C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

동물의 주제를 사용하는 모든 절차는 웨스턴 미시간 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 학회의 기준에 따라왔다. 1. 동물 <ol><li> 이 연구에서 남성과 여성의 쥐에게 세 3 개월을 사용합니다. </li><li> 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어둠주기에서 동물을 유지합니다. </li></ol> 동물 마취에 대한 KAX 칵테일 2. 준비 <ol><li> 1 ml의 아세 프로 마진 (10 ㎎ / ㎖) 및 증류수 3 ㎖에 5 mL의 케타민 (100 ㎎ / ㎖)의 자일 라진 (20 ㎎ / ㎖) 50 mg을 녹인다. 철저하게 섞는다. </li><li> 주사기 필터 소독 및 10 ml의 혈청 병에이 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 3. KAX 주입 <ol><li> 동물 (g)을 달아 주입을위한 준비가 될 때까지 케이지로 돌아갑니다. </li><li> 28 G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기를 사용하여 0.1ml를 복강 KAX / 100g 동물 체중을 주입. </li><li> 허용하다동물에 대한 의식이 될 수 있습니다. 발과 꼬리를 곤란하여 반사를 확인합니다. </li><li> 수술 기간 동안 안전하게 실험실에서 모든 동물을 유지합니다. </li><li> 포스트 수술은 자신의 새장에 동물을 교체하고 의식이 회복 될 때까지 RT 편안한 유지합니다. 만 동물이 각성 할 때 동물 시설에 동물을 반환하고 정상적인 동작을 다시 시작합니다. </li></ol> 외과 및 미세 조립 4. 준비 <ol><li> 멸균 2 M NaCl 용액을 확인합니다. </li><li> 이 미세하게 테이퍼 유리 미세 바늘 (그림 1D, 그림 1E)로 한 0.86 mm 내경에게 무거운 연마 표준 및 얇은 벽으로 둘러싸인 붕 규산염 관을 끌어 미세 전극 풀러 (그림 1C)를 사용합니다. </li><li> 2 M 식염수 메우기 주사기 바늘과 1 ML의 주사기 (그림 1B)를 사용하여 이전 단계에서 하나의 미세 백필. 전극의 선단으로부터 기포를 탭. </li><li> 2 M과 제 1 ML의 주사기를 채우염화나트륨. 18 G 바늘을 연결 한 다음 폴리에틸렌 튜브 (그림 1A)의 길이 (약 10 인치)에 연결합니다. 바늘을 통하여 식염수 폴리에틸렌 튜브를 채우기 위해 주사기 플런저를 사용한다. </li><li> 미세 바늘과 튜브 모두 식염수로 가득 할 때, 조심스럽게 두 가지를 연결합니다. 그들 사이의 접속 (도 2)에 공기를 제거한다. </li><li> 미세 물론 종이 타월의 입자에 대해 매우 가볍게 긁어하여 미세 바늘의 끝을 베벨. </li><li> 부드럽게 액체 미세 스트림 종이 타월에 보일 때까지 주사기 플런저를 밀어 미세 바늘의 저항을 확인한다. 액체의 흐름은 0.5 mm보다 넓은 없어야합니다. </li></ol> 동물의 5. 준비 <ol><li> 2 방울 각막에 국소 마취제 (Proparacaine 염산염 안과 솔루션, USP, 0.5 %) - 1을 적용합니다. 더 안구 반사가 발생하지 않을 때까지 기다립니다. </li><li> 가위로 수염을 손질. </li><li> 에스실험 눈 주위 betadine 용액과 면봉 공간이있는 코튼 팁 어플리케이터를 aturate. </li><li> 현미경을 사용하여, 눈을​​ 팽창 상공 막 정맥을 노출하고 눈의 움직임을 제한하기 위해 아래 눈꺼풀을 고정하기 위해 지혈을 연결합니다. (그림 3, 화살표) </li></ol> 6. 