This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV 균주 및 취급 참고 : 재조합 비 확산 HSV-1 (KOS) gL86과 HSV-2 (KOS) 333gJ을 - V. Twiari (36, 37)에 의해 제공되었다 사용되는 베타 - 갈 락토시다 아제 리포터 활동. <ol><li> 1에서 -80 ° C에서 단일 많이 매장에서 바이러스를 사용하여 둘 베코의 변형 이글의 중간 20 % 소 태아 혈청 (FBS)와 (DMEM)의 1의 비율로 사용 할 때까지 우유를 탈지. 바이러스 많이 저장하기 전에 입출력 -nitrophenyl-β-D-갈 락토 (ONPG) 및 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 β-D-갈 락토 (X-GAL) 분석으로 바이러스의 농도를 결정한다. </li><li> 이전에 (그림 1) 14 설명한 바와 같이, 기자 바이러스 항목 분석을 사용하여 각 실험 분석 실행을 위해 X-걸 염색에 의한 바이러스의 생존과 감염 (MOI)의 다양성을 결정합니다. </li><li> 원하는 MOI로 바이러스 (수신 거부 MEM)을 희석. 단일 층 (파라 포름 알데히드를 0.5 ㎖ / 웰) 수정 염색 전합니다. 별도의 microti에서 바이러스의 생존 컨트롤을 배치polymicrobial 분석 플레이트와 병렬 터 플레이트. </li></ol> 2. 헬라 299 셀 처리 <ol><li> 4.5 g / L 글루코스, 10 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청 (FBS), 겐타 마이신 (50 μg의 / ml) 및 L- 글루타민으로 DMEM에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 성장한다. 트립신 용액과 80 %의 합류 통로 세포 (0.05 % 트립신, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, 0.53 M EDTA 5 ㎖ / 플라스크). </li></ol> 3. C. 알비 칸스 처리 참고 : C를 임상 실험에서 얻어진 소스 알비 매체 2X 탈지 우유 Remmel에서 -80 ° C에 저장된다. <ol><li> 문화 사부로 포도당 중간 (37 ° C)에 주식을 동결. 24 시간 배양 C. 후 Fungisel 매체에 알비 칸스 (37 ° C, 48 시간) 사용. </li><li> 세균 튜브 (GT) 형태의 생성 (3 ML의 FBS를, 대표적인 식민지를 선택 3 시간 37 ° C, 복근 600, 0.3). 배양 후, 세척 GT (HBSS를, 배, XG 4000 참조). (37 예열 HBSS로 세척 GT 추가# 176; C; 0.32 복근 600). GT 양식은 혈구 수에 의해 결정되는 관찰 세포의 99 %이어야한다. </li><li> 대표 Fungisel 식민지를 선택하여 효모 형태 (YF) 주식 현탁액을 (HBSS, 3 ㎖를, 0.32 복근 600). YF 형태의 수를 카운트 / 혈구 현미경을 사용 ㎖로. YF 양식은 혈구 수에 의해 결정되는 관찰 세포의 99 %이어야한다. </li><li> 곰팡이 주식을 작동합니다 (25 ml의 HBSS에 GT 또는 YF 주식의 250 μl를 37 ° C, 10 5 CFU / ㎖) </li></ol> 4. S. 구균 처리 <ol><li> 스토어 S. 구균 ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel 우유의 2 배를 탈지). 양 혈액 아가 상 배양 (5 %, 37 ℃, 24 시간). 대표적인 식민지를 선택하고 재고 2 일 이내에 매체 염을 만니톨로 전송 (37 ° C, 18 시간을). </li><li> S.합니다 구균 재고 서스펜션 (3 ml의 HBSS, 1.32 복근 600 10 8 CFU / ㎖) <ol><li> S. 작업 확인 구균 재고 (100 μL25 ml의 HBSS의 재고; 105 CFU / ㎖). </li></ol></li></ol> 5. 칸디다 및 S. 구균 현탁액 <ol><li> 혼합 C. 확인 알비 칸스 및 S. 구균 현탁액 (250 μL의 YF 또는 GT 재고 및 25 ml의 HBSS 100 μL S. 구균 주). </li></ol> 6. Polymicrobial 바이오 필름 분석 <ol><li> 2 × 105 HeLa 세포 / ㎖의 200 μL (85 % 합류 레벨)와 종자를 96 웰 플레이트. 락 플레이트 (30-45 분 37 ° C) 배양 전 (37 ° C, 5 % CO 2 배양기 18 시간). 