Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

동물 사용에 대한 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 관리 및 사용을위한 설명서에서 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 실험 동물의. 1. 뇌 추출, 단면 및 조직 준비 <ol><li> 깊이 5 분 동안 CO 2 질식으로 안락사에 의해 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 희생. 자궁 전위에 의해 죽음을 확신합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 헤드를 청소합니다. </li><li> 제 두개골을 노출시키기 위해 머리 위쪽부터 떨어져 피부를 당겨 멸균 가위 집게를 사용하여 두개 절제술을 수행한다. </li><li> 그런 다음, 두개골이 노출 될 때, 뼈 조각별로 조각을 벗겨 후방 측에서 시작하여 전방쪽으로 이동하여 두개골을 제거합니다. 뇌 심실을 파괴하지 않도록주의해야합니다. </li><li>전체 뇌를 수집합니다. </li><li> 페니실린 10000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 및 예열 10,000 ㎍ / ml를 함유 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액을 함유 100mm 배양 접시에서 뇌를 놓고 37 ° C까지. </li><li> 날카로운 블레이드와 손으로 정중 시상면에 뇌를 슬라이스하고, vibratome를 사용하여 각 반에서 첫 번째 100-200mm 섹션을 구하십시오. </li><li> 미리 예열 37 ° C, 인산 완충 식염수 (1X PBS) 용액으로 뇌 조직을 헹군다. </li><li> 즉시 DMEM / 높은 포도당 미디어 37 ℃로 미리 예열 뇌 섹션을 배치합니다. </li></ol> 2. 라이브 영상 구성 및 설정 <ol><li> DMEM / 높은 포도당 미디어 1 ㎖를 포함 30mm의 유리 바닥 배양 접시의 뇌 조직 섹션을 배치합니다. 95 % / 5 % O 2 / CO 함량이 37 ° C, (도 1의 현미경 밀폐 챔버 환경을 조정 </str옹&gt;). </li><li> 60X 대물 오일 침지 렌즈를 사용하여, 제 60X 대물 렌즈의 기름 방울을 배치하고 정기적 DIC와 셀에 초점 뇌실막 세포 / 섬모 영상 수집은 광을 투과. </li><li> 섬모 구타 영역에서 기포 운동 종류를 만들 때 다음, 뇌실막 운동성 섬모의 위치 기준으로 DMEM 거품 이동 방향을 따른다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 뇌실의 운동성 섬모와 건강한 세포를 포함하는 영역을 선택합니다. 뇌실막 섬모가 발견되면, 빛을 조정하고 양호한 화상을 얻는 데 초점을 맞춘다. </li><li> MetaMorph로부터 촬상 소프트웨어를 이용하여 특정 용도에 따라 라이브 영상 파라미터를 설정한다. 본 데모에서는 객관적인 60X 5 ~ 10 밀리 초 노출 시간과 함께 1 × 1 카메라 비닝 세트 이십사 비트 이미지를 획득. </li><li> 최소 특급을 위해 최적 수준으로 현미경 조리개를 열어 DIC 이미지 수집osure 시간. 지체없이 신속하고 즉시 이미지 수집을 제공하기 위해 카메라에 라이브 영상 스트림을 관찰한다. 충분한 화상 콘트라스트를 획득하기 위해 최소 노출 시간의 요건에 기초하여 섬모 박동의 속도를 계산한다. </li></ol> 3. 데이터 시각화 및 분석 <ol><li> 1 분에 구타의 수를 계산하여 섬모의 구타의 수를 계산합니다. 비디오의 속도를 감소시키고 셀 카운터 또는 유사한 공구를 사용하여 비트 수를 카운트하여 수행. </li><li> 매질의 주파수를 계산하기 위해, 비디오 초의 수를 얻기 위해 획득 프레임 또는 시간 경과 화상의 수에 의해 기록되는 노광 시간을 곱한다. (예 : 노출 시간 5 밀리 초 200 프레임 = 1000 밀리 초 또는 1 초). </li><li> 초 당 하나의 박동 수로 표현되는 주파수를 획득하기 위해 1 초 매질의 수를 계산한다. 1 초 시간 간 동안 섬모의 구타의 수를 분할하여이 작업을 수행발은 (예 : 섬모는 = 1 초 5 밀리 초, 즉 5 밀리 X 200 프레임의 노출 시간 기록 (200) 프레임 비디오에서 50 회 박동, 지금은 1 초 = 50 Hz에서 50 비트를 분할). </li><li> 모두 전원 및 복구 스트로크하는 동안 뇌실막 섬모에 의해 촬영 경로를 평가하여 섬모 치는 각도를 계산합니다. 