저자는 기술 개발과 훈련의 지원을 위해 빌 &amp; 멜린다 게이츠 재단 감사합니다.

주 :이 프로토콜은 96 웰 플레이트, 8 튜브 스트립, 모세관 기반 시스템 (10 μL의 반응 부피)에 대한 양 및 농도를 포함한다; 그러나, HRM은 대응하는 모든 볼륨을 스케일링하여 5 μL의 반응 부피로 384 웰 플레이트 기반 시스템에서 수행 될 수있다. 대부분의 시스템에 대한 검색의 범위는 10 NG의 주형 DNA에 10 페이지입니다. 1. 템플릿을 준비 <ol><li> 혈액 필드 사이트 연구에 참여하는 환자에서 얻은 전체 혈액 저장, 펠렛 적혈구, 또는 필터 종이에 직접 말라리아 원충 샘플을 얻습니다. 참고 : 시료는 문화 적응 체외에서 성장을 할 수있다; 분석에 대한 몇 가지 표준 실험실 균주가 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 (MR4에서 주문할 수 있습니다, 샘플 펠렛 적혈구 나 문화에서 직접 사용할 또는 전혈, 적혈구, 또는 여과지에서 추출 할 수있다. </li><li> DNA 추출여과지 또는 문화 적응 균주 참고 : HRM 소금 농도에 민감하다; 인해 가변 추출 방법에 농도 차이가 유의 용융 온도에 영향을 줄 수있다. 특정 최종 버퍼가 성공을위한 중요한 요소는 없지만, 표준 공통의 용출 또는 부유 버퍼 (즉, 물, 1X 테 [ &#39;낮은 테&#39;또는 &#39;DNA 서스펜션 버퍼&#39;: 10 mM 트리스 - CL, 0.10 mM의 EDTA]를 사용하거나 1X TE [10 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA]) 모든 샘플이 변칙 또는 일치하지 않는 용융 곡선을 방지하기 위해. <ol><li> 의 템플릿 희석을 준비 10 페이지 -10 NG 당 μL 표준 테, TE, 또는 물을 각각 10 μL 반응. </li></ol></li><li> 펠렛 적혈구에서 직접 증폭 <ol><li> 얇은 스미어 현미경을 사용하여 적혈구를 결정 기생충 참고 : 감염된 적혈구의 기생충을 결정하는 방법은 질병 통제 예방 센터 (CDC)에서 사용할 수 있습니다 : HTTP :<html> //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html </li><li> 0.5 % 1 위 parasitemias을 희석 : (400) PCR 등급 물, TE, 또는 테에서. 각 5 10 μL 반응에 3 μl를 사용합니다. </li></ol></li><li> 통제 수단 주 : HRM은 시퀀스 인구 (12)에 변형 검출 유전자 검사에 이용 될 수있다; 그러나, 정확한 유전자형은 표준 순서 검증 된 SNP를 포함하는이 심문이 필요합니다. 알려진 유전자형이 사용할 수있는 플라스미드 구조 또는 말라리아 분리합니다. 대부분의 애플리케이션의 경우, 3D7 (MRA MR4-151) 야생형 대조군으로 사용된다. 때문에 간 실행 변동성에 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함한다. <ol><li> 긍정적 인 컨트롤 : - 시퀀스 확인 SNP 유전자형과 1 μL 플라스미드의 희석 또는 표준 당 10 ng의 10 페이지를 준비합니다. </li><li> 증폭 반응에 대한 노 템플릿 컨트롤 (NTC)으로 사용 된 PCR 등급 물 : 음성 제어 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. PCR 증폭 <ol><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> (선택 사항) 미네랄 오일 오버레이. 참고 : 일부 HRM 시스템은 플랫폼 독립 용융하고 증폭 동안 축합 생성물 및 증발을 방지하기 위해 가열 된 뚜껑이 없다. <ol><li> 반응 혼합물을로드하기 전에, 각 웰 플레이트에 20 μL 광 광유를 추가한다. </li></ol></li><li> 모든 분석의 10 배 작업 주식을 준비 <ol><li> 추천 10 배 근무하는 농도뿐만 아니라 차단 프로브 기반 HRM의 유전자형에 대한 최종 농도는 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 반응 혼합물을 준비 <ol><li> 웰 플레이트 또는 튜브의 각에, 앞으로 주식을 작업 1 μL 10 배 추가하고 프라이머 및 프로브, 4.0 역 - 10 μL 총 반응 부피 5.0 μL의 2.5 배 또는 2.0 배의 인사 마스터 믹스, 1 μL 템플릿 및 PCR 등급 물 . </li></ol></li><li> 커버 플레이트 또는 튜브 <ol><li> 광학 플레이트의 사용모세관 기반 시스템 용 플레이트 기반 증폭을위한 평가 보증 등급 (EAL), 스트립 튜브 기반 시스템 용 광학 캡, 플라스틱 캡. 