녹내장 유발 식염수 주입 <ol><li> 미세 바늘 조립체 및 동물이 제조 될 때, 주사를 시작한다. </li><li> 동물 피트 / 꼬리 핀치에 응답하지 않는 것으로 확인되면, 조심스럽게 정맥 (그림 3, 흰색 화살표) 10과 20도 사이의 낮은 각도로 오는에 의해 미세과 상공 막 정맥을 관통. 혈액이 미세 바늘 (도 3, 검은 화살표)의 선단에 들어가면 정맥 천자 성공적인 명백하다. </li><li> 천천히 수동 ​​정맥 약 50 μL의 생리 식염수를 주입. 이 약 10 초 정도 소요됩니다. 정맥 것이다 소금이 죽 순환으로 희게 흰색우 혈관 (그림 4, 화살촉). 일부 지역은 피가 붉은 모양 (그림 4, 화살표)를 유지할 수있다. <ol><li> 전체 망막 신경절 세포 층 철저한 망막 손상을 확인하기 위해, 대향하는 제 사이트로, 정맥 내로 주입 제를 수행한다. 참고 : 소금은 혈관 시스템을 통해 순환으로 분 이내에, 하나는 눈의 홍채를 통해 구별 흐린 모습을 볼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 내부 통제로 사용하기 위해 치료 반대 눈을 둡니다. </li></ol> 7. 동물 복구 <ol><li> 지혈을 제거합니다. </li><li> 지혈에 의해 주사 부위에 고정 사이트에 트리플 항생제 연고 (바시 트라 신 아연, 네오 마이신 황산염, polymysin의 B 황산)을 적용 할면 주걱을 사용합니다. 눈 주위 조직의 손상은 지혈을 사용하여 발생하지 않습니다. </li><li> &gt; 순환 온수 담요에 자신의 새장에 넣어 마취 동물은 이전합니다천만에 저체온증. 의식과 정상적인 동작이 회복 될 때까지 관찰에서 동물을 유지합니다. 다시 동물의 식민지에 깨어있는 동물을 운반 할 것. 동물 희생의 시간이 될 때까지 식민지에 남아 있습니다. </li></ol> 8. 동물의 희생과 망막 제거 <ol><li> 녹내장을 유도하는 절차를 수행 한 달, 동물 CO 2 질식 및 보조 흉부 천자에 의해 안락사시켰다. <ol><li> 챔버에서 동물을 놓고 단단히에 뚜껑을 넣어. </li><li> 20 부피 % / 분 CO 2 변위를 허용하는 CO 2 가스 조절 밸브를 열고 챔버 내의 산소. </li><li> 동물이 만료하기위한 사에 5 분을 허용합니다. </li><li> 두 밸브의 전원을 끄십시오. </li><li> 챔버에서 동물을 제거하고 멸균 메스와 보조 흉부 천자를 수행합니다. </li></ol></li><li> 안락사 후 눈 BEI 주변 궤도 공동 내의 결합 조직을 잘라 메스를 사용NG주의 안구 자체로 절단하지. </li><li> 조심스럽게 그대로 안구를 추출하는 시​​신경과 남아있는 조직을 잘라 곡선 가장자리에 가위를 사용합니다. 신선한 PBS를 포함하는 무균 60mm X 15mm 일회용 페트리 접시에서 추출 된 안구를 놓습니다. </li><li> 안구에서 아이 컵을합니다. 이렇게하려면 메스와 작은 절개 단지 홍채와 공막 사이의 경계에 후부합니다. 안구에서 각막 반구를 제거하는 작은 봄 가위로 눈의 둘레 주변이 절개를 수행합니다. 시신경 접속 반구 남아있다. </li><li> 안락사 동물에서 아이 컵 내부의 매우 얇은 핑크 / 베이지 망막을 찾을 수 있습니다. 아이 컵을 안정화 무딘 집게와 망막의 색소 층을 잡으십시오. 아주 부드럽게 눈 뒤쪽 떨어져 전체 그대로 망막을 애타게 폐쇄 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. , 곤란 당겨, 또는 직접 망막을 잡아 당 겼하지 마십시오. </li><li> 를 잘라 작은 봄 가위를 사용하여시신경 여전히 망막에 부착되는 영역. </li><li> 망막에서 남아있는 색소 상피 또는 공막 조직을 절단해야합니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 매우 부드럽게 신선한 PBS를 포함 35mm X 10mm 페트리 접시 코팅 깨끗한 실 가드에 고립 된 망막을 전송합니다. </li></ol> 9. 