우리는 영상 검사에 대한 도움말 박사 윌리엄 Cashdollar, 위스콘신의 혈액 연구소의 노스 웨스턴 뮤추얼 재단 이미징 센터 감사합니다. 우리는 또한이 원고과 도움이 토론의 중요한 읽기 박사 다리아 Ilatovskaya 감사합니다. 이 연구는 (AS에) 건강 보조금 HL108880의 국립 연구소 및 (AMG에) DP2-OD008396에 의해 지원되었다.

아래에서 설명하는 실험 절차는 위스콘신 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라했다되었다. 쥐 대동맥 1. 분리 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지 보수) 또는 다른 IACUC로 쥐를 마취는 방법을 승인했다. </li><li> 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 복부 장기를 노출하기 위하여, 피부와 피하 조직을 통하여 복부 작은 복부 정중선을 절개. 도 1에 도시 된 바와 같이 사용 거즈 패드는 부드럽게 대동맥과 대정맥을 노출 창자 편향. </li><li> 간단히, 결합 조직에서와 대정맥에서 대동맥을 해부 무딘. 신장에 가능한 한 가까운 대동맥을 묶는, 봉합사를 사용하여. 대동맥 2cm과 15 ML 원뿔 TU에 배치 - 1을 해부하다정상적인 생리 소금 솔루션 포함 할 (PSS를, mM의에 : (140)의 NaCl, 1.2의 MgCl 2, 2 염화칼슘 2, 4.5 KCl을, 6 포도당, 10 HEPES) 얼음에. </li><li> 대동맥 단리되면, 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사. 모든 비 생존 완료시 절차는 동물의 인간 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. (3) </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 집게를 뾰족한 및 microscissors은 대동맥 떨어져 지방과 결합 조직을 해부하다. 대동맥이 깨끗하면, 길이 방향으로 대동맥을 절단하고 나중에 얼음에 PSS에 넣습니다. </li></ol> 2. 염료로드 및 배양 <ol><li> 피펫 알루미늄 호일로 피복 된 각각의 500 μL를 튜브에, DMSO 기반 솔루션에 공급된다 1mM의 FLUO-4 오전 염료, 7 μL. 시간이 지남에 따라 염료의 특성을 유지하기 위해 -20 ℃에서 냉동실에 보관합니다. 참고 :이 너무 분주lutions은 6 개월 이상 안정해야한다. </li><li> 사용하기 전에 염료 솔루션을 열기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. 바로 사용하기 전에 작업 솔루션을 준비합니다. 나중에 사용하기 위해 희석 시약을 보관하지 마십시오. </li><li> 더 칼슘을 포함하지 않는 PSS 450 UL에 DMSO 용액에 용해 기성품 1 mM의 FLUO-4 오전 염료의 7 μl를 추가합니다. 아세 (AM) 에스테르를 분산 도와 칼슘 염료 로딩을 향상시키기 위해 로딩 칵테일 비 기반 DMSO 10 % 플루 믹산 용액 40 μL를 추가한다. </li><li> 1 시간 동안 (2.3에서 설명)로드 칵테일이 포함 된 500 μL 튜브로 해부 대동맥를 놓습니다. 실온에서 회전하는 통에 호일과 장소 모든 튜브를 커버. </li><li> 혈관에서 NO 생성을 모니터링하지 않으려면, DAF-FM 디 아세테이트 염료를 사용합니다. 