약간의 수정 (11)와, 이전에 기술 된 방법에 따라이 작업을 수행합니다. 각각의 섬모 운동의 정확한 완전한 비트주기 동안 관찰된다. </li><li> 모니터 위에 배치 아세테이트 시트에서 뇌실막 가장자리와 동력 행정의 개시시 섬모의 중심선 위치를 통해 수직 라인을 따라 수평 라인을 그린다. </li><li> 이 동력 행정 중에 전진으로 프레임에 의해 섬모 프레임의 정확한 위치를 플롯. 유사한 방식으로, 복구 행정 중에 섬모의 운동을 플롯. </li><li> T시의 중간 선에서 섬모의 최대 편차에서 섬모 치는 각도를 계산동력 행정뿐만 아니라 복구 스트로크 그가. </li></ol> 4. 칼슘 신호 기록 <ol><li> 뇌를 슬라이스 한 후, 간단히 1X PBS 또는 둘 베코의 PBS (PH 7.0)와 뇌 조각을 씻어. 형광 소광을 방지하고, 양호한 신호 대 잡음비를 구하는 신선한 FLUO-2를 준비한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO-2 액 1 mM의 스톡 용액을 준비 혼합 FLUO-2를 균일 DMSO에 용해 될 수 있도록 적어도 5 분 동안 용액을 소용돌이. </li><li> 2 % B27로 보충 된 DMEM / 하이 글루코스 500ml에 FLUO-2 원액 희석하여 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 37 ° C로 미리 예열. 주 : B-27 비타민 A, 항산화 칵테일 및 해마 및 기타 CNS 신경 세포의 단기 또는 장기 생존 능력을 지원하기 위해 사용되는 인슐린을 포함하는 최적화 된 무 혈청 보충. </li><li> 즉시 유리 - 바닥 플레이트에 37 ° C에서 30 분 동안 20 ㎎ / ㎖ FLUO-2 뇌 슬라이스 배양한다. </li><li> 칼슘 형광체 FLUO-2의 최적 로딩 농도를 결정하고, ATP와 칼슘 염료 세포 독성 공격 세포를 방지하고, ATP에 응답하여 시간 경과와 칼슘 신호의 피크 진폭을 측정함으로써 세포 생존을 확인. </li><li> 488 nm의 515 nm의 각각 (영화 2)의 여기 및 방출 파장, 1 초 (초당 200 프레임)의 최소 5 밀리의 캡처 속도로 칼슘 진동에 대한 비디오를 기록합니다. </li><li> 자가 형광 또는 이동 유물에서 FLUO-2 칼슘 신호를 구별하기 위해, 515 nm에서 방출 강도가 개별적으로 모니터링되어 있는지 확인합니다. 참고 : FLUO-2는 세포 내 칼슘을 정량화하기에 적합한 칼슘 fluoremetric 없습니다. 그러나, 칼슘 진동 빨리 칼슘 변화를 감지하는 우수한 동적 칼슘 염료이다. 보다 정확한 칼슘 정량,의 Fura-2를 권장합니다. 그러나의 Fura-2의 동적 변경은 그 비율 적으로 한정염료의 특성. </li><li> 정확한 무료 세포 내 칼슘의 값을 계산하기 위해 제조업체에서 제공하는 공식을 따릅니다. 예 [칼슘 2 +] = K의 D × (R - R 분) / (R 최대 - R). K (D)가 해제 칼슘으로부터 염료의 해리 상수이고, R은 488에서 측정 된 형광이고, R과 R 분의 최대 최소 및 최대 이온 농도 12에서 형광 비율이다. </li></ol> 5. 면역 형광 현미경 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 10 분 동안 2 % 수 크로즈를 함유하는 인산염 완충 식염수와 뇌 부분을 수정. 또한, 저온 유지 장치를 사용하여 50mm의 섹션으로 4 % PFA 다음과 섹션 전체 뇌를 해결. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> soluti와 뇌 조각을 품어5 분 1X PBS에서 0.1 % 트리톤-X의에, 다음 5 분 때마다 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 밤새 4 ℃에서, 실온 (RT) 또는에서 1 시간 동안 1X PBS에 10 % FBS에서 5000 : 마우스 일차 항체로 뇌 슬라이스 부화 1의 희석에 사용 - 튜 불린을 antiacetylated. </li><li> 5 분마다 시간을 1X PBS로 조직을 세 번 씻으십시오. </li><li> 이차 항체의 뇌 슬라이스 부화 1의 희석 레세 항 - 마우스 IgG : RT에서 1 시간 동안 1X PBS 용액 500 10 %의 FBS. </li><li> 5 분 핵 (또는 DNA) 13 얼룩 4 &#39;, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)와 섹션 Counterstain과 형광 현미경으로 관찰하기 전에. 가능한 최소 노출 시간 구간 바로 광표백 화상을 최소화. </li></ol>