전체 마운트 망막 준비 <ol><li> 일단 실 가드 접시, 장소에 망막 핀 집게 하나의 선인장 바늘을 사용합니다. 이 위를 향하도록 망막 신경절 세포 층을 유지하고 아래로 시신경. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다. </li><li> 시신경 유두에서 발산하는 네 잎 클로버의 모양을 만들고, 네 개의 사분면으로 망막을 잘라 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 가능한 witho으로 망막이 플랫하게 추가 선인장 바늘과 망막의 사분면 핀스트레칭 유타 (그림 5). </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드의 O / RT에서 N의 3 ml의 실 가드 접시에 고정 된 망막을 수정합니다. </li></ol> 망막의 10 항체 염색 참고 : 기본 및 보조 항체와 얼룩 고정 망막을 망막에 (그림 6) 뉴런을 볼. <ol><li> PBS에서 고정 평면 탑재 망막 2 분 동안 3 회를 씻어. </li><li> 60 분 동안 PBS에서 1 % 소 태아 혈청과 1 % 트리톤 X-100으로 망막 Permeabilize 하시려면. </li><li> 린스 PBS로 세 번, 2 분, 각각, 망막. </li><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> 45 분 동안 실온에서 PBS 중 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 태아 혈청과 인큐베이션. </li><li> PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> PBS에서 3 ml의 1 % 소 태아 혈청에서 각 망막 부화정제 마우스 항 - 쥐 CD90 / 마우스 CD90.1 (1 : 300 희석) O / RT에서 N. </li><li> 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100로 한번 씻어 망막. </li><li> PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어. </li><li> 보조 알렉사 플 루어 594 염소 항 - 마우스 IgG로 3 ml의 PBS (NO FBS)의 각 망막을 품어 (1 : 300) O / RT에서 N. </li><li> 자유롭게 PBS로 망막을 씻으십시오. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 조심스럽게 망막에서 선인장 바늘을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 전송 피펫과 현미경 슬라이드에 망막을 전송합니다. 천장에 직면 망막 신경절 세포 층과 방향을 유지해야합니다. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다. </li><li> 킴 와이프 ​​또는 다른 흡수제로 초​​과 PBS를 흡수한다. 망막을 흡수하지 않도록주의하십시오. </li><li> ½ 글리세롤 5 방울을 추가하고 오전과 같은 중량 PBS 1/2ounting 미디어. </li><li> 공기 방울을 방지 커버 슬립으로 망막을 커버. </li><li> 명확한 매니큐어, 접착제, 또는 다른 접착제를 사용하여 안전 커버 슬립. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

