Name: a phenotyping regimen for genetically modified mice used to study genes implicated in human diseases of aging
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
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이 연구를위한 자금 조달은 진달래 의료 재단과 예일 의과 대학 학장의 연구 기금 (JH)에서왔다. 우리는 행동 실험에 대한 도움말 박사 클레어 코닉 감사합니다. 유전자 조작 마우스 라인 Ozgene (퍼스, 호주)에서 발생 하였다.

윤리 문 : 동물과 관련된 연구는 예일 대학의 실험실 동물의 관리 및 사용과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 건강 권고의 국립 연구소 준수 실시 하였다. 유전자 변형 마우스 1. 행동 테스트 주 : 모든 마우스는 처리에 습관화 차이를 제한하기 위해 동일한 시험 요법을 실시해야한다. 시험 날의 동일한 시간마다 수행되어야한다. <ol><li> 신생아 뒷다리 테스트 주 : 뒷다리 시험 근위 뒷다리 근력, 쇠약 및 피로를 평가하기 위하여 생후 P10로 일 (P) 4 매일 수행된다. <ol><li> 시험 영역으로 전송 마우스는 시험 전에 30 분 동안 휴식을 허용합니다. </li><li> t의 바닥에 두 개 (P4-P8) 또는 1 (P9-P10)면 공을 추진, 70 % 에탄올로 50 ML 원뿔 튜브를 청소하여 시험 장치를 준비우베는 수직 위치에 고정. </li><li> 케이지 기록 무게에서 한 강아지를 제거합니다. 테스트하지 때마다 열 패드 트레이를 들고 강아지를 유지합니다. </li><li> 부드럽게는면 공을 향해 아래로 향하게되도록, 원뿔 튜브의 변죽을 통해 신생아의 뒷다리를 일시 중지합니다. 스톱워치를 사용하여 가을에 만든 풀 시도 및 측정 대기 시간의 수를 계산합니다. </li><li> 마커와 강아지 레이블을 한 번 더 반복 한 다음. 그 후, 발가락 클리핑에 의해 P6 새끼를 식별합니다. 교체하기 전에 홈 케이지에서 침구 부드럽게 새끼를 문질러. </li><li> 70 % 에탄올로 원뿔 튜브를 닦아주십시오. </li><li> 전체 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 강아지에 테스트를 반복합니다. </li><li> 목화 공 및 원뿔 튜브 폐기하십시오. 70 % 에탄올로 청소 모든 장비. </li></ol></li><li> 젖을 갓 뗀 관측 테스트 참고 : 젖을 갓 뗀 관찰 시험은 운동과 일반 활동 수준을 점수로 P21로 P19 매일 투여한다. <ol><li> 테스트 영역 (A)에 전송 생쥐차 테스트하기 전에 30 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 세척하여 기본 2 인치 사각형의 좁은 격자 표시 플렉시 글라스 테스트 상자를 준비합니다. 전체 상자가보기 필드에되도록 측에 비디오 장치를 설정합니다. (가) 설정하고 새로운 항목을 도입 피하기 위해 매일 같은 환경 유지. </li><li> 깨끗한 유지 컵에 케이지와 장소에서 한 젖을 갓 뗀를 제거합니다. 녹음 무게. </li><li> 마우스 식별 번호, 나이, 테스트 날짜, 시험 인증 카드를 촬영하여 동영상 촬영을 시작한다. 중앙 광장에 컵을 들고에서 마우스를 전송합니다. 3 분 동안 시간 시험 동안, 마우스 두 앞발로 이송 라인 수를 카운트. </li><li> 깨끗한 케이지과 끝 비디오 녹화에 마우스를 돌려줍니다. </li><li> 70 % 에탄올로 시험 장치를 청소합니다. </li><li> 모든 쓰레기가 테스트 될 때까지 다음 홈 케이지에 모든 새끼를 반환 반복합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 청소 모든 시험 장비. </li><li&gt; 동영상을 사용하여, 마우스 지원의 명확한 두 앞발을 의미 경우, 육안 관찰 후 집계, 두 앞발이 청소에 종사하는 이벤트를 정리하여 이벤트를 양육의 수를 정량. </li></ol></li><li> 와이어 메쉬 그립 강도 시험 주 : 악력 시험 P22과 P26 사이의 다른 일 실시하고, 신경 근육 강도를 평가. <ol><li> 시험 영역으로 전송 마우스 및 테스트하기 전에 30 분 동안 홈 케이지 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 플렉시 글라스 상자와 메쉬 그리드를 청소하여 장치를 준비합니다. 상자의 바닥에 버블 랩을 놓고 종이 커버. </li><li> 개별 지주 컵에 배치하는 세 그룹으로 분리 된 쥐. </li><li> 와이어 메쉬의 중심에 최초의 마우스를 놓고 천천히 플렉시 글라스 상자의 아래쪽에있는 부드러운 표면 위에 10-20cm를 반전. 스톱워치를 사용하여 떨어 대기 시간을 측정한다. 마우스를하지 않는 경우 60 초 경과 후 시험을 종료가을. </li><li> 70 % 에탄올로 메쉬와 버블 랩을 통해 용지를 교체 와이프 ​​들고 컵에 마우스를 돌려줍니다. 처음으로 돌아 가기 전에 그룹의 나머지 두 쥐에 대한 테스트를 실시한다. 각 마우스가 세 번 총을 시험 때까지 반복합니다. </li><li> 깨끗한 케이지에 그룹을 반환하고 나머지 그룹을 계속합니다. 어떤 그룹의 세 가지 마우스보다 적은 경우, 5 분 간 재판 복구 간격이 허용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 홈 케이지에 마우스를 모두 반환 70 % 에탄올로 종이와 깨끗한 시험 장비 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 망막 구조 2. 시험 <ol><li> 복강 내 케타민 주사 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)에 의해 P30-35에서 동물을 마취. 발바닥을 협지함으로써 마취 깊이를 평가하고 IACUC 지침 라인에만 응답의 부재하에 수행. 4 % PFA / PBS (48) 관류. </li><li> 절개시에 피부를 청소, 눈을 제거하려면두개골의베이스에 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 테. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 깨끗한기구를 사용하여주의 깊게 눈 소켓 도달 눈을 노출 두개골을 잘랐다. 