The authors would like to acknowledge Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, Dr. Endre Barta, Dr. Balint L Balint and members of the Nagy laboratory for discussions and comments on the manuscript. L.N is supported by grants from the Hungarian Scientific Research Fund (OTKA K100196 and K111941) and co-financed by the European Social Fund and the European Regional Development Fund and Hungarian Brain Research Program - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

칩 서열 분석에 기초하여 선택 1. 향상제 <ol><li> http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/에서 RXR 칩-SEQ 원시 데이터 fastq 파일 (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz를) 다운로드 </li><li> 다운로드 우리의 경우 (정렬에 필요한 BWA 인덱스 파일의 압축을 풉니 다 : Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz 참고 : 생물 정보학 분석의 단계에 대한 자세한 내용은 https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts에 방문하여 아래 사용되는 스크립트를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> (: perform_alignment.sh 스크립트를 사용) mm10 게놈에 예를 들어 fastq 파일을 맞 춥니 다. 이것은 .bam 파일과 정렬의 통계 폴더를 생성합니다. 정렬 RXR 칩 서열 데이터 (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) 및 해당 인덱스 파일 (.bai) 여기에 있습니다 : http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 참고 : BWA는 RELA를 정렬하는 소프트웨어 패키지입니다이러한 마우스 참조 게놈 같은 서열 데이터베이스에 상대적으로 짧은 서열 (예를 들어, 칩 SEQ 결과) (예 mm10) 13. </li><li> 피크 통화 및 드 노보 모티브 분석을위한 스크립트 (callpeaks.sh)를 실행합니다. 입력으로 .bam 파일을 사용합니다. 스크립트는 호머 findPeaks (14)에 기초한다. 주 : 출력 파일은 우리에게 등 총 피크 수, 농축 모티브의, 배경의 비율, 그리고 주제와 표적 서열에 대한 정보를 제공합니다. (그림 1). 일반적으로 여러 주제는 중요도의 순서에 따라 열거되어있다. </li><li> # 1 순위 모티브 (NR 절반`AGGTCA`)를 매핑 (: remap_motif.sh 스크립트를 사용) 참고 : 결과, 스크립트는 칩 - 피크가 관심의 전사 인자의 정규 결합 부위를 포함하는 게놈 영역을 커버하는 표시됩니다 .bed 파일을 생성합니다. </li><li> (mm_ES_RX을 다운로드하여 읽어 정렬 RXR 칩-서열의 결과를 시각화R_24h_ATRA.bam (또한 .bai 다운로드)) 및 통합적인 유전체학 뷰어 (IGV) (15)에 의해 AGGTCA 모티브 발생 (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed는) / 추정 RAR를 식별 RXR 결합 부위 (그림 2와 그림 3)입니다. 참고 : 다양한 칩 - 서열 데이터의 통합 정확하게 좋은 후보 강화제 (16, 17)을 예측 이상으로 도움이 될 것입니다. 최근의 연구는 활성 증강은 일반적으로 P300을위한 농축 및 H3K4me1 및 H3K27ac와 상관 관계, 또한 18 ~ 21을 권장함으로써 DNase의-I 과민를 표시하는 오픈 염색질 지역에 위치하는 것으로 나타났습니다. </li><li> 선택한 게놈 영역의 400 bp의 순서 및 후속 프라이머 설계를위한 이러한 시퀀스를 사용 - (가) (200)를 얻기 위해 IGV (15)에 &quot;관심 영역을 정의&quot;를 사용합니다. </li></ol> 2. 리포터 분석 주 : 루시페린 / 루시 페라 제를 사용하는 시스템전사 조절에 대해 매우 민감 기자 분석 등. 인핸서 활성을 루시퍼 라제 효소에 따라 검출 될 수있는 bioluminescense 결과 oxyluciferin하는 루시페린의 산화를 촉매하는 것이다 생성된다. 첫 번째 단계로서, 식별 된 추정 인핸서 서열은 리포터 벡터 (예 : 루시 페라 TK-22 또는 pGL3 NanoLuc)에 서브 클로닝한다. <ol><li> 프라이머 디자인 <ol><li> 23 : (http://bioinfo.ut.ee/primer3/ 사용할 수 있습니다 여기에) Primer3으로 추정 인핸서 지역의 400 bp의 - (200)의 증폭을위한 디자인 PCR 프라이머 </li><li> Primer3로 추정 결합 부위를 포함 IGV의 게놈 시퀀스를 복사 - 붙여 넣기 (단계 1.7 참조​​). 세트 제품의 크기 범위 250 - Primer3 300 bp의. </li><li> UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 PCR 프라이머의 유효성을 검사하는 것은 실리 PCR 도구에서 (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24입니다 주 : 이후 단계에서이 프로토콜은 HindII를 사용I와의 BamHI 제한 복제에 대한 효소. 확인 여부 AAGCTT 또는 GGATCC 제한 부위를 포함 할 UCSC에서 실리 PCR 도구에 의해 예측으로 PCR 증폭 순서 (예를 들어, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> 상용 공급 업체에서 필요한 프라이머를 얻습니다. </li></ol></li><li> 게놈 DNA에서 증강 시퀀스의 PCR 증폭 <ol><li> 일차 전지 (예를 들어, 기본 배아 섬유 아세포)에서 템플릿 게놈 DNA를 정화. gDNA를 격리를위한 상업 키트를 사용하여 제조업체의 지침을 따르십시오. 참고 : gDNA를 높은 품질이 성공적으로 PCR 증폭을 위해 필수적이다. PCR은 gDNA를 행 쉽지 않은 경우, 적절한 BAC 클론을 사용할 수있다. </li><li> gDNA를 NG (100), 5 ㎕의 10 배 버퍼, 3 μl의 황산 (25 mM)을 5 μL의의 dNTP (2 mM의 각), 1.5 ㎕를 빨리 감기 프라이머 (10 μM), 1.5 μL의 계 프라이머를 포함하는 50 μl의 PCR 반응을 준비합니다 (10 μM) 1 μL의 DNA 폴리머 라제 <li> PCR을주기 설정 (2 분 95 ° C (20 초 95 ° C, 10 초를 58-65 ° C, 18 초 70 ° C) X25 반복, 2 분 70 ° C, 영원히 4 ° C). 프라이머의의를 고려하여 설정 어닐링 온도를 Tm 값을 예측했다. </li><li> 상업 PCR 정제 키트와 PCR 제품을 정화하고 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> 위에 사용 된 프라이머로 PCR을 반복하지만, 그 (5)에 돌출을 추가로 클로닝하기위한 제한 부위를 도입 &#39;말단 (예를 들면, 빨리 감기 : 5&#39;-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3&#39;(HindIII에) 계 : 5&#39;-TATA GGATCC의 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3 &#39;(을 BamHI)). </li><li> 불특정 PCR 제품을 확인하는 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 5 μl를 실행합니다. 