Name: studying protein function and the role of altered protein expression by antibody interference and three-dimensional reconstructions
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
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제시된 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소에서 자금에 의해 부분에서 지원 / RD 캐나다 파트너십 프로그램의 허약 한 X 연구 재단, RD, 대학 에를 랑겐 - 뉘른베르크의 Interdisziplinäres 젠트 룸에 대 한 klinische Forschung에 제롬 레조 이네 재단은 Rd 및합니다 독일 연구 협회에서 RD와 RE합니다. 저자는 pCMV5-FLAG 벡터 사용할 수 있도록 기술 세포 배양 유지 보수에 대한 지원뿐만 아니라 교수 M. 웨 그너에 대한 잉그리드 Zenger을 감사드립니다. 저자는 또한 특히 비디오 촬영에 도움이되는 지원을 위해 나디아 슈뢰더을 감사드립니다.

1. 재고 솔루션 <ol><li> 2 μg의 / μL의 최종 농도 멸균 H의 동결 건조 활성 모티브 분말 2 O를 재현 탁. 혼합주의 깊게 누릅니다. </li><li> (예를 들어, 12 ㎕를 각각 2 μL가 반응에 따라 필요) 작은 분취 량을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 세포의 2. 준비 <ol><li> 항생제를 포함하여 24 웰 플레이트에 500 μL의 성장 매체에 HEK293 세포 또는 차 신경 세포로 씨 포유 동물 세포. 주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 낮은 밀도의 세포를 시드 및 24 웰 플레이트의 두 개의 중간 열을 사용한다. 각각의 잘 따라서 배양 (단계 4.2) 동안 매체를 항구 빈 대응을해야합니다. 신경 세포를 취급 할 때는 항상 세포가 몇 분 이상 인큐베이터 밖에 유지되지되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 세포 앱까지 적절한 배양 조건의 세포 (가습 된 5 % CO 2, 37 ℃). 50 %지류. 주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 문화 원하는 발달 단계까지 세포에 도달하고 응용 프로그램을 변경할 수 있습니다. 두 매질의 25~50% 주. 매체 (1X B27, 5 mM의 L- 글루타민 및 1X 페니실린 및 스트렙토 마이신을 함유하는 (REF) (16)과 비교)로 Neurobasal 배지. </li></ol> 3. 전차 단지 형성 <ol><li> 반응 당 PBS 50 μL에 각각 POI 또는 해당 항체뿐만 아니라 제어 단백질, 또는 대조군 항체의 0.1 μg의 희석. 참고 :이 기술은 또한 거대 분자 복합체 사전 구속 일차 및 이차 항체 (. CP &#39;대표 결과&#39;그림 1)으로 구성된 작동합니다. 믹스와 스핀. </li><li> 각 샘플에 대해, 전차의 자동 연관을 방지하기 위해 별도의 튜브를 사용하여 PBS 50 μL 2 μL 전차 원액을 희석. 믹스와 스핀. </li><li> 피펫에 의해 전차의 희석에 희석 POI 또는 항체 (3.1 단계)를 전송팅. 믹스와 스핀. </li><li> 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 혼합물 (POI 전차 - 복합체 형성 할 것이다). </li></ol> 셀의 4. 형질 <ol><li> 전차 단지 사전 예열 성장 매체 100 μL (37 ° C, 무첨가)에서 (단계 3.4) 희석. 매체를 제거하고 한 번에 미리 예열 1X PBS를 사용하여 세포를 씻는다. 주 : 신경 세포를 사용하는 경우, 배지를 폐기하지 않는 것이 재사용 될 것이다. 37 ℃에서 보관하십시오. 세척, PBS가 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 염화칼슘 (2)를 포함하는 사용합니다. 