수 있는지 범위는 완료되고 접시와 뚜껑을 완전히 밀봉 증폭 동안 증발을 방지하기 위해 고정된다. </li></ol></li><li> 스핀 샘플 <ol><li> 스핀 플레이트 1,800 XG에서 3 분, 기포를 제거하기 위해 미네랄 오일이 사용된다면 오일 및 수성 상을 분리. </li></ol></li></ol></li><li> 증폭 프로토콜 <ol><li> 열 자전거 타는 사람에 반응 플레이트 또는 튜브를 놓습니다. 실행 표준 차단 프로브 또는 MAAB 증폭 프로토콜 (표 각각 2, 3). 이들 방법 간의 어닐링 온도에서 차이가 있음에 유의해야한다. </li></ol></li></ol> 3. HRM 분석 <ol><li> 용해 <ol><li> PCR 증폭 한 후, 분석 녹는를 진행합니다. 내장이없는 증폭 독립 용융 시스템 (예., BioFire 국방 LightScanner 시스템)의 경우, 재HRM 상품에 열 자전거 타는 사람과 장소에서 증폭 판을 이동합니다. 두 프로브 및 앰플 리콘 용융 피크를 생성하기 위해 80 °의 C - 시스템 소프트웨어 인터페이스에서, 플레이트 (40)로부터 용융. 주 : 용융 및 분석 시간을 절약하기 위해, 용융 창이 단지 프로브 또는 앰플 리콘 용융 영역을위한 온도 범위를 커버하도록 단축 될 수있다. 필요하고 -20 ° C 또는 4 ℃에서 보관하는 경우 용해 후, 플레이트 및 튜브 재 용융 될 수있다. 만 4 ℃에서 보관 유리 튜브는 균열에서 튜브를 방지합니다. </li></ol></li><li> 용융 분석 <ol><li> 음의 샘플을 제거 <ol><li> 분석 소프트웨어 내에서 증폭 또는 그 들쭉날쭉 용융 피크를하지 않았다 추가 분석 샘플에서 제거합니다. 참고 : 각각의 실행 파일에 대한 분석의 모드를 선택한 후, 기기가 자동으로 그룹 양극과 음극 샘플을. 각각의 서브 세트를 유전형 전에 사용자가 수동으로 호출을 변경할 수있다. <ol><li> 하나 녹는에서곡선 또는 용융 피크 뷰, 곡선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 선택을 제거합니다. 잘못 분류 샘플을 선택한 후, &quot;새 통화&quot;해당 그룹을 선택하고 클릭으로 이동 &quot;변경을 적용합니다.&quot; </li></ol></li></ol></li><li> 정규화 <ol><li> 온도 (-df / DT) ( &#39;차이 곡선&#39;)보기에 대한 정규화 된 형광의 부정적인 유도체에서 지역 용융 프로브를 둘러싸 정상화 막대를 이동합니다. 주 : 프로브 영역이 두 영역의 융점보다 낮은 온도, 용융. 정규화 바는 용융 피크의베이스에 있어야합니다. </li></ol></li><li> 그룹을 계산 <ol><li> 정상화 후 선택 &#39;계산 그룹&#39;가 자동으로 그룹에 샘플을 할당합니다. 필요한 경우, 수동으로 특정 그룹에 샘플을 다시 할당. 참고 : 일부 분석 소프트웨어가 변경 될 수없는 고감도 임계 값을 가지고; 이러한 경우에, Software 시각적으로 다른에 속하는 다른 그룹에 샘플을 할당 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 유전자형 지정 <ol><li> 표준 (양성 대조군)에 따라 각 그룹에 대한 유전자형을 할당합니다. <ol><li> (그 정확한 변경 사항이 잘못 분류 샘플을 선택하고 &quot;새 통화&quot;옆에있는 드롭 박스에서 오른쪽 그룹을 선택하여 그룹화 탭에서 만든되지 않은 경우) 사용자가 계산 된 그룹이 올바른지 확인 후, &quot;편집 그룹 이름을 선택 그룹화 &quot;탭&quot;에서 &quot;. </li><li> 컬러 박스에 대응하는 표준의 유전자형을 시작 (3d7 표준은 공지 된 유전자형을 갖고 적색 그룹에있는 경우, 예를 들면, 붉은 기 유전자형을 갖는다). 를 눌러 &quot;OK&quot;를하고 결과를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 수출 결과 <ol><li> 수출 유전자형 추가 샘플 인구 분석을 위해 스프레드 시트로 호출합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).</li><li>Hayton, K., Su, X. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum.">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li><li>Neafsey, D. 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T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis.">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li><li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia.">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89 (2014).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

