를 이용하여 제 시트르산 나트륨 / EDTA 처리 반 겔 배치 이미 &quot;어닐링 몰드&quot;의 겔의 절단 표면에 접촉. </li><li> 부드럽게 아래로 두 젤에 사이의 거품을 제거하기 위해 주걱을 사용하여 두 젤 누릅니다. 그들은 서로의 상단에 직접적 있는지 확인하기 위해 필요에 따라 또한, 젤의 위치를​​ 변경. </li><li> 부드럽게 &quot;어닐링 주형&quot;을 올리고, 30 분 동안 102 mM의 염화칼슘 욕에서 잠수함. 엔드 플레이트와 우물을 덮지 마십시오. </li><li> 30 분 배양 한 후, &quot;열처리 금형&quot;을 제거하고 종이 타월 위에 놓습니다. 바인더 클립을 제거하고 엔드 플레이트에서 금형을 분리합니다. </li><li> 어닐링 젤을 수집하고 염화칼슘 및 m와 1 배 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수로 배치, 주걱을 사용하여agnesium 염화 목욕 젤을 씻어. 이어서, 소망의 접시에 세포 배양 배지 어닐링 하이드로 겔을 트랜스퍼 (예. 6 웰 플레이트) 배양. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기, 우리는 예를 들어 생리 학적으로 계층화 된 조직에서 그, 연골 등 여러 세포 집단의 공동 문화를 연구하는 계층화 된 알지네이트 하이드로 겔 디스크의 형성을위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 기재된 배양 플랫폼으로서 계층화 구조, 동일한 배양 환경이나 하중 하에서 행하여 두 개의 별개의 세포 집단 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다. 알긴산은 ?...

이러한 관절 연골이나 척추 디스크와 같은 압축 하중 베어링 조직은 조직에서 모두 생체 역학적 기능과 적절한 메카-전달에 중요한 이종 조직 영역으로 구성되어 있습니다. 뿐만 아니라이 세포 조직과 다른 지역의 구별을 작동하지만, 세포 외 기질 (ECM)도 조성 및 조직의 변화된다. 예를 들어, 관절 연골은 다양한 세포 형태, 기계 기능, ECM와 세 가지 주요 영역으로 구성되어 있습니다. 로드 베어링 책임을 차등 그들의 ECM 리드의 차이; 중간과 깊은 영역이 압축 1 응답을 주로 책임있는 동안 표면 층은 주로로드 인장 응답에 참여하고있다. 마찬가지로, 추간판에 겔상 수핵은 라멜라 환형 섬유화에 의해 둘러싸인 이들 두 개의 별개의 영역 내에서 세포 생 물리적 자극의 종류를 경험티슈가 겪는 기계적인 힘에 반응로 (2). 티슈 층 내의 조직, 세포 및 세포 외 매트릭스의이 종류가 서로 상호 작용한다. 이러한 이종 조직 구조의 재현부는 조직 공학 및 재생 의학에 도전 남아 있고, 생물학적 중요성에 대한 우리의 이해는 제한됩니다. 일 구조에서 세포 개체군의 층상 조직과 공동 배양 분석 플랫폼 배양이 필요하다. 관절 연골 조직 공학에서, 비계없는 계층 구조는이 조직 3,4의 다른 레이어를 모방하는 다양한 ECM을 증착하는 동서 연골 세포의 능력을 활용하여 구성되어있다. 그러나, 적층 구조 하이드로 겔 독립적 견고한 조직을 형성하는 능력이 부족한 세포 집단 다양한 형태의 상호 작용을 연구하기위한 기회를 제공한다. 예를 들어, 다른 팝업중간 엽 줄기 세포의 ulations 계층화 구조물 내에 공 배양 할 수있다. 이러한 층상 지지체는 연골 향상된 조직 공학 5 중간 엽 줄기 세포의 분화를 모두 사용되어왔다. 뿐만 아니라, 다른 세포 집단 유사한 겔 층에서 배양-협력 할 수 있지만, 하나의 세포 유형은 세포 -6,7- 상이한 반응을 유도하는 다양한 강성 또는 생화학 함량을 갖도록 조작 한 층 내에서 배양 될 수있다. 다양한 생체 하이드로 겔은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리 비닐 알콜을 사용하여 염기 7-9 것과 연골 조직 공학을위한 세포 집단 레이어하는데 사용되어왔다. 그러나, 알지네이트 하이드로 겔은 공동 문화에서 이종 세포 인구를 공부 계층 발판을 만드는에서 간단한 생체 재료 중 하나입니다. 아가 로스 하이드로 겔은 쉽게 형성되지만, 알지네이트 하이드로 겔은 쉽게이 허용하는 추가 혜택을개별 세포의 분석을 위해 3-D 구조에서 셀 olation 이전 10 설명한 바와 같이. 이전의 연구에서, 이중 층 알지네이트 하이드로 겔은 얇은 시트에 형성되었으며, 이러한 시트에서, 섹션 분리되었다 (예., 생검 펀치 사용) 등의 생화학 적 내용이나 계면 전단 특성 (11, 12)의 분석과 같은 특정 응용 프로그램을. 알긴산 얇은 시트를 형성하기위한 다른 방법은 복수의 층으로 층화의 가능성을 설명 하였지만, 여전히 기계적 시험 (13)에 사용하는 하이드로 겔에 대한 변경을 필요로한다. 여기서는 재현성 세포를 공동 배양하는 다른 집단에서 사용하기위한 이중층 알긴산 겔 디스크를 생성하기위한 방법을 제시한다. 이것은 알긴 디스크 플랫폼은 여러 가지 장점을 가지고있다. 주로, 재생 가능한 형상과 작은 크기 생검 PU 없이도 내장 세포의 기계적 자극 도움이되는NCH​​ 또는 여러 응용 프로그램의 하이드로 겔에 다른 물리적 변경. 또한, 세포 생존율은 레이어링 공정 동안 높게 유지하고, 겔 형성 후에 겔 내의 두 개의 세포 집단의 명확한 분리가없는 초기의 중복 영역으로 볼 수있다.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

도 1은 알긴산 하이드로 겔의 형성 및 레이어를 도시한다. 이러한 하이드로 겔 계층화 높은 벌크 하이드로 비교 남아 내에 내장 인간 중간 엽 줄기 세포의 그림 2. 세포 생존)에 도시 된 바와 같이,도 3에서와 같이 세포 집단의 전체 초기 거리를 나타내는 이중층 겔 완료. 생존력을 평가 하였다 어닐링 후, 다음 가운데에 액세스 할 수 수...

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Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K 조회수.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

발생학

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

의학

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...