조심스럽게 소켓에서 눈을 제거하고 PBS로 씻어, 시신경을 절단. </li><li> 실온에서 10 분 동안 4 % PFA / PBS에서 쳐다. </li><li> PBS를 포함하는 작은 페트리 접시에 눈을 넣습니다. 스티치 제거 가위를 사용하여 각막의 중앙에 작은 절개 부위를 만든다. 각막과 공막 사이의 가장자리를 절단하여 각막을 제거합니다. 조리개를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 마지막으로, 망막 손상과 장소에 렌즈를 떠나 RPE 층을 벗겨. 주 : 4 % PFA / PBS에서 고정이 RPE 쉽게 망막의 외부로부터 박리 할 수​​ RPE 박리의 원인이된다. </li><li> 다시 수정 PBS를 함유하는 페트리 접시에 눈에 반환하기 전에 4 % PFA / 30 % 수 크로스, 실온에서 15 분 / PBS있다. 렌은 잡아 당깁니다그것과 함께 유리체을 가져, 집게를 사용하여이야. </li><li> 밤새 4 ° C에서 30 % 자당에 Cryoprotect. </li><li> 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 및 전송에 코트 눈. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도​​록 눈의 방향. 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 침지하여 주형 플래시 동결. -80 ° C에서 보관 블록. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 20 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다. </li><li> 표준 프로토콜 49에 따라 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 부분. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지. </li></ol> 3. 조직 화학적 염색 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 오픈 드롭 흡입을 통해 이소 플루 란 과다 복용 (프로필렌 글리콜 30 %)를 사용하여 P30-35에서 동물을 안락사. 중단에 의해 안락사 평가호흡, 심장 박동 및 발바닥을 곤란에 대한 응답의 부족. IACUC 지침에 맞춰 자궁 경부 전위 및 장기 제거에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> 두개골의 기지에서 피부를 통해 절단하기 전에, 70 % 에탄올로 절개 부위의 피부를 청소, 뇌를 제거합니다. 70 % 에탄올로 두개골과 청소를 노출 피부를 벗겨. 조심스럽게 두개골을 잘라 깨끗한 도구를 사용하여 뇌를 노출 제거합니다. 멤브레인을 제거하고 부드럽게 두개골 캐비티에서 뇌를 제거합니다. PBS로 씻어. </li><li> 신선한 OCT를 포함하는 포함 금형에 OCT 뇌 및 전송 코트. 시상면은 가능한 한 적은 수의 동작을 사용하여 기포의 도입을 피 절삭면과 평행이되도​​록 방향을 뇌. -80 ° C에서 드라이 아이스 / 에탄올 욕조와 저장소에 금형을 침지하여 플래시 동결. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 10 μm의 시상 부분을 잘라 미리 세정 슬라이드에 수집합니다. </li></ol></li> &lt;리&gt; NADH 디아 포라 염색 <ol><li> 1L-탈 이온수에 5.72 g 트리스 - 염산 및 1.66 g의 트리스 기반을 용해하여 0.05 M 트리스 완충액, pH가 7.6을 준비합니다. 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> NADH 용액 (0.05 M 트리스 완충액에서 2.25 mM의 NADH)를 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. </li><li> NBT 용액 (0.05 M 트리스 완충액 2.5 mM의 니트로 블루 테트라 졸륨)를 준비합니다. 유리 병에 최대 6 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 염색 액을 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 NADH 솔루션 및 NBT 솔루션의 동일한 볼륨을 결합합니다. 30 분간 가온 챔버 내에 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 대기음 염색 액과 DH 2 O.로 3 회 씻어 </li><li> 오름차순 및 내림차순 아세톤 농도로 3 회 세척 / DH 2 0 (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분. </li><li> DH 2 O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 광학 현미경을 사용하여 이미지의 밝은 f를 위해 장착의 ield 현미경. 블루 염색 효소 활성에 해당합니다. </li></ol></li><li> 탈수소 효소 조직 화학 염색을 숙시 네이트 <ol><li> 0.2 M 나트륨 염기 인산 / DH 2 O 0.2 M 나트륨 이염 인산 / DH 2 O. 준비 </li><li> 20 부 나트륨 이염 인산 3 부 염기성 인산을 결합하여 0.2 M 인산 완충액, pH가 7.6를 확인합니다. </li><li> 염색 용액 (0.1 M 나트륨 숙시 네이트, 0.2 M 인산 완충액 1.25 M NBT)를 준비하고 각각의 슬라이드에 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 60 분 동안의 가습 챔버 내에서 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 대기음 염색 액과 DH 2 O. 세 번 씻어 </li><li> 오름차순으로 3 회 세척하고 아세톤의 농도를 내림 / DH 2 O (30 %, 60 %, 90 %, 60 %, 30 %)을 실온에서 2 분. </li><li> DH 2 O에 세 번 씻어 수성 매체 섹션을 탑재합니다. 밝은 필드 현미경을 위해 장착 된 광학 현미경을 사용하여 이미지. 블루 염색은 실내에 해당zymatic 활동. </li></ol></li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