450 μL의 PSS 40 μL 플루 오닉 산 및 10 mM의 DAF-FM 디 아세테이트 5 μl를 함유하는 용액에서 대동맥 부화. (2.3에서 설명) 칼슘 배양 프로토콜과 유사하게, 배치 대동맥RT에서 30 분 다음이어서 4 ℃에서 30 분 동안 회전 진탕 기에서 호 및 장소에 덮여 NO-염료 용액을 함유하는 500 μL 튜브. </li><li> NO 생산이 측정되지 않을 때,도 4b에 도시 된 바와 같이, 대조군으로 NO 생산을 차단하지 위해, 내피 NO 합성 효소 억제제, L-NAME을 사용하지 않는다. 그 절차는 (실온에서) 배양의 마지막 30 분 동안 (2.5에서 설명) 칵테일 100 나노 미터 L-NAME에 추가​​ 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 레이저 스캐닝 두 광자 현미경 프로토콜 <ol><li> 세포 외 염료를 제거하기 위해 깨끗한 PSS 3 번 - 1 시간 배양 후, 대동맥 2 씻는다. </li><li> 정상 PSS 또는 칼슘 - 무료 버퍼 (실험 프로토콜에 따라 다름)를 포함하는 실리콘 코팅 접시에 대동맥을 전송합니다. 실리콘과 접촉 외막 내려 실리콘 코팅 상 대동맥 핀 (즉, 접시 개구에 노출 된 내피 루멘) μ 형상 핀을 사용. 다르게는, 조각 앵커를 사용그리드 또는 접착제 조직을 해결하기 위해. 참고 : 스트레스와 기계적인 유물, 전송을 줄이고 캘리포니아 2+ - 무료 솔루션을 대동맥를 수정하고 5 기다릴 - 실험을 시작하기 전에 10 분. </li><li> 연동 펌프 또는 약물의 자동 또는 수동 응용 프로그램 또는 세포 외 솔루션을 변경하기위한 실리콘 코팅 된 플레이트에 주사기를 연결합니다. </li><li> 수직 두 광자 현미경의 노즈 피스 아래에 접시를 놓고 설치하고 시료 위의 25 × (NA 1.05 및 작동 거리 2mm) 물에 침수 대물 렌즈의 위치. 참고 :이 특정 렌즈를 사용할 수없는 경우는 일반 목적에 비해 극적으로 신호의 해상도를 증가시킬 수 있기 때문에, 특히 두 개의 광자 이미징 제조 목적을 사용합니다. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 두 개의 광자 레이저를 활성화 (레이저는 펌프에 설정하기 시작합니다). 튠 820 nm의 레이저 여기. </li><li> 표면 형광을 사용하여 대동맥을 찾아에 대물 초점거친 조정을 사용하여 내피 세포의 표면. </li><li> 여기 레이저가 모드 잠금, 비 descanned 감지기가 결합되고, 예상되는 방출 스펙트럼에 적합한 배출 필터가 설치되는 것을 보장하는, 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경 모드로 전환. 참고 : 여기에, FV10-MRL / R (495 nm의 540)을 사용 하였다. </li><li> 약 5 %의 레이저 파워를 이용하여 실시간 스캐닝을 시작하고 미세 혈관 내피 세포를 시각화하기 위해 대물 초점. 주 : PSS 정상 배양 때 내피 세포 강한 형광 신호를 나타낼 것이다. 혈관이 칼슘 무료 버퍼에 배양 할 때이 눈에 띄게 약화 될 것이다. 내피 세포는 열린 대동맥의 상부 및 평활근 세포는 단지 내피 세포 (도 2 참조) 아래에서 볼 수있을 것이다. 혈관이나 매끄러운에도, 평활근 세포 및 내피 세포가 모두 존재하는 곳에있을 것이다도 때문이다. &lt;/ 리&gt; <li> 셀에 포커스가되면 현미경 소프트웨어 프로그램은 고속 스캔 모드에서 순차적 이미지 (래스터 스캔, 1.1 초의 프레임 컬렉션 주파수 512 X 512 픽셀의 윈도우)를 수집한다. FLUO-4 오전 형광과 병행하여, 혈관 수축의 변화를 감지하고 더 나은 실험 조건을 시각화하기 위해 빛의 이미지를 전달 수집합니다. </li><li> 기준 신호 이미지를 수집 한 후, 외부 용액에 칼슘 이온 농도를 변경하거나 천천히 연동 펌프 이미징 동안을 이용하여 약리 자극 에이전트를 적용합니다. 