제안 : 접시 (4.5 단계)을 배양하는 동안 빈 우물에 매체를 보관합니다. </li><li> 세포에 전차 착체 용액 (단계 4.1)를 적용하고, 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 조심스럽게 흔들어 세포. 1 시간 동안 표준 조건 (단계 2.2)에서 세포를 성장. 10 %의 최종 농도로 혈청을 추가한다. 신경 세포를 사용하는 경우, 단계 4.1에서 매체를 추가 할 수 있습니다. 1 ~ 2 시간 이상 세포 성장. 참고 :최적의 배양 시간은 규모와화물의 특성에 따라 실험적으로 조정할 필요가있다. 다음의 제안은 가이드 라인으로 역할을 할 수있다 : 펩타이드를 들어, 1 시간 ~ 2 시간이 항체, 2 시간을 권장하고, 항체와 신경 세포의 형질 4 시간 동안하는 단백질, 일반적으로 충분합니다. </li><li> 평소와 같이 분석을위한 프로세스 세포. 참고 : 기술은 고정 프로토콜뿐만 아니라 라이브 영상을 사용하여 실험과 호환됩니다. </li></ol> 5. 이미지 <ol><li> 레이저 주사 현미경을 사용하여, 약 0.25-0.5 μm의 거리를 사용하여 세포 및 / 또는 관심의 세포 구획 Z-스택을. 정확한 층 거리 재구성 될 구조물의 크기에 따라 개별적으로 결정되어야한다. </li></ol> 6. 재건 <ol><li> 다음 단계에서 O를 클릭하여 여러 개체를 선택하려면 선택과 이동, Cntr을 사이를 전환 할 Esc를 바닥을 사용n은 그들과 Shift 키 객체 (CP를. 6.10 단계) 잘라. </li><li> Imaris에서 LSM-파일을 엽니 다. </li><li> 밝은 구조가 포화에 도달 할 때까지 각 채널의 표시를 조정하여, 화상을 대조. 표면 구조에 영향을주지 않습니다이 조정은, 그것은 단지 이미지를 임계 화에 실험을 지원하는 역할을 양해 바랍니다. </li><li> 새로운 표면 추가 아이콘을 클릭합니다. 마법사가 열립니다. </li><li> 선택 : 관심의 세그먼트 만 지역. 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 관심의 목적에 맞게 선택 상자의 여백을 조정합니다. 이미지는 3 차원이 숙지하고 선택뿐만 아니라 Z 평면에서 조절해야한다는 부담주십시오. 선택 박스의 직사각형이 제대로 관심의 대상이 일치하지 않아야하는 경우, 객체를 회전 및 / 또는 모든 필요한 구조를 포함 할 때까지 선택을 확대. 원치 않는 개체가 나중에 제거 할 수있다 (CP. 6.10 단계). 발하다. </li><li> 해당 채널을 선택합니다annel. 표면적의 상세 수준 또는 구 직경은 구조가 재구성되고 일치하도록 설정해야합니다. 상기 신호 특성에 따라 절대 강도 또는 로컬 콘트라스트 중 하나가 사용될 수있다. 일반적으로, 지역 대비 확산 신호에 대한 더 나은 작동합니다. 어떠한 경우에도, 설정이 각각 관심있는 각각의 신호 또는 구조에 대해 개별적으로 조절 될 필요가있다. </li><li> 임계 화 도구를 사용하여 관심의 구조를 재구성. </li><li> 녹색 화살표 아래를 클릭하여 복원을 완료합니다. </li><li> 절단 및 필요에 따라 표면을 제거하기 위해 연필 도구를 사용하여 추가 개체를 조정합니다. 원하는 개체를 절단하기 위해 이미지를 따라서 남북 방향으로 절단 기울에만 가능합니다. </li><li> 선택 통계, 자세한 통계 및 평균 값에 의해 각 표면 볼륨 영역의 측정과 강도를 얻습니다. </li><li> 색상 코드 통계를 관찰하려면 (선택 단계) (CP. 그림 2E </strong&gt; 및 F)는, 해당 표면의 색상 탭을 선택하고 대신 &#39;자료&#39;의 &#39;통계 코딩&#39;을 표시합니다. 몇 가지 옵션이 표시됩니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서는 도즈 구동 방식으로 세포 기능을 조절 단백질 발현 수준의 중요성을 연구 프로토콜을 제시한다. 기술 된 프로토콜은 그러므로 세포 수준에서 단백질 기능의 상세한 연구를 촉진 해마 신경 세포 등 다양한 종류의 포유류 세포에서 단백질 발현의 미세 조정 조작을 허용한다. RNA 간섭의 POI를 하향 조절하는 공지의 방법을 나타낸다 있지만 단점 (CP있다. 14)를 ?...