강력한 치료법은 인간의 노화와 관련된 쇠약 상태의 영향을 제한 할 필요가 있지만, 여러 조건을 피하는 유지된다. 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개입 전략을 개발하기 위해, 원인과 노화와 관련된 질병의 병리 먼저 이해해야합니다. 되지 않은 유전자는 이전 연구에서 인간 상태로 연결되어있다하더라도, 관심있는 질병과 관련된 표현형 즉시 분명 존재하는 모든 유전자 변형 마우스. 따라서보...

연령 관련 질환은 현대 사회에서 점점 더 널리되고있다. 의료 과학이 향상되고 평균 수명이 증가함에 따라, 인구는 계속 나이를 이러한 질병의 부담이 커집니다. 효과적인 치료법은 쇠약 조건의 영향을 줄이기 위해 필요하지만, 많은 경우에 어려운 남아있다. 만 원인 및 노화와 관련된 질병의 병리를 이해함으로써 과학자들은 개입 전략을 잠재적 인 치료 목표를 식별하고 개발을 시작할 수 있습니다. 일반적인 노화와 관련된 상태는 파킨슨 병 (PD), 연령 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 신경 퇴행성 장애를 포함한다. PD는 인간의 신경 퇴행에 의한 가장 일반적인 운동 장애이다. 대부분의 PD 환자는 50 세 이후 진전, 운동 완만 및 강성을 휴식 등의 증상을 보여줍니다. 조기 개시는 경우 약 10 %에서 관찰되었다. AMD는 실명의 주요 원인입니다노인 점진적 감광체 손상 및 눈의 망막 색소 상피 (RPE). 중심 시력이 손상되지만 주변 시력은 일반적으로 영향을받지 않습니다. AMD의 두 가지 형태가있다. &quot;가공&quot;형태에서, RPE와 브루흐의 막 (BM) 사이 드루 젠의 형태로 알려진 세포 외 단백질 예금, 지리적 위축으로 이어지는 중앙 비전의 흐림. 더 심각한 &quot;습식&quot;형태의 망막 색소 상피와 광 수용체 층에 BM에서 맥락막 신생 혈관에서의 결과와는 망막 조직에 영구적 인 손상을 유발하는 망막 아래에 hamorrhaging으로 이어질 수 있습니다. 1 번 염색체 및 10q26 궤적, 연령 관련 황반 병증 감수성이 (ARMS2)과에 보체 인자 H (CFH) : 게놈 넓은 협회 연구는 이전에이 질환이 증가 감수성과 관련된 관심의 두 영역을 식별 궤적을 확인했다 고온 조건 팩터 A1 (HtrA1) 유전자 1-5 위치한 </sup&gt;. 이러한 대립 유전자의 조합 투여 량 의존적으로 AMD의 가능성을 증가시키고 특정 SNP를 우선적 AMD 3-6의 습식 또는 건식 형태 중 하나와 연관 될 수있다. CFH는 C3의 활성화를 억제함으로써 보체 시스템의 대체 경로 (AP)의 음성 조절제로서 작용한다. 단일 염기 다형성 (SNP)이 때문에 C 대체 1에 T에 히스티딘과 엑손 9 티로신 (402)의 교환을 일으키는 원인이 AMD의 위험 증가에 연결되어 있습니다. AMD에이 AP 때문에 CFH의 기능의 손실이 있지만, SNP는 인과 적 역할은 분명하지 않다 재생되는지 misregulated 것으로 여겨진다. 한 가설은 양전하 히스티딘 단백질 헤파린 설페이트 1,7- 단백질 반응성 C 상호 작용에 결합 CFH의 능력을 무효로하는 것으로 생각된다는 것이다.에서 CFH Y402H 시험 관내 연구 변종 간의 기능 차이 위에 충돌하는 결과를 제공하고,의 작업을 생체 내에 &lt;EM&gt; CFH - / - 인간화 CFH 8 진행되고 발현하는 마우스. 유전자가 쥐에 존재하지만 ARMS2는 영장류 게놈 HtrA1의 상류에 위치한다. HtrA1는 세린 프로테아제하지만 ARMS2 저조한 특징입니다. AMD의 관련 현장에서의 SNP 사이의 연관 불균형이 어려운이 지역에서 유전자의 개별 돌연변이의 위험에 기여를 결정했다,하지만 최근의 작업은 혈관 신생에 이르게 오히려 ARMS2보다 HtrA1의 과발현이 있음을 제안하고 망막 단백질 예금 9-11. 그러나,이 로커스에서 유전자의 근접 임의로 삽입 된 유전자를 이용하여 연구 할 수없는 상호 작용을 허용 할 수있다. AMD에 더하여, 세린 프로테아제의 HtrA 가족 많은 인간 질환과 관련되어있다. 