로드 된 세포 내 형광 신호 증가를 관찰한다. 참고 : 내피 세포는 흐름의 변화에 따라서는 칼슘 또는 NO 신호의 약리 활성제의 응용 프로그램을하기 전에 낮은 층류 응용 프로그램 및 차량 테스트를 사용하는 것이 좋습니다 반응한다. FLUO-4 (I FLUO-4에 대한 해리 상수 로케이션 혈관 nM의 농도 값에 세포 내 칼슘 재 계산S 345 ㎚), 형광 강도는 기준선 및 이오 노마 이신과 MnCl 2 첨가 한 후 기록 될 수있다. (4) </li></ol> 4. 이미지 처리 및 계산 <ol><li> 다운로드 및 피지를 이미지 처리 패키지를 설치합니다. </li><li> 피지에서 이미지 파일을 엽니 다. 메시지가 표시되면 파일을 가져 오기하면, 채널 (투과광 및 형광 신호)를 분할합니다. 데이터 분석에만 형광 신호를 사용한다. </li><li> 피지 프로그램 내에서 분석 탭을 클릭하고 도구 옵션을 아래로 스크롤합니다. 도구 옵션에서 투자 수익 (ROI) 관리자를 말한다 탭을 찾아서 클릭; 새 창이 나타납니다. </li><li> 이 후, 분석 탭에서 설정 한 측정을 클릭합니다. 관심의 특정 측정을 선택합니다. 칼슘 과도 측정을 위해 평균 회색 값 옵션을 사용합니다. </li><li> 원형 추적 도구를, 관심 영역 (ROI)을 추적하고 모든 연구에 대한 투자 수익 (ROI) 관리자 화면에서 &quot;추가&quot;를 클릭하기 시작OI. 일단 관심의 모든 세포는 투자 수익 (ROI) 관리자 창에서 &quot;추가&quot;탭에서 다중 측정을 선택, 추적하고있다. 스프레드 시트로 이러한 측정을 모두 직접 측정 값을 저장하거나 복사 및 붙여 넣기하는 중 기억하십시오. </li><li> 열기 * .txt 인 파일이나 Excel 스프레드 시트 피지에서 새 원본 워크 시트에 숫자를 전송합니다. 참고 : 또한, 추가 분석을 위해 시그마 플롯 또는 프리즘과 같은 어떤 프로그램을 사용합니다. </li><li> 원산지 프로그램 내에서 모든 과도 응답의 개요를 관찰 할 줄 + 기호 메뉴 → 플롯을 사용합니다. 응답하지 않는 세포의 선택을 취소합니다. </li><li> 시간 척도 (X 축)에 대한 추적 번호를 다시 계산, 열 → 설정 열 값을 사용하고 (우리의 경우 1.1s에서) 이미지 모음 주파수로 추적 번호 열을 곱합니다. </li><li> 평균 (Y 축) 및 표준 오류 추적을 계산하기 위해 선택한 모든 레코딩을위한 행에 분석 → 통계를 사용합니다. 세포의 현재 그룹이 라인 + 기호 → 플롯에 대한 최종 그래프를 플롯. </li><li> MEA다음으로 N 칼슘 과도 계산이 설명되어 있습니다. <ol><li> 원산지 프로그램 내 총 칼슘 릴리스, 다음, 그래프를 클릭 메뉴 분석 → 미적분을 사용 → 통합 할 수 있습니다. 곡선 아래 영역의 총 적분 결과 로그에 나타납니다. </li><li> (X 축이 과도 응답 끝으로 최대 범위 선택) 분석 → 비선형 커브 피팅 → 선택 데이터 세트 : 과도 반응 속도를 들어, 그래프를 클릭 한 다음 메뉴를 사용합니다. 완료 → 지수 감쇄 1 → 기능 선택 → 피팅 시작합니다. 지수 피팅 그래프 창에 표시 및 로그 결과 :합니다. 획득 한 데이터 (값)는 칼슘의 방출 총량을 나타내고, 채널의 동력학은 과도 응답을 매개. </li></ol></li></ol>