지속적인 HRM은 post-PCR 분석 단계; 따라서, 샘플 분석 셋업에서 전환을 추적하는 데 사용되는 형광 삽입 성 염료의 추가 도입으로, 표준 PCR 프로토콜과 유사한 이중 가닥 고해상도 용융 단계에서 단일 - 가닥 DNA에 관한 것이다. 성공적인 HRM 분석을위한 가장 중요한 인자는 강력한 PCR 생성물이다. 분석 설계 핵심이며, HRM 분석 설계에 최적화 된 여러 가지 도구는 상업적으로 온라인 13 사용할 수 있습니다. ~ 20 염기쌍을 동반 80-150 염기쌍의 증폭 길이는 프로브의 영역 내에서의 SNP뿐만 아니라 여러 개의 SNP의 일배 체형을 구분하기 위해 SNP 또는이자 작업 최선의 SNP를 위에 중심 프로브를 차단했습니다. 프로브는 3 &#39;C3의 스페이서 또는 3에서 2 염기쌍 미스 매치&#39;증폭을 방지하는 동안 연장 단부를 사용하여 차단 될 수있다. 프로브 또는 왓슨 크릭 주형 가닥과 일치하도록 설계 될 수있다; 선택허용되는 용융 피크를 생산하는 프로브 디자인을 결정하는 실제 테스트에 따라 달라집니다. 순방향 또는 역방향 프라이머 과량은 차단 프로브 어닐링 본쇄 증폭 산물을 생성하기 위하여 사용된다. 프로브는 순방향 가닥 서열을 포함한다면, 그 후, 프라이머는 과량으로 사용되는 역방향 통상 1 : 5 비율 및 역방향 가닥 일치 프로브 반대로. 마찬가지로, HRM은 충분하고 강력한 PCR 제품과 가장 잘 작동합니다. PCR 반응 최적화는 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 구배 PCR 및 아가 로스 겔 또는 Bioanalyzer 분석을 요구한다. 주형 농도는 이러한 사전 증폭, 주형 (13)의 농도를 증가시키기 위해 낮은 프라이머 농도와 순환 수를 사용하는 모든 대상 바이어스 다중화 증폭 등의 방법을 사용하여 증가 될 수있다. 악기의 소수에 불과 MAAB와 호환됩니다. 유리 모세관 튜브의 열 특성 내가 사용N이 시스템은이 방법을 용이하게한다. 모세관의 작은 내부 직경뿐만 아니라 유리를 통해 신속한 열전달 플라스틱의 단열 특성에 기인 어닐링 변성 사이클 사이의 느린 변화 속도를 갖는 표준 PCR의 plasticware,보다 엄격한 온도 제어를 제공한다. 이 방법의 검출 감도는 야생형 및 돌연변이 체 대립 유전자 (10)의 혼합물에 돌연변이 대립 유전자의 1 % 미만 2-5% 감소 될 수있다. 인사는 암 유전자 변이에 대한 검사에 전염병 감시의 설정과 수많은 다양한 애플리케이션에서의 SNP 유전자형을위한, 손쉬운 효율적이며 경제적 인 도구입니다. 이러한 나노 로슈의 LightCycler 및 시스템 (480, 96)뿐만 아니라, 표준 증폭, 실시간, 및 복사 횟수 기능에 더하여 에코 실시간 PCR 시스템 제공 HRM 여러 다른 악기. 높은 처리량 기계를 사용하여, HRM의 바코드는 비용 레모든 시약 및 소모품을 포함하여 우리의 손에 분석 당 $ 0.50,보다의. 여기에 기술 된 상황에서, 필드 기반 애플리케이션 저감 인구 다이버 수입 기​​생충 종류의 검출, 감소 된 약물 감수성과 관련된 된 SNP 외관 및 확산을 포함하여 말라리아 관리 노력과 관련된 변화를 실시간 인구 감시를 허용한다. 방법에 대한 상세 검색은 말라리아 제거 및 근절을 향한 진행 상황을 알리기위한 유용한 추가 감도를 제공합니다.