모든 HtrA 단백질은 적어도 하나의 C 말단 PDZ 도메인 뒤에 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. HtrA1, HtrA3 및 HtrA4은 GR을 공유신호 펩타이드, 인슐린 유사 성장 인자 결합 도메인, Kazal 프로테아제 억제제 도메인의 세린 프로테아제 도메인과 PDZ 도메인 이루어진 eatest 동성. HtrA2은 미토콘드리아 파악 시퀀스 경막 도메인 이루어지는 다른 N 말단을 가지며 아폽토시스 결합 도메인의 프로테아제 억제제 및 PDZ 도메인 12-16 하였다. 포유류 HtrA1은 프로테아제 도메인 17-20의 활성 부위에있는 기판 유도 개조에 의해 조절되고, HtrA2은 프로테아제 활성을 억제 (21) 세린 프로테아제 및 PDZ 도메인 간의 상호 작용에 의해 조절 될 수있다. 흥미롭게도, PDZ 도메인은 HtrA3 (16)에 유사한 규정을 부여 나타나지 않습니다. 이는 최근 HtrA1 사이 규제 작용이 존재 함을 증명 하였다 (22)와 protoporphyrins HtrA2이 P38의 MAP 키나제의 활성화시 인산화에 의해 조절 될 수있다 다음 HtrA 프로테아제는 외적 요인에 의해 조절 될 수있다PINK1 의존적으로 23 통로입니다. 마우스의 HtrA 가족의 개별​​ 구성원의 삭제는 그러나 기계적인 효과는 대부분 부분적으로 볼 수 표현형의 부족으로 불분명, 문서화되고있다. HtrA1 단백질 품질 제어에 중요한 기능을 담당하고 그 misregulation 또는 돌연변이 성 관절염, 암, AMD 3,4,24-32 위험의 증가 등 다양한 인간 질환과 관련되어있다. 가속 비 신경 조직 결과에서의 손실이 33-37 노화 동안 신경 조직에 HtrA2 기능의 상실은 인간과 생쥐의 PD의 표현형과 관련되어있다. HtrA3의 조절 곤란이 자간전증과 암 (38, 39)의 특정 유형을 포함하여 질병과 관련이있다. 최대 규제 HtrA4의는 명백한 표현형 40, 41를 표시하지 않습니다 자간전증 환자하지만 녹아웃 생쥐의 태반에서 관찰되었다. 일부 녹아웃 마우스에서 관찰 된 표현형의 부족은있다HtrA의 가족 구성원 사이의 보상의 결과로 가정 :이 HtrA4과 HtrA1 모두 HtrA4 (41)의 삭제에 HtrA1에 의해 보상을 허용, 단백질의 TGF-B 가족과 함께 상호 작용하는 것으로 생각된다. 유사하게, HtrA1 및 HtrA3 도메인 동성 높은 수준을 가지므로 그들은 상보 기능 (42)을 가질 수 있다고 생각된다. 그러나 HtrA 단백질 공통 타겟 (43)을 조절하는 경쟁 부분적 길항제 역할을 가질 수 있음을 제안하고있다. 또한 이러한 위험을 조사하기 위해 세 가지 인간화 녹아웃 마우스 라인 생성 된 요인. CFH의 TM1에서는 (CFH * 9) jhoh 및 CFH의 TM2 (CFH * 9) jhoh 상기 CFH 유전자의 엑손 9. 인간 동족체의 엑손 9 치환 CFH의 TM1된다 (CFH는 * 9) jhoh은 비 질병 관련 티로신 인코딩 Y402H, 위험 관련 SNP를 전달 jhoh CFH의 TM2 (CFH * 9) 반면 위치 (402)에서 잔류 물. 에서인간 ARMS2 순서 tm1jhoh ARMS2는 HtrA1의 상류 지역을 대상으로 하였다. 유전자 서열 그러나 포함 UBIC 프로모터 하류의 상류 놓인에 loxP-측면 STOP 시퀀스는 이전 34 바와 같이, Rosa26 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 발현 OzCre 마우스로 건너 절제 하였다. 뿐만 아니라이 노크에 선, CFH 및 HtrA1 (CFH tm1jhoh 및 HtrA1의 tm1jhoh)뿐만 아니라 다른 알려진 HtrA 가족 구성원에 대한 조건부 녹아웃 대립 유전자가 생성 : HtrA2 (HtrA2의 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3의 tm1jhoh) 및 HtrA4 ( HtrA4의 tm1jhoh). 엑손 3, HtrA1; 세균 줄 녹아웃은 삭제 활성 도메인 (CFH의 프레임 이동 및 / 또는 삭제를 발생하도록에 loxP 사이트와 특정 엑손의 측면하도록 설계 동물 OzCre 마우스를 교차하여 만든 엑손 2엑손 2-4, HtrA3; HtrA2, -3 엑손 3, HtrA4; 4-6) 34,41를 엑손. HtrA2의 신경 삭제, 네 스틴 프로모터의 제어하에 Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여 삭제 (HtrA2 flox, Tg는 (네스-CRE) 1Kln / J)는도 34을 설명 하였다. HtrA2가없는 전용 마우스, 중 전신 또는 신경 조직에서는 파킨슨 표현형으로 제시, 분명 표현형을 표시. 