주 : 더 밴드가 감지되면, 전체 PCR 제품을 실행하고 상업 겔 추출 키트하여 적절한 대역을 정화. </li></oL&gt; </li><li> 제한 참고 : HindIII로와의 BamHI으로 절단한다 TK 프로모터 (22) 정제 된 PCR 제품과 벡터 (예를 들어, TK-루크)의 상류에 삽입 복제합니다. <ol><li> 1 μg의 정제 된 PCR 생성물의 HindIII로 1 μL (20 U / μL), 1 μL를 BamHI (20 U / μL), 5 ㎕의 10 배의 완충액을 포함하는 50 ㎕의 반응 혼합물을 준비한다. </li><li> 250 ㎕의 반응 혼합물을 함유 5μg 벡터 (TK 배낭 또는 다른 리포터 벡터), 5 μL를 HindⅢ (20 U / μL), 5 μL를 BamHI (20 U / μL), 5 ㎕의 감온 알칼리성 포스파타제 (1 U / μL)를 준비 25 μl의 10 배 버퍼입니다. 주 : 벡터의 AP 처리는 크게 단일 소화 벡터의자가 결찰함으로써 배경을 감소시킨다. </li><li> 다음 절단 PCR 제품 및 시판 PCR 정제 키트로 정제 벡터를 37 ℃에서 4 시간 동안 반응 혼합물을 인큐베이션. </li></ol></li><li> Ligatio엔 <ol><li> 2 ㎕의 10 배 T4 DNA 리가 아제 버퍼, 10 ng의 TK-루크 벡터, 50 ng의 삽입 (소화 PCR 제품), 1 μL T4의 DNA 리가 아제 (400 U / μL) 및 뉴 클레아없는 물을 포함하는 PCR 튜브에 결찰의 반응을 설정 20 μL까지. 참고 : 반응이 삽입을 포함하지 않는 음성 대조군을 준비합니다. </li><li> 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하여 반응을 상하 소형 원심 분리기를 이용하여 간단히 PCR 튜브를 스핀 다운 한 후 10 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 열은 얼음에 진정 50 μl의 유능한 세포 (예, DH5α)에 변환을위한 제품의 5 μl를 사용하여 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화. </li><li> 상용 키트와 함께, 박테리아를 변환 식​​민지를 선택하고 플라스미드 DNA를 분리 표준 열 충격 절차를 사용하십시오. 다음 단계 이전에 시퀀싱에 의해 모든 구조를 확인합니다. </li></ol></li><li> ES 세포의 형질 <ol><li> 48 웰 플레이트를 사용합니다. 200 ㎕를 0.1 % 젤라틴 오디오 솔루션을 추가셀 도금하기 전에 이온 / 웰 30 분. </li><li> 플레이트 배아 줄기 (ES) 세포를 형질 전환 전에 하루. / 잘 250 μL의 ES 미디어에 잘 당 3 × 104 세포의 밀도로 공급이없는 ES 세포와 플레이트를 사용합니다. </li><li> . 플라스미드 믹스를 준비 믹스 (각 믹스 치료 4, 4 레티노 산 처리 된 8 우물, 계산됩니다) 1 : 1,250 ng의 TK-루크 빈 (음성 대조군), 950 ng를 β 갈 락토시다 코딩 벡터 (βGal), 믹스 2 : 1250 NG TK-루크 Hoxa1 인핸서 (양성 대조군), βGal, 믹스 3 NG 950 : 1250 NG TK-루크 PRMT8 인핸서 (관심 지역), βGal NG (950). 주 : ES 세포는 목적하는 전사 인자를 발현 (RAR / RXR). 루시 페라 제 및 β - 갈 락토시다 측정시 이후 기본 값을 결정하는 형질 감염되지 않은 우물을 둡니다. </li><li> 106 μL에 (8 우물에 충분한) 총 부피를 혼합 각각의 플라스미드로 형질 품질 저하 혈청 미디어를 추가합니다. </li><li> 4.5 μL ES 품질 트랜 추가이온 시약은 위아래로 15 회 피펫 팅에 의해 조심스럽게 섞는다. RT에서 10 분 동안 형질 감염 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 잘 당 세포에 형질 믹스의 13 μl를 추가 피펫으로 잘 섞는다. 다시 인큐베이터 리간드 치료 전 (37 ° C) O / N로 세포를 놓습니다. </li><li> 세포 흡인에 의해 조심스럽게 용지를 제거하고 250 μl를 추가 신선한 미디어 / 웰 0.01 포함 - 차량으로 최종 농도 또는 DMSO로 1 μM 모든 트랜스 레티노 산 (RA)를. 48 시간 - 24에 대한 세포를 품어. 참고 : 레티노 산 민감한 빛입니다. </li></ol></li><li> 세포 용 해물의 제조 <ol><li> 5 배 용해 버퍼 (1.25 ㎖의 0.5 M 트리스, pH는 7.8, 희석 1 ml의 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT) (H 2 O), 10 ml의 0.1 M EDTA의 pH는 8.0, 50 ㎖ 글리세롤, 5 ml의 트리톤 X-100, 살균에 100 ㎖에 물 최대), 멸균 물을 사용 1x에서 20 ㎕의 1 M DTT / 10 ml에 추가하고 사용 전에 실온으로 평형을합니다. 분석의 날에 48 웰 플레이트 10 ml의를 준비합니다. </li&gt; <li> 세포 흡인에 의해 조심스럽게 용지를 제거합니다. 1X PBS로 한 번 세포를 씻어. 세포에 200 ㎕의 1 배 용해 버퍼 / 아니라 직접 추가합니다. </li><li> RT (화학 용해)에서 2 시간 동안 흔들어. -80 ° C (기계 용해)에서 접시에 세포 용 해물을 고정. 해물 며칠 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 해물을 해동. 해동 완료 후, 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 세포 용 해물을 전송. 전송 β 갈 락토시다 제 분석 용 96- 웰 클리어 플레이트에 세포 용 해물 80 ㎕의 루시퍼 라제 및 측정을위한 백색 플레이트에 세포 용 해물 40 μL. 모든 거품을 형성하지 마십시오. </li></ol></li><li> β - 갈 락토시다 분석 참고 : 베타 갈 락토시다 아제 또는 다른 초 기자가 아닌 특정 실험 변동을 고려하기 위해 내부 통제로 사용되어야한다. <ol><li> β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 준비 : 80.0 g 나 2 HPO 4 • 7H 2 O,H 2 O • 3.8 g의의 NaH 2 PO 4, 30.0 g의 KCl, • 7H 2 O 4, 멸균 물 1,000 ml의 구성 1.0 g의 황산. 7.4으로 산도를 조정합니다. 4 ° C에서 살균 (0.2 마이크론) 및 저장 필터 </li><li> 4 mg을 ONPG와 함께 1 ml의 β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 혼합 (O 니트로 페닐-β-D-갈 락토시다). 그냥 사용하기 전에 버퍼 1 ㎖ 당 2- 머 캅토 에탄올 (βME)의 3.5 μl를 추가합니다. 80 ㎕의 세포 용 해물에 100 ㎕의 β - 갈 락토시다 기판 버퍼를 추가합니다. </li><li> 희미한 노란색이 개발 될 때까지 37 ℃에서 반응을 품어. 플레이트 리더와 수출 데이터를 OD 420 nm에서 흡광도를 참조하십시오. 