이 프로토콜은 생체 내 쥐 모델에서 녹내장과 같은 조건을 유도하는 방법을 설명한다. 이 절차는 29, 32. 흉터 조직을 개발하는 것은 전방에 압력을 증가 방수의 유출 폐색 섬유주에 흉터를 유발하는 고장 성 식염수 주사를 사용합니다. 감소 유출 및 압력 구축으로, 탄성 인대에 의해 중단 렌즈 다시 유리체 챔버로 푸시합니다. 유리체 유머는 깨지기 쉬운 망막 신경 세포의 손상을 망?...

녹내장은 구체적으로는, 망막 신경절 세포 1-2, 망막 신경 세포에 영향을 눈 질환 군이다. 이러한 세포의 축삭 비전 인식되고 뇌에 시각 정보를 전달하는 시신경 될 모이다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상 때문에 시각적 결함을 발생합니다. 녹내장 질환과 관련된 주요 특성은 RGC 변성과 죽음, 증가 된 안압 (IOP), 및 광학 디스크 부항과 위축이다. 이러한 기능은 시야 손실 또는 전체, 돌이킬 수없는 시력 상실로 이어집니다. 현재 녹내장은 전 세계적으로 7천만명 3 실명가 발생했습니다. 따라서, 그것은 실명 (4)의 세계에서 세 번째로 큰 원인이다. 녹내장의 RGC 죽음의 정확한 메커니즘은 알 수없는 남아 있습니다. 많은 연구는 신비의 잠금을 해제하기 위해 수행되었다. 녹내장의 주요 위험 인자는 증가 나는 것을 그러나 알려져때문에 눈의 전방에서 수성 유머 (AH)의 불규칙한 순환에 n 개의 안압. AH는 눈의 무혈성 전방에 혈액 투명하고 무색의 대체 역할을합니다. 또한, 주변 셀 영양 대사 과정에서 분비 노폐물을 제거하고, 신경 전달 물질을 수송 및 병적 상태 일 동안 약물과 안구 내 염증 세포의 순환을 허용한다. 방수 순환의 유지 보수는 모양체와 섬유주을 포함한다. 방수는 모양체에 의해 생성된다. 그러므로 안구 조직의 전반적인 건강을 유지하기 위해 전방으로 흐른다. (75) - 유체가 모양체 근육의 해면 조직의 세 가지 레이어를 통해 여과 될 때 방수 유출의 80 %는 적극적으로 비 안료 섬모 상피를 통해 분비된다. 섬유주를 통해 어느 EMPT Schlemm의 운하를 통해 유체 종료(20)에 남아있는 혈액 계 5 국지적으로 이거 - 유출의 25 %는 섬유주를 무시하고 수동적으로 uveo - 공막 경로를 통해 한외 여과 및 확산에 의해 분비된다. 이 경로는 안압 1의 비교적 독립적으로 나타납니다. 방수의 생산과 유출이 균형을 때, 압력은 눈에서 작성합니다. 언급 한 바와 같이, 안압의 증가는 녹내장의 개발에 주요 위험 인자이다. 이러한 압력은 눈 뒤쪽의 망막 신경 세포의 복잡한 층에 손상을 야기한다. 시신경의 망막 신경절 세포의 축삭 손상은 더 이상 정확한 시각 정보를 수신하지 않으려면 뇌가 발생합니다. 그 결과, 시각 인식이 손실되고 완전한 실명이 발생할 수있다. 현재까지 녹내장에 대한 치료가 없습니다. 다른 처리 방법은 주로 안압을 감소시키는 것을 목표로 존재한다. 이러한 국소 포함이러한 베타 - 아드레날린 수용체 차단제, 또는 국소 프로스타글란딘 유사체와 같은 약물 클래스. 베타 차단제는 방수 (7)의 생산을 감소시켜 안압을 감소시킨다. 프로스타글란딘은 방수 8-14의 유출을 증가시킴으로써 IOP를 감소시키는 기능을한다. 알파 아드레날린 성 작용제 및 탄산 탈수 효소 저해제는 또한 보조 치료 방법으로 사용된다. 알파 아드레날린 작용제는 uveoscleral 경로 15-17을 통해 유출을 증가시킨다. 탄산 탈수 효소 저해제는 효소 저해 18 AH의 생산을 감소시킨다. 훨씬 더 침습적 절차는 녹내장을 치료하는 데 사용하고있다. 레이저 섬유주은 방수 (19)의 유출을 증가시키기 위해 사용된다. 섬유주 절제술이라는 또 다른 수술 치료, 전통 소주 경로가 20-21 차단 될 때 AH를 필터링 할 수있는 대안 배수 사이트를 만듭니다. 이러한 치료 방법은 EFF 것으로 알려져ectively 안압을 감소시킨다. 그러나, 녹내장 환자의 40 %가 더 완전한 치료 방법에 대한 필요성을 나타내는 정상 IOP 레벨을 나타낸다. (22, 23)는 또한 그것의 시작과 현재 치료 질환의 진행을 중지하지 일단 녹내장 볼 망막 신경절 세포의 사멸은 비가역 24-28. 이 뉴런 자체의 생존을 타겟팅 효과적인 신경 치료에 대한 필요성을 강조하고있다. 녹내장 모델의 개발이 개발에 매우​​ 중요합니다. 본 연구에서 우리는 원래 모리슨 (29)에 의해 설명 된 절차를 사용하여 변형 성인 긴 에반스 쥐들 녹내장과 같은 효과를 유도하는 방법을 설명한다. 이 과정에서, 상공 막 정맥총에 2 M 고장 성 식염수 주사 안압의 증가 및 망막 신경절 세포의 상당한 손실 w 선도 섬유주에 방수 유출을 줄이기 위해 조직 흉터 녹내장과 같은 조건을 유도절차 30-31 한 달 ithin. 이러한 여기에 설명 된 것과 녹내장 유발 절차, 녹내장 치료의 새로운 발전을 잠금 해제의 열쇠가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