관심의 유전자 중 일부는 미토콘드리아 11,44-47 언어로 번역 될 상정하고, HtrA2의 삭제는 파킨슨 표현형, 미토콘드리아 및 신경 학적 초점을 맞춘 표현형 요법 여기에 설명되어 관심의 시험에서 대표적인 결과가 제공되어 생성되기 때문에 . 두 개의 주요 관련된 일련의 테스트 이루어진 체계적 초기 표현형 계획이 수립되었다 완전히 인간, 연령 관련 질환을 연구하고 생산 된 유전자 변형 마우스를 조사하기 위해서관심의 질환 : AMD와 파킨슨.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>cotton balls</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>heat mat</td><td>Sunbeam</td><td>0000756-500-000</td><td></td></tr><tr><td>Holding tray (ice cube tray)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electronic stopwatch</td><td>GOGO</td><td>PC396</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglass box</td><td>constructed in workshop</td><td></td><td>12&quot; by 12&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vixia HF R400 Camcorder</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 oz Clear Cups</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 inch wire mesh</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (in store)</td><td>12&quot; by 12&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bubble wrap</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Straight specimen forceps</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Fine-tip dissecting forceps</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline pH 7.4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>superfrost slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Stain Solution</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Stain Solution</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount aqueous mounting medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>AxioImager A1 microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Video camera tripod</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Sectioning&amp;nbsp; Machine</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Discontinued but since replaced by CM1950</td></tr></tbody></table>