주 : 시간이 일반적으로 더 이상 30 분 이상은 형질 전환 효율에 따라 달라집니다. </li></ol></li><li> 루시 페라 제 분석 <ol><li> 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 추가, 15.1 mg을 D-루시페린 소금, 82.7 mg의 ATP 소금, 185 mg의 황산 • 7H 2 O : 50 ml의 루시페린 기판 시약을 준비다음, 1.5 ml의 1 M HEPES 버퍼, 48.5 ml의 ATP없는 물, 소용돌이를 추가 모든 화합물이 완전히 용해해야합니다. -80 ° C에서 10 ml의 분취 량 - (5)를 유지합니다. </li><li> 시작하기 전에 RT 따뜻한 5 ㎖ 루시페린 기질 시약. 피펫 100 μL 기판 파쇄의 40 μl를 함유하는 백색 플레이트의 각 웰에 시약 즉시 발광 카운터 장치를 이용하여 신호를 측정한다. </li><li> 세중의 형질 적어도 3 개의 독립적 인 실험 활동을 얻습니다. </li><li> 각 측정 값으로부터 비 - 형질 감염된 세포에 대해 측정 된 평균 값을 감산하여 제 각 웰의 기본 정규화 루시퍼 라제 활성 및베이스 정규화 β 갈 락토시다 값을 계산한다. 그 후 루시퍼 라제 / β 갈 락토시다 제 활성의 비를 계산한다. </li></ol></li></ol> 증강 RNA의 3 특성 참고 : 증강 활동의 직접적인 지표는 최근 게놈 w 등장했다증강로부터 전사되는 NT 50 2000에서 크기에 이르기까지 많은 짧은 비 코딩 RNA를 식별하고, (eRNAs)을 증강 RNA를 지칭하는 IDE 연구 16,25,26 (그림 4). eRNA 유도 매우 인접 엑손 - 코딩 유전자의 유도와 연관. 따라서, 신호 의존 인핸서 활성은 RT-qPCR에 의해 여러 가지 조건 사이 eRNA 생산과 비교하여 생체 내에서 정량화 할 수있다. <ol><li> RT-qPCR에 의한 eRNA 검출 용 프라이머 설계를위한 가이드 라인 <ol><li> 2킬로바이트 거리에 주석 전사 시작 사이트에서 - 적어도 1.5있는 그 eRNA 측정을위한 게놈 영역을 선택합니다. 참고 : 중요한 유전자 내 인핸서에서 mRNA의 전사의 높은 수준을 감지 방향으로 eRNA의 정확한 정량을 방지, 유전자 내 인핸서에서 안티센스 eRNAs는 감지하고 extragenic 증강에 eRNAs에 수준에서 유사하다. </li><li> 일반적으로, 지역 (200) 사용 - 1,000 BP 이리저리센스 또는 안티센스 가닥 (그림 4, 그림 6)에 하나 프라이머 디자인에 대한 관심의 결합 부위 전사 인자의 중심을 해요. 참고 : GRO-SEQ, DNase의-SEQ, H3K4me1, H3K4me3 또는 H3K27ac 칩 - 서열 데이터가 더 정확한 프라이머 디자인에 사용할 수 있습니다 원하는 세포 유형 및 조건에서 사용할 수있는 경우. eRNAs는 H3K4me1 및 여기서 Me3 높은 수준의 특징으로 추정 인핸서 지역에서 전사한다. eRNAs의 발현은 긍정적으로 활성화 인핸서 히스톤 마크 H3K27ac의 농축와 상관 관계. </li><li> Primer3에 의해 eRNAs의 형광 염료 기반의 RT-qPCR에 측정을위한 디자인 PCR 프라이머 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) (23)에 따라 프라이머 디자인에 대한 안티센스 서열 (센스 가닥의 보완 역)을 생성합니다 : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. 프라이머 디자인에 대한 감각 또는 안티센스 시퀀스의 300 bp의 - (200)를 삽입합니다. </li></ol></li><li> eRNA의 전사의 측정 </strong&gt; <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 상업 산성 페놀 / 클로로포름 기반 추출 시약으로 처리 한 세포에서 총 RNA를 분리합니다. </li><li> 이전 역전사 반응에 그들을 사용에 고립 된 RNA를 치료하기 위해 DNaseI를 사용합니다. 전사를 반대하기 전에 제조업체의 권장 사항에 따라 DNase의를 비활성화. </li><li> DNase의 I 처리 후 RNA 농도를 측정하고 RT 반응 1,000 NG를 사용합니다. 높은 품질의 역 효소를 사용합니다. 주 : eRNAs 다수가 폴리아 데 닐화되지 않을 때, 역전사 랜덤 프라이머의 사용을 필요로한다. </li><li> 검색 역방향 표준 절차를 사용하여 RT-qPCR에 의해 eRNA을 전사. 정규화를위한 무 처리 의존 mRNA의 측정 (예를 들어, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB). </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome.">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 311-318 (2007).</li><li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans.">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470, 279-283 (2010).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li><li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor.">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li><li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3--new+capabilities+and+interfaces.">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).</li><li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+UCSC+Genome+Browser+database:+update+2010.">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers.">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA.">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li><li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology.">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li><li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential.">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In recent years, advances in sequencing technology have allowed large-scale predictions of enhancers in many cell types and tissues 7-9. The workflow described above allows one to perform primary characterization of candidate enhancers chosen based on ChIP-seq data. The detailed steps and notes will help anyone to set up a routine enhancer validation in the lab.
The most critical step in the luciferase reporter assay is the transfection efficiency. It is recommended to include a GFP...