말라리아 제어 및 근절에 대한 새로운 관심에도 불구하고, 말라리아는 거의 감염의 위험에 세계 인구의 절반 매년 550,000 명 이상의 사망자, 사하라 사막 이남의 아프리카 (1) 특히 아이들과 함께, 전 세계적으로 부담이 남아있다. 이러한 새로운 제어 및 박멸 프로그램은 감소 된 약물 감수성과 관련된 돌연변이 염기 서열 분석 말라리아 기생충 다수 증가 병독성과, 게놈 르네상스 지원 및 인구 특성 2,3- 용되었다. 단일 염기 다형성 (SNP가)는 가장 일반적으로 확인 된 유전자 변형 4-7 중입니다. 휴대용 SNP 지노 타이핑 방법은 현장에서 실시간 감시 및 인구 8 추적 제공. 개별 기생충 지문 이외에, &#39;분자 바코드&#39;또한 대립 유전자 빈도에서 극적인 시간적 변화를 검출하기 위해 사용되는뿐만 아니라 분산 효과적인 인구의 크기와 감염 9의 복잡성. 정보의 SNP의이 세트는 쉽게 많은 유전자형 플랫폼에 적응하는 동안, 높은 해상도 (HRM)를 분석에 특히 민감하고 간단한 조작과 낮은 비용으로 새로운 돌연변이 검출 시퀀싱 및 다른 비교 연구를 기반 분야에 매우 적합하다 용융 접근 방식은 자원이 부족한 설정에서 매력적이다. HRM는 형광 염료를 포함하고 표준 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)으로 시작한다. 이후의 PCR 분석은 용융 피크의 amplicon 용융 온도를 결정한다; 짧은 앰플 리콘의 단일 SNP 차이는 실질적인 융해 피크 온도 (Tm)의 차이가 발생할 수있다. 이 방법에 대한 몇 가지 개선은 (현재의 여러 대립 유전자와 샘플 polyg을 작은 돌연변이 대립 유전자를 클래스 IV (AT)의 SNP를 포함하여 SNP를 차별화하고, 감지하는 더 나은 유전자형 해상도를 제공enomic 감염). 먼저, 분석은 전달 및 상이한 농도로 존재 역방향 프라이머 외에 SNP 영역 위에 중심 짧은 프로브를 포함. 이 차단 된 프로브로 인해 프로브 템플릿 제품의 생산을 증가 비대칭 프라이머 농도에 PCR 증폭하는 동안, 그러나 과잉 생산 가닥에 결합되지 않습니다. 초과 템플릿 가닥에 결합 된 프로브로 구성이 분리 된 이중 가닥 증폭은 ~ 20-30 BP 있습니다; 자신은 크게 10 불일치 하나 또는 여러 개의 기본 프로브 템플릿과 관련된 훨씬 더 큰 Tm은 차이에 전체의 증폭 (80-150 BP) 납에 비해 길이를 감소. 둘째, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB)는 바이어스에 polygenomic 감염 낮은 비율에 존재하는 돌연변이 대립 유전자를 향해 반응을 반응 어닐링 온도를 낮춘다. 어닐링 온도는 완벽 매치 (야생형)의 TMS 및 부정합 (돌연변이) 탐침간에 설정된에스. 이 온도에서, 야생형 대립 유전자의 바인딩은 증폭 따라서 모두 단일 샘플 (10)에 존재하는 돌연변이 대립 유전자 증폭을 향해 편향 그 불일치 당량에 비해 방해 충분히 안정적이다. 이러한 인사 관리 개선으로,이 기술은 현재보다 1에서 유행 남미 (11)의 감염과 새로운 돌연변이 검출 순서에서 서로 바로 옆에있는 여러 개의 SNP의 분화, 돌연변이와 관련된 기생충의 기원 추적 및 신원을 허용했다 polygenomic 샘플 (10)의 대립 유전자의 %. 증가 된 감도는 사전 제거 상태 및 약물 내성 신흥 위험이있는 사람들을 접근 지역에서 특히 중요하다. 빠르고 쉽게 구내 감도 저하와 관련된 수입 기​​생충의 SNP를 식별하는 능력이 감시 활동 및 제어 프로그램에 관한 알린다자신의 구현 증가 말라리아 퇴치 및 제거 노력을 식별 핫스팟의 효과. 이 프로토콜은의 방법에 대해 설명 차단 프로브를 기반 MAAB에 대한 증가 인사의 유전자형 감도.