워시 단일 층 (1 배, 수신 거부 MEM) 다음 HSV와 시드 (HSV-1 (KOS) gL86 또는 HSV-2 (KOS) 33 GJ - 100 μL에서 탈퇴 MEM, MOI 50, 10). 판을 품어 (37 ° C, 3 시간 5 % CO 2). 하루에 단 하나의 바이러스 균주를 사용합니다. </li><li> 감염 단일 층을 씻으 (1 배, 인산염 완충 생리 식염수 마그네슘이와 칼슘이와 (PBS) 100 μL). 25 &amp; # 떠나는 따뜻한 HBSS와 PBS를 교체(181) 각각 잘 리터. <ol><li> YF, GT 및 / 또는 S. 추가 (, 셀 비율 = 5 100 μL 대상 : 1; N = 16) 작동 구균 현탁액. 표 1에 나타낸 바와 같이 판 부화 (정적를 30 분, 37 ° C, 5 % CO 2). </li></ol></li><li> 배양 후, 한 번에 흡인 한 열은 즉시 마그네슘이와 칼슘이 300 ㎕의 PBS로 보충. (시 50 분 희석 200 μL; 필터 살균 RIPA)는 무선 면역 분석 용해 버퍼를 추가 한 다음 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 빠르게 헬라 세포 용 해물 후 만니톨 염 (MS) 및 / 또는 Fungisel (F) 미디어 (그림 2)에 50 μl를 배치 ​​씹다. 90 ° 각도로 유리로드 절곡하여 분해물을 확산. (37 ° C에서 18 시간) 번호판을 품어. 수동 접시 당 콜로니의 수를 계산합니다. 컨트롤 S. 구성 구균 및 / 또는 C. HSV-감염되지 않은 HeLa 세포에 albicans에 부착. </li></ol> 7. 이미징 연구 &lt;/ P&gt; <ol><li> 각 라운드 유리 커버 슬립을 씻으 (12mm, 50 ml의 아세톤 비이커 100). 건조하고 소독 된 커버 (매직 잉크를 킴 와이프, 유리 페트리 접시). 알코올 불꽃 소독 집게로 멸균 24 웰 플레이트의 우물에 건조 멸균 된 커버를 놓습니다. </li><li> 세척 멸균 라운드 커버 글라스를 포함하는 24 웰 플레이트의 웰에, HeLa 세포 (96 웰 플레이트에 사용되는 5 배 볼륨 1 ml)에 추가합니다. 위의 단계 6.4 6.2.1에 설명 된대로 다음 부화 및 프로세스, 5 배 96 웰 플레이트에 사용되는 볼륨의 템플릿 (표 2)에 따라 바이러스, 세균 및 곰팡이를 추가합니다. </li><li> 최종 세척 한 후, 메탄올 슬라이드를 범람하고 증발 할 수 있도록하여 현미경 세포를 고정합니다. 염색 할 때까지 실온에서 접시를 저장합니다. </li><li> 밝은 필드 현미경 (1000 배 최종 원래 배율)의 경우 탈 이온수로 메탄올 고정 된 커버를 포함하는 우물을 입력합니다. 즉시 물을 대기음. 그램 크리스탈 바이올렛 각 커버 슬립 커버. 워시가 아닌 바운드 얼룩 (탈 이온수)의 무료 된 커버. 현장에서 건조 된 커버는 레이블 슬라이드 매체를 장착 하드 세트 (그림 3)로를 준수합니다. </li><li> 형광 현미경 (100 배 대물, 1000 배 최종 원래 배율)의 경우 단계 7.4에 설명 된대로 세척은 본질적으로 메탄올 무료로 된 커버. 우물에서 커버 슬립을 건조. <ol><li> 건조 후, 커버 전표를 제거하고 표시된 슬라이드에 배치합니다. (- 5 μL 1) 다음 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 공역 계 단순 포진 바이러스 유형의 1시 20분 희석의 커버 슬립을 커버하는 1 + 2 GD 항체를 충분한 양을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 습도 챔버에 슬라이드를 부화. 부화 후, PBS의 4 변화에 커버 슬립을 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 표시된 슬라이드에 커버 슬립을 반환합니다. 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (; 수분 챔버에서 30 분 동안 37 ° C DAPI)로 염색. 부화 후 4 찬으로 된 커버를 세척PBS의 GES 후 하드 세트 장착 매체와 표지 슬라이드에 부착합니다. </li><li> 설치 매체가 어둠 속에서 실온에서 24 시간 동안 치료하도록 허용합니다. 밝은 필드 현미경 또는 FITC와 DAPI 차단 필터 형광 현미경 중 하나에 기름 목표 아래 커버 슬립을 검사합니다. 공동 현지화 (그림 4) 적어도 50 분야 (생물 최소 100 세포) 사진을 검사합니다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