Development of a multicellular organism requires precisely regulated expression of thousands of genes across developing tissues. Regulation of gene expression is accomplished in large part by enhancers. Enhancers are short non-coding DNA elements that can be bound with transcription factors (TFs) and act from a distance to activate transcription of a target gene1. Enhancers are generally cis-acting and most frequently found just upstream of the transcription start site (TSS), but recent studies also described examples where enhancers were found much further upstream, on the 3' of the gene or even within the introns and exons2. 
There are hundreds of thousands of potential enhancers in the vertebrate genomes1. Recent methods based on chromatin immunoprecipitation (ChIP) provide high-throughput data of the whole genome that can be used for enhancer analysis3-9. Though data obtained by ChIP-seq experiments greatly increases the likelihood to identify cell and tissue-specific enhancers, it is important to keep in mind that detected binding sites do not necessarily identify direct DNA binding and/or functional enhancers. Thus, further functional analysis of newly identified enhancers is indispensable. In this work, we present a basic three-step process of putative active enhancer identification and validation. This includes: 1) selection of putative transcription factor binding sites by bioinformatics analysis of ChIP-seq data, 2) cloning and validation of these regulatory sequences in reporter constructs, and 3) measurement of enhancer RNA (eRNA). 
Exposure of embryonic stem (ES) cells to retinoic acid (RA) is frequently used to promote neural differentiation of the pluripotent cells 10. RA exerts its effects by binding to RA receptors (RAR&#945;, &#946;, &#947;) and retinoid X receptors (RXR&#945;, &#946;, &#947;). RARs and RXRs in a form of heterodimer bind to DNA motifs called RA-response elements, that is typically arranged as direct repeats of AGGTCA sequence (called as half site) and regulate transcription. Ligand-treatment experiments allowed the identification of several retinoic acid regulated genes in ES cells 11,12. However, enhancer elements for many of these genes has not been described yet. To demonstrate how the here-described workflow can be used for enhancer identification and validation we show step-by-step the selection and characterization of two retinoic acid-dependent enhancers in embryonic stem cells.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA polymerase</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>for PCR amplification of enhancer from gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>for genomic DNA isolation</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>for PCR product purification</td></tr><tr><td>Gel extraction kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>for gel extraction if there are more PCR product</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>restriction enzyme</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>restriction enzyme</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>release of 5&#039;- and 3&#039;-phosphate groups from DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>for ligation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>for plasmid isolation</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES media</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acid</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>for transfection</td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligand, for activation of RAR/RXR</td></tr><tr><td>96-well clear plate</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>96-well white plate</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>D-luciferin, potassium salt</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>ATP salt</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>for Luciferase assay</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;#8226;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactosidase)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>for Beta galactosidase assay</td></tr><tr><td>TRIzol&amp;reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>reverse transcription of eRNA</td></tr><tr><td>Rnase-free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&amp;trade; Real-Time PCR Detection System</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>luminescent counter</td></tr></tbody></table>