<table><tbody><tr><td>LightScanner Master Mix</td><td>BioFire Defense</td><td>HRLS-ASY-0003</td><td></td></tr><tr><td>Light mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>for BioFire Defense plate-based HRM systems</td></tr><tr><td>TE</td><td>Teknova</td><td>T0226</td><td></td></tr><tr><td>Te</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td>TE buffer with reduced EDTA</td></tr><tr><td>PCR grade water</td><td>Teknova</td><td>W3330</td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum standards</td><td>MR4</td><td>MRA-151, 156, 205, 330</td><td>MR4.org offers free genomic DNA</td></tr><tr><td>Light Scanner Primer Design Software</td><td>BioFire Defense</td><td></td><td>commercial sofware for HRM assay design</td></tr><tr><td>LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix</td><td>Roche</td><td>4909631001</td><td>For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2938A</td><td>Agilent 2100 bioanalyzer</td></tr><tr><td>LightCycler 2.0</td><td>Roche</td><td>3531414001</td><td>Capillary-based system for MAAB</td></tr><tr><td>LightCycler Nano</td><td>Roche</td><td>6407773001</td><td>Strip tube-based HRM and amplification</td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>Strip-tube and plate-based HRM and amplification</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification</td></tr><tr><td>LightScanner-96</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0011</td><td>plate-based HRM (96-well)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LightScanner-384</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0001</td><td>plate-based HRM (96-well)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>96-well plates for HRM (LightCycler</td></tr><tr><td>384-well plates</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td>384-well plates for HRM (LightCycler)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-9665&amp;nbsp;</td><td>96-well plates for HRM (LightScanner)</td></tr><tr><td>384-well plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-3865&amp;nbsp;</td><td>384-well plates for HRM (LightScanner)</td></tr><tr><td>LightCycler 8-Tube Strips (clear)</td><td>Roche</td><td>6327672001</td><td>strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano)</td></tr><tr><td>LightCycler Capillaries (20 &amp;mu;l)</td><td>Roche</td><td>4929292001</td><td>capillaries for HRM</td></tr><tr><td>Optical plate seals</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td>other brands also work</td></tr></tbody></table>

methods to increase the sensitivity of high resolution melting single nucleotide polymorphism genotyping in malaria