a phenotyping regimen for genetically modified mice used to study genes implicated in human diseases of aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

이 섹션에서는 이러한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 설명합니다. 뒷 사지 시험에서, 풀 시도 횟수가 이루어지고 지연은 매일 두 개의 연속적인 시험을 통해 합산되어 낙하. .이 시험은 감소 신경근 강도 HtrA2의 tm1jhoh 쥐 구별 전적으로 다른 그룹과 비교하는데 사용될 수있다 (HTRA2 KO)도 1a에 마우스 - B는 P4-6에서 감소 하?...

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A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

8.2K 조회수.  Yale University School of Medicine. A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

비디오: A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Assessment of Sensorimotor Function in Mouse Models of Parkinson's Disease

Sensitive and reliable behavioral outcome measures are essential to the evaluation of potential therapeutic treatments in preclinical trials for many neurodegenerative diseases. In Parkinson's disease, sensorimotor tests sensitive to varying degrees of nigrostriatal dysfunction are fundamental for testing the efficacy of potential therapeutics. Reliable and quite elegant sensorimotor measures exist for rats, however many of these tests measure sensorimotor asymmetry within the rat and are not entirely suitable for the newer genetic mouse models of PD. We have put together a battery of sensorimotor tests inspired by the sensitive tests in rats and adapted for mice. The test battery highlighted in this study is chosen for a) its sensitivity in a wide variety of mouse models of PD, b) its ease in implementing into a study, and c) its low expense. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of PD as well as in testing potential disease-modifying therapies.

In Parkinson's disease and movement disorders in general, sensitive and reliable behavioral assays are essential for testing novel potential therapeutics. Here, we describe a manageable battery of sensorimotor tests for mice that are sensitive to varying degrees of injury to the nigrostriatal system and useful for preclinical studies.

파킨슨 병의 마우스 모델에서 감각 기능의 평가

Sensitive and  reliable behavioral outcome measures are essential to the evaluation of  potential therapeutic treatments in preclinical trials for many  ...