prediction and validation of gene regulatory elements activated during retinoic acid induced embryonic stem cell differentiation

배아 개발은 많은 유전자의 활성화와 억압을 포함하는 다단계 과정이다. 게놈 인핸서 요소는 세포 분화 동안 유전자 발현의 조직 및 세포 - 유형 특이 조절에 기여하는 것으로 알려져있다. 따라서, 자신의 식별 및 추가 조사는 세포의 운명이 결정되는 방법을 이해하기 위해 중요하다. 유전자 발현 데이터 (예를 들어, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ) 및 염색질 면역 (칩) 기반 게놈 전체 연구 (칩 SEQ)의 결과의 통합은 이러한 조절 영역의 대규모 식별을 허용한다. 그러나, 세포 형 특정 증강 기능 검증은 생체 외 및 생체 내 실험 절차에 더 필요합니다. 여기에서 우리는 활성 강화제를 식별하고 실험적으로 검증 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 칩 서열 데이터 분석, 2)의 복제 및 EXPER 의해 조절 영역 1) 식별이 프로토콜을 포함하는 단계별 흐름을 제공한다imental 리포터 분석에서 확인 된 게놈 서열의 추정 규제 가능성 검증 및 인핸서 RNA 전 사체 수준을 측정하여 생체 내에서 증강 활성 3) 결정. 제시된 프로토콜은 실험실에서이 워크 플로를 설정하는 사​​람을 도울 수있을만큼 자세히 설명되어 있습니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 쉽게 적응 및 셀룰러 모델 시스템에서 사용될 수있다.