모든 살아있는 유기체 자체 개발 명령뿐만 아니라 환경 신호에 반응하는 단백질 발현의 엄격한 제어가 필요하다. 따라서, 메커니즘은 다수 정확하게 앱 부호화 각 단백질의 발현을 조절하는 진화 중에 고안되었다. 그 삶의 주어진 시간에 모든 진핵 세포에 존재하는 20,000 유전자. 단백질 생산의 다른 단계에서 발생하는 규제 메커니즘은 번역 후 단백질 수정, 전송 및 분해의 방향으로 처리 크로 마틴 구조, 전사 및 RNA의 관리에 이르기까지 다양합니다. 분자 기계 및 변형 단백질 발현 수준을 기본에 고장이 암 또는 지적 장애 등 다양한 질병과 연관되어 있는지, 따라서 놀라운 일이 아니다. 사실, 신경 세포의 개발 및 포유 동물의 뇌 기능의 뛰어난 복잡성에서 찾고 SENSI단백질 발현의 변화에​​ 이러한 정교한 시스템의 tivity는 알츠하이머와 허약 한 X 증후군 (FXS) 같은 파킨슨 병 (AD 및 PD)뿐만 아니라 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD) 등 여러 가지 잘 알려진 지적 적자에서 드러난다. 후자 질병은 하나의 번역 조절 단백질 FMRP (유약 X 정신 지체 단백질) 1-4의 손실로 인한 ​​단백질의 다양한 광범위한 misexpression 특징으로한다. 점 돌연변이는인지 장애 환자에서 식별되지 않은 상태에서 5 캐핑 mRNA의 수정에 의해 mRNA의 안정성과 변환을 관리 또한, 가변 전하에 영향을 미치는 염색체 재구성 연결된 x를 단백질 A (VCXA) 단백질은 최근 지적 결핍과 연관되고 지금과 같은 6, 7, 관찰 된 정신 장애는 변경된 VCXA 발현과 그 대상 보호 자전거의 조절 이상 발현에서 발생한 것을 건의인. 이러한 연구 결과, 드 노보 ASD와 관련된 유전자의 복제 수 변화에 따라서 상승 또는 감소 단백질 발현 수준이 발생할 수 있음을 아이디어를 지원하는 새로운 유전자 중복 및 삭제 ASD (8)의 중요한 위험 인자임을 설립 여부를 조사 연구와 일치 지적 적자. 놀랍게도, 최근의 연구는 또한 특정 단백질의 발현 량을 정확하게 거의 안전 여유도 9 높은 단백질 량의 결과로서 그 응집을 방지하도록 조절되어 있다는 증거를 제공 하였다. 따라서, 심지어 작은 단위는 AD 및 PD (9)과 같은 질병을 유발하기에 충분하다는 것을 제안되었다. 단백질 발현 조절에 기여하는 분자 기계의 다양한 이러한 결과에 비추어 복잡한 조절 방식을 제안했지만, 5000 포유류 유전자 (10)의 발현 량을 조사하는 연구는 것을 증명자연은 더 인색 방식을 선호 : 단백질의 세포 풍요 로움을 주로하여 RNA 가용성 관리는 주로 미세 조정하는 단백질 발현을 제공한다는 설명, 번역 (10)의 수준에서 조절되는 것으로 나타났다. 관심 단백질의 용량을 연구 장소 (POI)를 따라서 만 내인성 단백질의 기능을 이해하는 것이 중요하지만, 또한 많은 질병의 연구 및 치료의 개발이 아니다. 따라서, 지난 수십 년은 POI의 복용량을 조작하는 RNA 간섭을 사용하여 몇 가지 전략의 발전을 보았다. RNA 간섭 널리 단백질의 기능을 연구하기 위해 사용되며, 심지어 암, 안과 질환의 치료뿐만 아니라 환자의 11-13 항 바이러스 요법을 추구하는 임상 시험에 적용되고 있지만, 약간의 어려움이 전략 불가능 렌더링 할 수있는 발생할 수있다. 예를 들어, 상 동성으로 최저 구동 시드 시퀀스는 compara은상상력 짧은, 따라서 홍보 오프 대상 효과. 고효율 서열이 드문 및 시간과 비용이 많이들 수있는 권리 순서를 식별 (14 리뷰) 옵션의 수천 사이에서 발견해야하지만 이후 결과는 여전히 실망 할 수있다. 또 다른 전략은 직접 항체에 의해 POI를 대상으로하는 것입니다. 여기서, 우리는 세포 단백질의 가용성을 감소 (활성 모티프 제조) 단백질 담체 전차의 사용을 설명하고, 삼차원 재구성의 고용 녹다운 따라 단백질의 기능을 연구. 전차, 자체 2.8 kDa의 펩타이드의 활성 모티브, 포유 동물 세포 (15)의 세포막을 가로 질러 셔틀 펩티드, 단백질 및 항체로 사용된다. 전차-POI 단지 가는데, 소수성 상호 작용을 이용하여 비공유 결합 된 거대 분자 복합체를 형성함으로써 관심 장소와 펩타이드 관계자는 엔도 좀-IND 세포에 내장되어 있습니다ependent 방법. 중요한 것은, 전차가 왕복 단백질의 세포 내 위치 파악에 영향을 미치지 않으며, 세포 독성 효과를 발휘하는 또는화물 (15)의 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로도 나타내었다.