연구

행동분석학

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Genetically engineered mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in large organs such as the colon in which only a single tumor is desired.
As a result, an immunocompetent, genetically engineered mouse model of colorectal cancer was developed which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor development is initiated by surgical, segmental infection of the distal colon with adeno-cre virus in compound conditionally mutant mice. The tumors can be easily detected and monitored via colonoscopy. We here describe the surgical technique of segmental adeno-cre infection of the colon, the surveillance of the tumor via high-resolution colonoscopy and present the resulting colorectal tumors.

A protocol for the establishment of a genetically engineered mouse model of colorectal cancer by segmental adeno-cre infection and its surveillance via high-resolution colonoscopy is presented.

산발성 대장 암의 유 전적으로 조작 된 마우스 모델

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

암 연구학

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

발생학

Morris Water Maze Test: Optimization for Mouse Strain and Testing Environment

The Morris water maze (MWM) is a commonly used task to assess hippocampal-dependent spatial learning and memory in transgenic mouse models of disease, including neurocognitive disorders such as Alzheimer&#8217;s disease. However, the background strain of the mouse model used can have a substantial effect on the observed behavioral phenotype, with some strains exhibiting superior learning ability relative to others. To ensure differences between transgene negative and transgene positive mice can be detected, identification of a training procedure sensitive to the background strain is essential. Failure to tailor the MWM protocol to the background strain of the mouse model may lead to under- or over- training, thereby masking group differences in probe trials. Here, a MWM protocol tailored for use with the F1 FVB/N x 129S6 background is described. This is a frequently used background strain to study the age-dependent effects of mutant P301L tau (rTg(TauP301L)4510 mice) on the memory deficits associated with Alzheimer&#8217;s disease. Also described is a strategy to re-optimize, as dictated by the particular testing environment utilized.

This manuscript describes a Morris water maze (MWM) protocol tailored for use with a commonly used mouse model of Alzheimer's disease. The MWM is widely used in transgenic mouse models. Implementation of a procedure sensitive to the background strain of the mouse model is essential for detecting group differences.

모리스 물 미로 테스트 : 마우스 스트레인 및 테스트 환경을위한 최적화

 The Morris water maze (MWM) is a commonly used task to assess hippocampal-dependent spatial learning and memory in transgenic mouse models of disease, ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

유전학

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive decline, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), have become a promising tool to elucidate the underlying mechanisms and promote the therapeutic advances. An important step is the validation and characterization of expected behavioral abnormality in the models, in the case of AD, cognitive decline. The long-term behavioral investigations of laboratory animals to study the effect of aging demand substantial efforts from researchers. The IntelliCage system is a high-throughput and cost-effective test battery for mice that eliminates the need for daily human handling. Here, we describe how the system is utilized in the long-term phenotyping of a genetic Alzheimer&#39;s disease model, specifically focusing on the cognitive functions. The experiment employs repeated battery of tests that assess spatial learning and executive functions. This cost-effective age-dependent phenotyping allows us to identify the transient and/or permanent effects of genes on various cognitive aspects.

This paper describes a protocol for cognitive assessments for genetic models of the Alzheimer&#39;s disease using the IntelliCage system, which is a high throughput automated behavioral monitoring system with operant conditioning.

자동화, Alzheimer의 질병, IntelliCage를 사용 하 여 여러 유전자 모델에서 인지 기능에 대 한 장기적인 행동 분석 결과

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. Specifically, gait analysis allows recapturing disease relevant phenotypes that are observed in human patients, especially in neurodegenerative diseases that affect motor abilities such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and others. In early studies along this line, the measurement of gait parameters was laborious and depended on factors that were hard to control (e.g., running speed, continuous running). The development of ventral plane imaging (VPI) systems made it feasible to perform gait analysis at a large scale, making this method a useful tool for the assessment of motor behavior in rodents. Here, we present an in-depth protocol of how to use kinematic gait analysis to examine the age-dependent progression of motor deficits in mouse models of neurodegeneration; mouse lines with decreased levels of endophilin, in which neurodegenerative damage progressively increases with age, are used as an example.

In this study, we demonstrate the use of kinematic gait analysis based on ventral plane imaging to monitor the subtle changes in motor coordination as well as the progression of neurodegeneration with advancing age in mouse models (e.g., endophilin mutant mouse lines).

연령에 따라 모터 손상 Neurodegeneration와 쥐의 걸음 걸이 분석

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

신경과학

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...