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Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. 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M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실시간 이미징과 뇌 심실 내에 뇌실막 섬모의 신속하고 민감하게 관찰을 제공 형광 현미경 모두 마우스 뇌 조직의 준비를위한 프로토콜은 여기에 설명한다. 이 기술은 뇌실에 한정되지 않는다; 그것은 다른 뇌 심실에서 섬모를 관찰하는 데에 이용 될 수있다. 이 영상 기술은 생체 외 환경에서 섬모의 박동에 의해 뇌척수액의 움직임과 유사한 라이브 스트림을 제공한다. 또한, 섬모의 운동 ?...

섬모 세포 외 환경으로 세포 표면으로부터 연장 감각 미세 소관 기반 소기관이다. &quot;9 + 0&quot;또는 &quot;9 + 2&quot;- 미세 소관들은 조직에 따라 섬모는 두 가지 유형으로 분류 될 수있다. 기능적으로, 그들의 운동에 기초하여, 이러한 운동성 또는 비 - 운동성 섬모 1로 분류 될 수있다. 차 섬모는 일반적으로 &quot;9 + 0&quot;비 운동성 섬모를 나타 내기 위해 사용되는 용어입니다. 이들은 ( &#39;9&#39;로 표시) 아홉 평행 겹 미세 소관 있고 미세 소관의 중앙 쌍 ( &#39;0&#39;로 표시) 내에서 중앙 피복 부재. 그러나, 배아 편측성 규제 등 절점 섬모 일부 &quot;9 + 0&quot;섬모는 2 운동성이다. 한편, 운동성 섬모는 미세 소관 이중선의 추가적인 중앙 쌍, 아홉 병렬 미세 소관 이중선에 더하여, 특징 및 운동성을 촉진하기 네인 모터 단백질과 연관된. 또한, 일부 &quot;9이러한 후각 섬모 등이 &quot;섬모 3 비 운동성이 있습니다. 뇌 심실 및 척수의 중심 관을 긋고 뇌실막 세포는 뇌 심실 4 따라 뇌척수액 (CSF)를 추진 운동성 섬모 특징으로한다. 이 방법의 전반적인 목표는 섬모 역학과 구조적 이상 운동성 연구를 촉진하는 것입니다. 뇌의 건강과 발전은 크게 뇌의 뇌실 내 뇌척수액의 효율적인 순환에 따라 달라집니다. 예를 들어, 정상 뇌척수액의 흐름과 유체 균형은 정상 박동 차례로 신경 세포의 방향 움직임을 조절하는 중요한 역할을하고 세포 이동 (7) 줄기 기능 뇌실막 섬모 5,6 필요합니다. 이러한 비정상적인 뇌실막 섬모 기능 또는 뇌수종과 연관된 비정상적인 CSF 흐름을 초래할 수 구조체로서, 용태가있는 (B)의 심실에서 CSF의 비정상 축적이 존재비. 이것은 결과적으로 두개 내 압력과 머리, 경련, 터널 비전의 점진적 확대, 정신 장애 (8) 증가의 원인이 될 수 있습니다. 기존의 방법에 비해이 기술의 장점은 세 가지 뇌실막 세포 유형을보고 처음 허용한다는 것이다 : I, 고유 모양체 비팅 주파수 및 각도 박동에 근거 II 및 III. 이 뇌실막 세포는 뇌의 뇌실에 특정 지역 내에서 지역화됩니다. 또한, 나이 등과 같은 알코올 및 뇌실막 세포 유형 또는 지역화 변경에 실로 스타 졸과 같은 약리학 적 제제의 효과는 뇌실막 세포의 분류 이전에는 불가능이었다 증명 될 수있다. 실로 스타 졸은 포스-3 저해제, AMP에 캠프 대사 효소이며 세포 내 칼슘도 9를 조절한다. 고속 형광 영상 분석을 이용하여 세포 내 고유의 이미징 및 정량을 허용뇌실막 세포의 칼슘 진동 특성. 예를 들면, 실로 스타 졸 및 알콜 모두 크게 차례로, 뇌실막 섬모 10 의해 뇌척수액 볼륨 여분의 변화로 이어질 수 뇌실막 모양체 비팅 주파수뿐만 아니라, 세포 내 칼슘의 진동 특성을 변경. 요약하면,이 기술은 다른 칼슘 발진 특성 뇌실막 세포의 세 가지 유형 중 첫번째 증거를 제공하는 핵심이다. 다음 섹션에서, 절차의 상세한 단계별 개요는 티슈 제조 및 취급에 세심한주의를 기울이고, 제공된다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td><td>Cellgro Mediatech Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-SP</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-2395</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-2&amp;nbsp;</td><td>TEF Labs</td><td>#0200</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451&amp;nbsp;</td><td>clone 6-11B1</td></tr><tr><td>FITC Anti-mouse antibody</td><td>Vector