박멸의 수십에도 불구하고, 말라리아는 글로벌 부담이 남아있다. 지역 제거 및 글로벌 박멸에 최근 새롭게 관심은 항 말라리아 약물로 감소 감수성과 관련된 지리적 인구의 특성뿐만 아니라 변화를 포함하여 말라리아에 대한 책임 말라리아 기생충 종에 대한 증가 게놈 정보를 수반하고있다. 하나의 일반적인 유전 적 변이, 단일 염기 다형성 (SNP가)는 기생충 유전자형을위한 매력적인 목표를 제공합니다. 이 마커는 약물 내성 마커를 추적뿐만 아니라하지 약물 또는 다른 선택적 압력에서 마커를 사용하여 기생충 인구를 추적뿐만 아니라 유용하다. SNP 지노 타이핑 방법은 약제 내성을 추적 할뿐만 아니라, 특히 eliminat 가까워 영역에서 말라리아 관리 노력에 응답하여, 인구 감시 개별 기생충 지문 할 수있는 능력을 제공한다이온 상태. 정보의 SNP 특정 유전자형 기술에 얽매이다가 발견되었지만, 고해상도 용융 (HRM) 분석에 필드 기반의 연구에 특히 적합하다. 하나의 표지 된 프로브의 개별의 SNP를 필요 복수 게놈 (polygenomic)가 포함되어 샘플의 SNP를 검출하기 위해 기껏​​해야 10 %의 민감도를 제공하는 표준 형광 프로브 기반 방법에 비해, HRM 2-5 %의 감도를 제공한다. 이러한 차단 프로브 및 비대칭 프라이머 농도뿐만 아니라 사소한 대립 유전자의 증폭으로 바이어스 PCR로 증폭 어닐링 온도의 최적화 등의 인사에 대한 수정은 더 HRM의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 감도 향상 특정 분석에 의존하지만, 우리는 마이너 대립 유전자의 1 % 미만으로 검출 감도를 증가했다. 말라리아 박멸에 접근 지역에서 신흥 또는 수입 약제 내성의 조기 발견 홍보에 필수적이다ompt 응답. 마찬가지로 polygenomic 감염을 감지하고 애매한 로컬 저장소에서 가져온 기생충 유형을 구별하는 능력은 제어 프로그램을 알릴 수있다. 이 원고는 또한 환자 샘플에서 polygenomic 감염을 확인하기 위해 감도를 증가 고해상도 용융 기술에 대한 수정 사항을 설명합니다.