녹내장은 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)에 영향 중추 신경계 질환이다. 시신경을 구성하는 RGC 축삭은 시각적 인식에 대한 뇌 영상 입력을 수행한다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상은 시력 상실 및 / 또는 실명에 이르게. 녹내장의 특정 원인 불명이지만, 병의 주 위험 인자 안압 상승이다. 동물 모델에서 녹내장 유발 절차는 RGC 죽음의 메커니즘을 공부하는 연구자들에게 유용한 도구입니다. 이러한 정보는 시력 상실의 예방에 도움이 있었다 효과적인 신경 보호 치료제의 개발로 이어질 수있다. 2 M 고장 성 식염수 50 μL가 상공 막 정맥총 주입되는 생체 래트 모델에서와 같은 조건 -이 문서에서 프로토콜 녹내장을 유도하는 방법을 설명한다. 선박의 창백 성공적인 주사를 나타냅니다. 이 절차는 녹내장을 시뮬레이션하는 망막 신경절 세포의 손실이 발생합니다. 다음 한 달주입, 동물 희생하고 눈은 제거됩니다. 다음으로, 각막, 렌즈, 유리체는 아이 컵을 제거한다. 망막은 안구의이면으로부터 박리 선인장 바늘을 사용하여 실 가드 접시에 고정된다. 이 시점에서, 망막 신경 세포 분석을 위해 염색 할 수있다. 이 실험의 결과는 내부 통제에 비해 망막 신경절 세포의 약 25 %가 절차의 1 개월 이내에 손실 된 것으로 나타났다. 이 절차는 생체 녹내장 래트 모델의 망막 신경절 세포 사멸의 정량 분석을 허용한다.

이 섹션은 생체 녹내장 래트 모델 녹내장과 같은 조건을 유도하기 위해 사용되는 장치 구성 요소 및 방법을 도시한다. 우리는 안압의 증가를 일으키는 고장 성 식염수 주입을 수행하는 데 사용되는 개별 도구 및 장치를 나타낸다. 우리는 그 특성 창백 효과와 결과 전방의 흐린 외관 상공 막 정맥 얼기에 주사를 보여줍니다. 우리는 또한 망막 제거 및 손실 망막 신경?...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K 조회수.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

연구

신경과학

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

생체공학

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

의학

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Nonarteritic 전방 허혈성 시신경 병증의 설치류 모델 (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

망막 신경절 세포층에서의 칼슘 활성 평가

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

저자 스포트라이트: 칼슘 이미징을 사용한 신경 전기 자극에 대한 혁신적인 접근 방식 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

녹내장 유도 절차

요약

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Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론

자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

Nonarteritic 전방 허혈성 시신경 병증의 설치류 모델 (rNAION)

쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

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