현재 어떤 정보는 원핵 생물 진핵 세포 및 바이러스 성 즉, 다수의 분류 학적 영역을, 교차 호스트 마이크로 바이 옴의 준 상임 이사국에 영구적 인 사이의 복잡한 상호 작용에 사용할 수 없습니다. 그러므로 우리는 S.으로 생물막 개시를 연구하기 위해 체외 모델 시스템에서 새로운 개발 구균 및 C. HSV-1 또는 HSV-2에 알비 칸스는 헬라 229 (헬라) 세포 <su...

<html> 인간 마이크로 바이 옴 몸에 지리적 영역을 공유하는 여러 분류 학적 왕국에서 다양한 생물이 포함되어 있습니다. 세포 표면에 준수는 마이크로 바이 옴의 식민지화 과정의 일부입니다 생물막 형성에 필수적인 첫 번째 단계입니다. 마이크로 바이 옴에 포함 된 만성 및 지속적인 감염의 원인 바이러스가 될 수 있습니다. 이 바이러스에 의한 만성 세포 감염이 추정되는 수용체의 가용성에 변화를 일으킬 수 있습니다. 또한 1, 2, 세포 내 병원균에 의한 세포 항목도 차례로 박테리아와 곰팡이를 포함한 다른 마이크로 바이 옴 회원의 첨부 파일을 변경할 수 있습니다 호스트 막 유동성 / 소수성에 영향을 미칠 수 . 인간 숙주의 동일한 지리적 영역에서 - 지역화 공동이 여러 병원체 사이에서 발생할 수있는 상호 작용을 이해하기 위해, 우리는 점막 표면에 존재하는 분류학 왕국의 스펙트럼을 나타내는 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있어야한다. t &quot;&gt;는 헤르페스는 마이크로 바이 옴의 상임 이사국으로 인간의 100 %에 존재하는 미생물의 가족은 3,4. 또한 그들은 또한 지속적으로 증상의 유무에 모두 흘려 될 수있다. 특히, 단순 포진 바이러스 1 및 단순 헤르페스 바이러스 -2 (HSV-1, HSV-2, 각각)는 oronasopharynx 및 생식기의 마이크로 바이 영구 부재이다. 면역 능력이 개인, 두 HSV-1, HSV-2 원인 gingivostomatitis은 물론 음부 포진 5-8.이 사이트에서 HSV는 만성 지속적 nectins, 헤파 란 황산, 지질 뗏목 및 헤르페스 바이러스 항목 중재자의 표면 발현의 변화 세포 결과로 HSV 9. 항목 흘리기 바이러스 증상 / 종양 괴사 특징으로하는 잠재 감염의 원인 인자 수용체 (HVEM / TNFR) 10-25. 일부 박테리아와 곰팡이, 예를 들면 황색 포도상 구균과 C. albicans에 대한이 잠재적으로 공유 나타냅니다 수용체있는 기회 병원균 동안,또한 oronasopharynx (26, 27)의 점막 마이크로 바이 옴의 구성원으로 상주 할 수 있습니다. oronasopharynx S. 내 구균 및 C. 알비 칸스는 식민지의 두 가지 위치를 차지한다. 자연 치아와 호스트에서 구강 점막은 HSV-1과 C.에서 공유 알비 칸스, 전방 코 콧 구멍은 S.에 의해 점유하는 동안 구균 28. 그러나에도 불구하고 체외 조사 결과 그 S. 구균 입 상피 세포에 부착, 29, 30 S. 정상 조직은 29, 30 존재할 때 구균은 드물게 구강 검체에서 분리된다. 리틀는 임상 연구 결과 그 이상 생식기 공동 식민지의 틈새 시장에 관한 알려져있다 S. 구균은 C.하면서, 생식기 염증, 방전 및 성교통 특징, 에어로빅 질염과 연관된 알비 구강 31-35에서 관찰 된 것과 유사한 점막 병변을 생성한다. 따라서, 구강과 생식기 microbi 이러한 회원하지만의 상호 작용에 관한 알려진 작은 오메 크로스 분류 학적 왕국 숙주 세포 표면 5 준수를 통해 biofilm 형성을 시작하기에 영향을 미치기 능력이있다. 이 프로토콜은 효과적으로 공동 정착 / 감염의 기능적 결과를 결정하는데 적용되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