데이터 분석 소프트웨어 및 장비에 따라 여러 가지 방법으로 시각화 될 수있다. 전형적으로, 온도 결과에 대해 온도 (-df / DT)에 대해 정규화 된 형광 마이너스 유도체의 플롯은 용융 피크를 가시화하고 유전자형을 결정하는 가장 간단하다. 전체 용융 창 (40 ° C-80 ° C). 양쪽 앰플 리콘과 용융 프로브 영역 초래 한 두 영역에 대한 정규화 용융 피크의 일 예를 나타낸다 것이다. 특정 SNP에 대응 피크의 명확한 분화 단지 프로브 영역 결과 분석 윈도우를 설정 (도 2). 프로브 기반의 분석은 명확하게 동형 접합 SNP 피크 (그림 3)과 일치 용융 온도와 각 피크로 두 대립 유전자의 존재를 보여줍니다. 그림 4는 progressi를 보여줍니다vely 혼합 대립 유전자 (도 4b)의 집단에서 돌연변이 대립 유전자에 대한 감도 증가의 결과로, 돌연변이 체 대립 유전자 (좌측 피크) (도 4a)을 향해 바이어스 증폭 (MAAB) 결과 중 어닐링 온도를 감소시킨다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" /> 분석 될 수있는 두 프로브 (저온)에서 넓은 용융 결과 창을 통해 온도에 대해 정규화 된 형광의 음 도함수 플롯도 1 프로브 및 앰플 리콘 용융 영역. 앰플 리콘과 용융 피크. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> SNP 불일치 (회색) 낮은 용융 온도를하면서 그림 2. 프로브 용융 피크. 완벽한 일치 (일반적으로 야생 형 대립 유전자가), 높은 용융 피크 (적색) 결과. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" /> 두 대립 유전자는 샘플에 존재하는 경우, 피크 녹는 그림 3. Polygenomic은., 프로브 기반 HRM 분석은 단일 대립 유전자 샘플 (빨간색과 회색)과 일치 봉우리와 두 개의 피크 곡선 (오렌지)와 같은 두 대립 유전자를 나타냅니다. (. 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">큰 V를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 ersion. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" /> 그림 4. 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 (MAAB). A. 점진적으로 피크 polygenomic 또는 polyallelic 샘플에서 돌연변이 (저온) 대립 유전자에 대응하는 방향으로 융해 피크 반응이 증폭 어닐링 온도를 낮추는 편향. B. MAAB는 polygenomic 또는 polyallelic 시료에서 1 % 미만으로 존재 마이너 대립 유전자를 검출하기 위해 HRM 민감성을 초래한다. (. 파트 B는 다니엘스 등 DOI에서 적응 : 10.1128 / AAC.05737-11) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 프로브 기반의 고해상도 녹는 증폭 반응의 표 1 세트입니다. <table><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 다시 당 볼륨행동 (96 웰 플레이트 및 모세관) </td><td> 반응 당 볼륨 (384 웰 플레이트) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> HRM 마스터 믹스 </td><td> 4-5 μL </td><td> 2-2.5 μL </td><td> 1 개 </td></tr><tr><td> 10 × 초과 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.50 μM </td></tr><tr><td> 10 × 다른 프라이머 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5μl </td><td> 0.1 μM </td></tr><tr><td> 10 배 프로브 </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.40 μM </td></tr><tr><td> PCR 등급 물 </td><td> 1-2 μL </td><td> 0.5 μL </td><td></td></tr><tr><td> 템플릿 DNA </td><td> 1 μL </td><td> 0.5 μL </td><td> 0.01 NG / μL </td></tr><tr><td></td><td> 10 μL </td><td> 5 μL </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. STANDARD 고해상도 녹는 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td></tr><tr><td> 보류 </td><td> 95 ° C </td><td> 120 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 45주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 68 ° C를 * </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 28 ° C </td><td> 30 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존 표 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 3. 증폭 조건. <table><tbody><tr><td> 온도 </td><td> 시간 </td><td> 사이클 </td><td> 램프 속도 </td><td> 획득 모드 </td><td> 분석 모드 </td></tr><tr><td> 변성하다 </td><td> 95 ° C </td><td> 30 초 </td><td> 1 </td><td> (20) </td><td> 없음 </TD&gt; <td> 없음 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 주기 </td><td> 95 ° C </td><td> 2 초 </td><td rowspan="2"> (55) </td><td> (20) </td><td> 없음 </td><td rowspan="2"> 부량 </td></tr><tr><td> 56 ° C를 * </td><td> 15 초 </td><td> (20) </td><td> 단일 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 용해 </td><td> 40 ° C </td><td> 0 초 </td><td rowspan="3"></td><td rowspan="3"> 0.3 </td><td> 없음 </td><td> 없음 </td></tr><tr><td> 45 °의 C * </td><td> 0 초 </td><td rowspan="2"> 지속적인 </td><td rowspan="2"> 용해 </td></tr><tr><td> 90 °의 C * </td><td> 0 초 </td></tr></tbody></table> *이 온도의 증폭에 의존하고 MAAB을 수행 할 때 감소 될 것이다

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Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다.

방법은 말라리아에 단일 염기 다형성 유전자형 녹는 고해상도의 감도를 증가

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K 조회수.  Harvard University.  고해상도 융점 분석은 이종 집단에서 단일 염기 다형성을 구별 할 수있는 능력을 제공하지만, 돌연변이 대립 유전자 증폭 바이어스 샘플 내의 비교적 낮은 비율로 존재 대립 유전자를 검출하는 능력을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜은 고해상도 융점 분석의 감도를 향상 개선을 설명한다. 