<table><tbody><tr><td>Chariot</td><td>Active Motif</td><td>30025</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life technologies</td><td>21103-049</td><td>warm up to 37 &amp;deg;C before using</td></tr><tr><td>1x B27</td><td>Life technologies</td><td>17504044</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life technologies</td><td>25030-149</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane</td><td>n.a.</td><td>expensive, but unmatched</td></tr><tr><td>Laser Scanning Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

studying protein function and the role of altered protein expression by antibody interference and three-dimensional reconstructions

단백질 발현의 엄격한 관리가 살아있는 유기체의 모든 필수적인 아니라 세포 모델에서 단백질의 기능을 조사하는 중요한 전략뿐만 아니라. 따라서, 최근의 연구는 RNA 및 항체 간섭을 포함하여 포유 동물 세포주 또는 동물 모델에서의 단백질 발현을 대상으로 다른 도구를 발명했다. 첫 번째 전략은 지난 20 년 동안 많은 관심을 수집하고 있지만, 세포막에서 세포에 항체화물의 전위를 매개 펩타이드는, 훨씬 적은 관심을 얻을. 이 공보에서는 항체 간섭 실험을 수행하기 위해, 인간 배아 신장 세포에서뿐만 아니라 차 해마 뉴런 전차라는 펩티드 담체를 이용하고 상기 단백질의 기능을 분석하는 삼차원 재구성의 적용을 설명하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리의 연구 결과는 전차는 아마도 핵 지역화 신​​호, particula에 있음을 시사RLY 소마와 핵에 존재하는 단백질을 대상으로 매우 적합합니다. 차 해마 문화에 전차를 적용 할 때 놀랍게도, 시약은 놀라 울 정도로 잘 해리 신경 세포에 의해 허용 될 밝혀졌다.

다음 단락에서, POI의 기능 최저 설명 예시 결과 전차 시약 및 항체의 간섭이되게됩니다 사용 (Simiate는, 자세한 내용은 16, 17 참조). 연구 결과는 Simiate의 감소 발현이 전사 활성을 저해하고, 투여 량 의존적으로 높은 항체 양 (&gt; 1 μg의 항체)을 적용 할 경우 99 %의 사망률에서 남중, 세포 사멸을 유도 입증 (이 발견은 이전에 발표되었다 (16)). 여기서는 상세하게 사용?...

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Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.

공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Bioengineering

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비디오: Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

연구

환경과학

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

생화학

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

면역학 및 감염병학

Structural Analyses of An Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Single-Chain Fragment Variable via An In Silico Approach

Single-chain fragment variable (scFv) antibodies were previously constructed of variable light and heavy chains joined by a (Gly4-Ser) 3 linker. The linker was created using molecular modeling software as a loop structure. Here, we introduce a protocol forin silico analysis of a complete scFv antibody that interacts with the epidermal growth factor receptor (EGFR). The homology modeling, with Pyrx of protein-protein docking and molecular dynamic simulation of the interacting scFv antibody and EGFR First, the authors used a protein structure modeling program and Python for homology modeling, and the antibody scFv structure was modeled for homology. The investigators downloaded Pyrx software as a platform in the docking study. The Molecular dynamic simulation was run using modeling software. Results show that when the MD simulation was subjected to energy minimization, the protein model had the lowest binding energy (-5.4 kcal/M). In addition, the MD simulation in this study showed that the docked EGFR-scFv antibody was stable for 20-75 ns when the movement of the structure increased sharply to 7.2 &#197;. In conclusion, in silicoanalysiswas performed, and the molecular docking and molecular dynamics simulations of the scFv antibody proved the effectiveness of the designed immune-therapeutic drug scFv as a specific drug therapy for EGFR.

<meta charset="utf8"></head><body>In silico 접근법을 통한 표피 성장 인자 수용체 특이적 단일 사슬 단편 변수의 구조 분석

This antibody homology modeling prediction protocol is followed by antibody-receptor Pyrx docking and molecular dynamic simulation. These three primary methods are used to visualize the accurate antibody-receptor binding areas and the binding stability of the final structure.

In silico 접근법을 통한 표피 성장 인자 수용체 특이적 단일 사슬 단편 변수의 구조 분석

Single-chain fragment variable (scFv) antibodies were previously constructed of variable light and heavy chains joined by a (Gly4-Ser) 3 linker. The ...

유전학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

생물학

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

공부 단백질 기능 및 항체의 간섭과 3 차원 재건에 의해 변경 단백질 발현의 역할

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최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

In silico 접근법을 통한 표피 성장 인자 수용체 특이적 단일 사슬 단편 변수의 구조 분석

In silico 접근법을 통한 표피 성장 인자 수용체 특이적 단일 사슬 단편 변수의 구조 분석

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화