우리는 게놈 전체에있는 RA-조절 유전자가 근접 수용체 농축을 식별하기 위해 범 특정 RXR 항체를 사용했다. 레티노 산으로 처리 ES 세포에서 얻은 RXR 칩 서열 데이터의 생물 정보학 분석은 RXR 사이트를 점령 하에서 핵 수용체 절반 사이트 (AGGTCA) (그림 1)의 농축을 밝혔다. 생물 정보학 알고리즘을 사용하여 우리는 RXR 칩 - 서열 데이터에 반 사이트 (그림 2)?...

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Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K 조회수.  Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona. In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

비디오: Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell replacement therapies. Terminally differentiated cell types could be used for the treatment of various degenerative diseases. In vitro differentiation of these cells towards tissues of the lung, liver and pancreas requires as a first step the generation of definitive endodermal cells. This step is rate-limiting for further differentiation towards terminally matured cell types such as insulin-producing beta cells, hepatocytes or other endoderm-derived cell types. Cells that are committed towards the endoderm lineage highly express a multitude of transcription factors such as FOXA2, SOX17, HNF1B, members of the GATA family, and the surface receptor CXCR4. However, differentiation protocols are rarely 100% efficient. Here, we describe a method for the purification of a CXCR4+ cell population after differentiation into the DE by using magnetic microbeads. This purification additionally removes cells of unwanted lineages. The gentle purification method is quick and reliable and might be used to improve downstream applications and differentiations.

Here, we describe a method for the purification of differentiated human embryonic stem cells that are committed towards the definitive endoderm for the improvement of downstream applications and further differentiations.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

연구

발생학

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

신경과학

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

F9를 RARE-LacZ를 셀 기반 리포터 분석을 사용하여 E8.5 배아 및 Neurosphere 문화에서 상대 레티노 산 수준의 정량적 측정

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

생물학

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Employing Reporter Cells in a Co-Culture to Study Retinoic Acid Production by Mouse Embryonic Cells

Source: Ababon, M. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54443">Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for assessing retinoic acid activity in mouse embryos. Upon isolating cells from the mouse embryos, the cells are co-cultured with retinoic acid (RA) reporter cells. Embryonic cells produce RA, which induces beta-galactosidase expression in reporter cells, indicating RA activity in the embryonic cells.

마우스 배아 세포에 의한 레티노산 생산을 연구하기 위해 공동 배양에서 리포터 세포 사용

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines
1. Solution and Media Preparation

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