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High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but especially on red blood cells (RBCs). As a receptor for the complement components C3b and C4b, CR1 regulates the activation of the complement cascade and promotes the phagocytosis of immune complexes and cellular debris, as well as the amyloid-beta (A&#946;) peptide in Alzheimer's disease (AD). Several studies have confirmed AD-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as a copy-number variation (CNV) in the CR1 gene. Here, we describe an innovative method for determining the length polymorphism of the CR1 receptor. The receptor includes three domains, called long homologous repeats (LHR)-LHR-A, LHR-C, and LHR-D-and an n domain, LHR-B, where n is an integer between 0 and 3. Using a single pair of specific primers, the genetic material is used to amplify a first fragment of the LHR-B domain (the variant amplicon B) and a second fragment of the LHR-C domain (the invariant amplicon). The variant amplicon B and the invariant amplicon display differences at five nucleotides outside of the hybridization areas of said primers. The numbers of variant amplicons B and of invariant amplicons is deduced using a quantitative tool (high-resolution melting (HRM) curves), and the ratio of the variant amplicon B to the invariant amplicon differs according to the CR1 length polymorphism. This method provides several advantages over the canonical phenotype method, as it does not require fresh material and is cheaper, faster, and therefore applicable to larger populations. Thus, the use of this method should be helpful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of diseases such as AD.

Here, we describe an innovative method to determine complement receptor 1 (CR1) length polymorphisms for use in several applications, particularly the assessment of susceptibility to diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD). This method could be useful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of AD.

보체 수용체 1 길이 다형성 유전자 타이핑을위한 고해상도 Melting PCR : 알츠하이머 병 유전자 감수성 평가를위한 혁신적인 도구

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

연구

유전학

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

면역학 및 감염병학

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases (TALENs), zinc-finger nucleases (ZFNs), and homing endonucleases (HEs). More recently, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) technology has offered an easier and cheaper alternative for precision genome engineering. Following nuclease action, DNA repair pathways will fix the broken DNA ends, often introducing indels. These out-of-frame mutations are then used for understanding gene function in the target organisms. A drawback, however, is that mutant individuals carry no dominant marker, making identification and tracking of mutant alleles challenging, especially at scales needed for many experiments. 
High-resolution melt analysis (HRMA) is a simple method to identify variations in nucleic acid sequences and utilizes PCR melting curves to detect such variations. This post-PCR analysis method uses fluorescent double-stranded DNA-binding dyes with instrumentation that has temperature ramp control data capture capability and is easily scaled to 96-well plate formats. Described here is a simple workflow using HRMA for the rapid detection of CRISPR/Cas9-induced indels and the establishment of mutant lines in the mosquito Ae. aegypti. Critically, all steps can be performed with a small amount of leg tissue and do not require sacrificing the organism, allowing genetic crosses or phenotyping assays to be performed after genotyping.

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

This article details a protocol for rapid identification of indels induced by CRISPR/Cas9 and selection of mutant lines in the mosquito Aedes aegypti using high-resolution melt analysis.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

생물학

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms has increased in recent years due to the recently developed ability to produce models by mtDNA mutagenesis and a new appreciation of the association between mitochondrial genetic aberrations and common age-related diseases such as cancer, diabetes, and dementia. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis technique that is widely employed across the mitochondrial field for routine genotyping experiments. Its relative affordability when compared to massive parallel sequencing methods and ease of implementation make it an invaluable technique in the field of mitochondrial genetics, allowing for the rapid quantification of heteroplasmy with increased flexibility. Despite the practicality of this method, its implementation as a means of mtDNA genotyping requires the observation of certain guidelines, specifically to avoid certain biases of biological or technical origin. This protocol outlines the necessary steps and precautions in designing and implementing pyrosequencing assays for use in the context of heteroplasmy measurement.

Pyrosequencing assays enable the robust and rapid genotyping of mitochondrial DNA single nucleotide polymorphisms in heteroplasmic cells or tissues.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

의학

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Gradient Polymerase Chain Reaction to Determine the Optimum Annealing Temperature

Source: Tsujimoto, H. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63008">Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the gradient polymerase chain reaction for optimization of the annealing temperature of primers, which sets gradient annealing temperature along wells. The effect of different annealing temperatures is determined by the yield of amplified products that helps to optimize the reaction condition.

최적의 어닐링 온도를 결정하기 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응

Source: Tsujimoto, H. et al., Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. ...