Labs</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture plate</td><td>VWR Vista Vision</td><td>30-2041</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip (18 x 18)</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004.326</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Nikon TE2000</td><td>60X oil&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24 x 60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>VWR Vista Vision</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI filter cube</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated 뇌실막 세포는 성인의 뇌에 심실 라인. 이상 기능이나 뇌실막 섬모의 구조는 다양한 신경 학적 결손과 관련이있다. 운동성 섬모 뇌실막 기술의 생체 라이브 영상 전류는 여러 단계를 다음과 섬모의 역학에 대한 자세한 연구를 위해 수 있습니다. 이 단계는 다음과 같습니다 마우스 이산화탄소와 안락사를 톨레도의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학의 프로토콜에 따라; vibratome 또는 날카로운 블레이드와 뇌 제거 및 시상 뇌 해부 다음에 두개 절제술은 뇌실막 섬모가 가시화 될 수있는 뇌 측면 심실을 통해 매우 얇은 섹션을 얻었다. 95 % / 5 % O의 존재하에 2 / CO 2 혼합물을 37 ℃에서 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) / 하이 글루코스를 함유하는 맞춤형 유리 - 바닥 접시 뇌 슬라이스 포란 살아있는 조직을 유지하는 것이 필수적이다 시실험. 섬모 고해 비디오이어서 고해상도 미분 간섭 현미경을 이용하여 기록된다. 비디오는 섬모 비팅 주파수를 계산하는 프레임 단위로 분석한다. 이것은 그들의 섬모 박동 주파수와 각도에 따라 세 종류 또는 유형에 뇌실막 세포의 뚜​​렷한 구분을 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 뇌실막 세포 특유의 세포 내 칼슘 발진 특성뿐만 아니라, 칼슘 진동에 약리학 적 제제의 효과 및 모양체 비팅 주파수의 특성을 고속 형광 영상 분석의 사용을 허용한다. 또한,이 기술은 섬모 구조 및 섬모 단백질 지역화 연구 면역 촬상에 적합하다. 이는 질병 진단 및 표현형 연구에서 특히 중요하다. 뇌 조직이 죽는 시작으로 기술의 주요 제한은 라이브 운동성 섬모 운동의 감소에 기인한다.

라이브 마우스의 뇌에 뇌실막 섬모 기능을 측정 이 프로토콜에 기재된 방법은 마우스 뇌뿐만 아니라 모니터링 섬모 비팅 주파수 공부 해부 신선한 조직 뇌실막 섬모 기능과 구조를 모니터링하는 데 사용된다. 전체 실험을 수행하기 위해 그 다음 단계는 개략 플로우 차트 (도 1)에 도시된다. 이것은 고도로 실험 가능한 활성 운동성 섬모를 유지하기 위해 짧은 시?...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K 조회수.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다. 

비디오: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

연구

신경과학

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Visualizing Neuronal and Glial Cell Dynamics in the Developing Mouse Brain

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

저자 스포트라이트: Exploring Cell Migration and Gene Roles in the Developing Brain

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

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생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

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인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징