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실험 개요. 더 나은 혈관 생리학에 아무 칼슘의 기여를 이해하고, 새로운 방법은 측정하기 위해 개발되었다 [칼슘 2 +] 나는 더 부드러운 근육과 고립 그대로 대동맥의 혈관 내피 세포 내에서. 1) 기계적 분리 및 준비 (효소되지 소화) 선박의 : 함께,이 프로토콜은 이러한 중요한 단계로 구성되어 있습니다. 이는 최적의 생리 녹음을 얻을 수만큼 건강한 조직을 그대로 유지하는...

칼슘은 내피 및 평활근 세포, 혈관 등의 세포 내 메신저 근본적인 초이다. 이 혈관 수축 주 자극이고 내피 내의 NO 생성을 통해 그 효과를 포함하여, 혈관 확장술에서 중요한 역할을한다. 인해 영상 기술의 한계, 그것을 그대로 용기 내 칼슘 처리를 거의 관찰 할 수 없었다. 두 광자 이미징 시스템과 새로운 칼슘의 생성 또는 NO 표지 염료의 개발은, 칼슘 역학과 혈관 내의 NO 생성을 이해하기 시작하기에 충분한 깊이 해상도 이미지를 가능하게한다. 이광자 현미경 최근 조직, 기관 때문에 깊이 낮은 배경 형광 및 높은 신호 감도와 조직을 관통하는 뛰어난 능력에도 전체 동물 실험에 적용되어왔다. 1,2- 보조광 두 광자 여기의 좁은 스펙트럼이온 초점 비 descanned 검출기의 사용은 두 개의 광자 공 초점 현미경은 전통적인 현미경 우수 이유이다. 공 초점 현미경에 의한 자동 형광 공 촛점 핀홀에 포커스 아웃 광의 산란에 필요한 조직 깊이에 고품질 이미지를 생성 할 수 없다. 따라서, 우리는 [Ca를 2+] i가 시그널링 측정하는 이광자 현미경을 사용하는 방법 및 높은 해상도와 낮은 신호 - 대 - 잡음비와 그대로 개별 혈관 세포에서 NO 생산을 개발 하였다.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>Olympus upright microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&amp;nbsp;</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Ti:sapphire laser 690nm &amp;mdash; 1040nm</td></tr><tr><td>Filters</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRL/R&amp;nbsp;</td><td>495 to 540 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25&amp;times; water-immersion objective lens</td><td>Olympus</td><td>XLPL25XWMP</td><td>N.A. 1.05 and working distance 2 mm</td></tr><tr><td>Slice Anchor grid&amp;nbsp;</td><td>Warner Instrument&amp;nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>Other basic reagents&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of intracellular ca2+ handling and nitric oxide production in endothelial and smooth muscle cells of an isolated rat aorta

칼슘은 혈관 조직에서 많은 생리적 과정의 중요한 레귤레이터이다. 대부분의 내피 세포와 평활근 기능이 높은 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 및 산화 질소 (NO)의 변화에 따라 달라집니다. 위해 두 광자 현미경 염료 [칼슘 2 +] 난, NO 및 다운 스트림 분자가 혈관 수 축제와 혈관 확장제에 대한 응답으로 혈관에 의해 처리됩니다, 우리는 칼슘 라벨을 적용하는 새로운 기술 (또는 라벨링)을 개발하는 방법을 이해하기 절연 혈관 칼슘 처리 (또는 NO 생산)을 측정 하였다. 여기에 설명 된 쥐, 라벨 칼슘 또는 NO 내피 세포 나 평활근 세포 내에서 대동맥을 분리, 이미지 칼슘 과도 (또는 생산) 생리적 다음 두 광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다 자세한 단계별 절차 또는 약물 학적 자극. 상기 방법을 사용하는 이점은 다중 겹 : 1)이 동시에 가능하다LY는 내피 세포와 다른 자극에 응답하여 평활근 세포 모두에서 칼슘 과도를 측정; 2) 화상 내피 세포와 그 나라의 설정에서 평활근 세포에 하나 허용; 3)이 방법은 세포 내 칼슘 또는 변경 및 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성에 매우 민감; 4) 기재 방법은 활성 산소와 같은 다른 분자의 측정에 적용 할 수있다. 요약하면, 두 개의 광자 레이저 발광 현미경의 적용은 칼슘 과도 및 절연 혈관 내피 세포 및 평활근 세포에서 NO 생산 고품질 정량적 데이터를 제공 및 혈관 기능을 조절 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고있다을 모니터링한다.