곰팡이, 박테리아와 바이러스를 포함 분류학 왕국에서 polymicrobial 상호 작용의 연구는 이전에 마이크로 바이 옴의 바이러스 성 회원이 바이러스에 감염된 숙주 세포와 후속 미생물의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 조사되지 않았다. 세균 및 진균과 바이러스의 공동 주거 구강 및 생식기의 점막 표면에 주로 존재한다. 점막 세포, 지속적인 만성 또는 지속적인 잠재 바이러스 감염 특히이 표현 수용체의 상당수에서 바이러스 변경을 통해 마이크로 바이 옴의 구성원에 미치는 영향과 유형을 가질 수있다. 숙주 세포의 막 구조의 변형이 바이오 필름의 형성, 즉 부착하는 첫 번째 단계를 개시하기 위해 상주하고 기회 병원균 후속 부재 변형 기능을 초래할 것이다. 이 연구는 biofil의 시작에 HSV의 효과의 정량 및 육안 검사하는 방법을 설명합니다S. m의 형성 (부착) 구균 및 C. 알비 칸스.

이 보고서에 설명 된 시스템에서 얻을 수있는 데이터의 안정성의 수준은 그림 2 AF (38)에 표시됩니다. 이 시스템의 사용을 통해 바이러스로 감염된 세포와의 상호 접착에 미치는 효과 포도상 진균 작용의 조절을 묘사 할 수있다. polymicrobial 상호 작용은 동일한 세포에서 발생되는지 여부를 결정하기 위해도 3 및도 4에 도시 된 ?...

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Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K 조회수.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

면역학 및 감염병학

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

생체공학

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>다양한 박테리아의 이동 및 생물막 형성 측정

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

다양한 박테리아의 이동 및 생물막 형성 측정

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

Source: Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al.&#160; <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52239">Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal&#39;s back region for biofilm development.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

1. C. albicans Growth

	Twenty-four hours before the initiation of the animal experiment, prepare yeast extract peptone dextrose, YPD plates by adding 10 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

요약

더 많은 비디오 탐색

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

유학을위한 방법론

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

다양한 박테리아의 이동 및 생물막 형성 측정

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칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법