생리 정확하게 혈관 (혈관 확장 및 혈관 수축) 칼슘의 기여도를 평가하기 위해, 프로토콜은 내피 세포 및 절연 그대로 대동맥 평활근 세포에 모두 칼슘 염료를로드하기 위해 설계되었다. 그림 1에 묘사 된 설정 일반적인 실험은 고립과 이미징 전에 용기의 제조를위한 기본 전략을 보여줍니다. 간략하게, 래트 대동맥의 분리 후, 지방 및 결합 조직의 세정되어야하며, 길이 ?...

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Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

11.2K 조회수.  Medical College of Wisconsin. Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta. 

비디오: Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

연구

의학

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

생물학

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Standardized Rat Coronary Ring Preparation and Real-Time Recording of Dynamic Tension Changes Along Vessel Diameter

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris, which seriously threaten the life and health of people all over the world. However, how to record the dynamic biomechanical characteristics of isolated blood vessels has long puzzled people. Meanwhile, precise positioning and isolation of coronary arteries to measure in vitro dynamic vascular tension changes have become a trend in CAD drug development. The present protocol describes the macroscopic identification and microscopic separation of rat coronary arteries. The contraction and dilation function of the coronary artery ring along the vessel diameter was monitored using the established multi myograph system. The standardized and programmed protocols of coronary ring tension measurement, from sampling to data acquisition, tremendously improve the repeatability of the experimental data, which ensures the authenticity of vascular tension records after physiological, pathological, and drug intervention.

The present protocol describes the wire myograph technique for measuring vascular reactivity of the rat coronary artery.

표준화 된 쥐 관상 동맥 링 준비 및 용기 직경에 따른 동적 장력 변화의 실시간 기록

As a key event of cardiovascular system diseases, coronary artery disease (CAD) has been widely regarded as the main culprit of atherosclerosis, ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in laboratory animals and small arteries isolated from human tissue. The technique allows researchers to maintain isolated blood vessels in a tightly controlled and standardized (near-physiological) setting, with the option of adjusting to various environmental factors, while challenging the isolated vessels with different pharmacological agents that can induce vasoconstriction or vasodilation. The myograph chamber also provides a platform to measure vascular reactivity in response to various hormones, inhibitors, and agonists that may impact the function of smooth muscle and endothelial layers separately or simultaneously. The blood vessel wall is a complex structure consisting of three different layers: the intima (endothelial layer), media (smooth muscle and elastin fibers), and adventitia (collagen and other connective tissue). To gain a clear understanding of the functional properties of each layer, it is critical to have access to an experimental platform and system that would allow for a combinational approach to study all three layers simultaneously. Such an approach demands access to a semi-physiological condition that would mimic the in vivo environment in an ex vivo setting. Small volume chamber tensometric myography has provided an ideal environment to evaluate the impact of environmental cues, experimental variables, or pharmacological agonists and antagonists on vascular properties. For many years, scientists have used the tensometric myograph technique to measure endothelial function and smooth muscle contractility in response to different agents. In this report, a small volume chamber tensometric myograph system is used to measure endothelial function in the isolated mouse aorta. This report focuses on how small volume chamber tensometric myography can be used to evaluate the functional integrity of the endothelium in small segments of a large artery such as the thoracic aorta.

The present protocol describes the concepts and technical application of the tensometric myograph technique using a multi-chamber myograph system in the experimental ex vivo assessment of mouse aortic endothelial function.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징

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