This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

참고 : 장골에서 인간의 골수 흡인는 루체른의 광저우의 윤리위원회의 승인을 기증자를 동의에서 수집되었다. 장골에서 송곳니 골수 흡 인물은 (약. 20 ㎖) 개 오너 consent.Human으로 수집 하였다 송곳니 (약. 10 ㎖) 골수 흡인했다 항 응고 즉시 철수 후 3.8 %의 구연산 나트륨 15ml를 첨가하여 조작 극장에서. 샘플로서 인출 당일 처리 실험실 환경에 옮겼다. 유로키나제 1. 준비 (이전에 1 차 사용에) <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 재구성 유로키나제 : 10 ㎖ 주사기를 사용하여 격막-입구 플라스크에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 1 mL 당 50,000 사출 유닛 (U)을 얻었다 소용돌이에 의해 건조 물질을 녹이고. </li><li> 의에 500 ㎕를 분주 (25,000 U 각)를 준비terile 튜브. 스토어 씩 -20 ° C 및 6 개월 이상 필요할 때 사용. </li></ol> 2. 제조 단계 (이전에 모든 골수 치료에) <ol><li> 유로키나제 중 하나 나누어지는 응고 골수 흡인 당 (25,000 U)를 (25 ml의에 흡인 볼륨이 성공적으로 25,000 U의 단일 나누어지는을 사용하여 처리 된) 해동. </li><li> 37 ° C의 물 목욕이나 진탕 배양기를 예열한다. </li></ol> 응고 3. 효소 다이제스트 <ol><li> 처리 중 골수 샘플의 미생물 오염을 방지하기 위해 층류 바이오 안전성 캐비닛의 모든 작업을 수행합니다. 감염 가능성이 인간의 물질로 작업 할 때, 보호 장갑뿐만 아니라 취급에주의의 사용을 권장합니다. </li><li> 멸균 50 ML 튜브의 상단에 100 μm의 셀 스트레이너를 놓습니다. 조심스럽게 스트레이너를 기울 또는 응고 물질 주위를 이동, 셀 스트레이너를 통해 골수 흡인 액을 붓는다. 대한 멸균 피펫 팁을 사용하여필터 망을 통해 더 나은 흐름. 참고 : PBS와 혈전을 세척하여, 예를 들면, 혈전의 희석을 피하십시오. 유로 키나아제는 간접적으로 작용하고 혈청의 구성 요소 (예 :., 플라스 미노 겐) 효과 다이제스트에 대한 생검이 필요합니다. 응고 물질과 절차를 계속하면서, 여액을 단계 3.6에 더 사용할 때까지 실온에서 유지 될 수있다. </li><li> 무균 핀셋을 사용하여 빈 세포 배양 접시에 골수 응고 재료를 전송합니다. 약 2mm 3 멸균 메스를 사용하여 작은 조각으로 파편을 잘라. </li><li> 무균 핀셋을 사용하여 50 ㎖ 반응 관에 혈병의 작은 조각을 전송. 다진 응고 젖은 모습을 가지고 있는지 확인하십시오. 이 마른 것 같으면, 축축 3.1 단계에서 여과 액의 일부를 사용합니다. </li><li> 로 pipetting 아래 5 ml의 마이크로 타이 피펫을 사용하여 5 회에 의해 혈전을 씹다. 샘플 유로키나제의 1 나누어지는을 추가합니다. 37 ° C에서 어느 수욕 또는 30 분 동안 인큐베이션진탕 (부드럽게) 인큐베이터. </li><li> 로 pipetting 아래 5 ML의 피펫을 사용하여 5 회에 의해 씹다. 바이오 안전성 캐비닛이 단계를 수행합니다. 37 ° C에서 또 다른 30 ​​분 동안 품어. 배양 후, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 다시 5 회 연화. 단계 3.2에서 여과와 풀에 신선한 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. </li><li> 원심 분리기 (500)의 X g에서 10 분 동안 주위 온도에서 세포 현탁액. 상층 액을 제거한다. 설명 또는 MSC 확장 문화에 대한 실험실의 표준 절차에 따라 같은 매체에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li></ol> 확장 세포 배양 및 CFU 플레이트 4. 시드 <ol><li> 알파 MEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2.5 ㎎ / ㎖의 암포 테리 신 B로 보충 : 기초 배지 50 ㎖ 중의 (적혈구 및 단핵 세포로 구성됨) 세포를 재현 탁 . 세포에게 노이 바 우어 chambe를 사용하여 트리 판 블루 용액 희석 1:10 카운트R. </li><li> 5 × 107 세포 / ㎠의 밀도로 세포 배양 플라스크에서 세포를 플레이트 및 37 ° C에서 가습 배양기에서 배양한다. 가능하면, 저산소 (5 % 산소) 조건을 사용합니다. CFU 분석 제어시 10cm 직경의 세포 배양 접시에 세포를 10 9 접시. </li><li> 다른 세포 현탁액에 남아있는 동안 배양 3 일 후, 중간 엽 줄기 세포는 세포 배양 접시에 부착된다. 5 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)이 보충 된 기본 배지로 미디어를 변경한다. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 세포 배양 접시를 치료. </li><li> 미디어 일주일에 세 번 교환, 이주의 총 세포 배양을 계속합니다. 세포가 80 % 컨 플루 언시를 초과하면, 트립신 처리에 의해 분리. CFU 분석 제어를 위해, 마찬가지로 미디어를 교환하지만, 2 주 코스의 세포를 분할하지 않는다. </li></ol> CFU 분석 5. 김사 얼룩 <ol><li> 접시 당 김사-용액 10 ml의 준비 : DIL을UTE 원액 (글리세롤 7.6 g / L 김사 : 메탄올) 1시 10분 멸균 물 (항상 신선한 작업 희석을 준비). </li><li> 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 씻어. 페트리 접시에 액체를 적용 할 때 매우 precautious하고 세포를 세척을하지 마십시오. </li><li> RT에서 5 분 동안 순수한 메탄올에 세포를 고정. 메탄올을 폐기하십시오. 김사-솔루션을 추가하고 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 60 분 동안 품어. </li><li> PBS로 2 회 세척 할 것. 공기는 종이 타월에 먼저 판 머리를 건조. 수동으로 식민지를 계산합니다. 이것은 최상의 플레이트의 후방에 마커 펜을 사용하여 달성된다. </li></ol> 6. MSC 차별화 <ol><li> 개 중간 엽 줄기 세포의 분화 참고 : 개 중간 엽 줄기 세포는 4 주 동안 해당 매체를 자극하여 연골 세포, 골 세포 및 지방 세포 계통으로 분화되었다. </li><li> 용 지방 세포 분화, 4 × 10 5 CE에서 단일 층의 문화 엽 줄기 세포다음 LLS / cm 2 개의 상이한 배양 조건 교번; <ol><li> DMEM + 루타, 3 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 170 mM의 인슐린을 함유하는 지방 형성 유지 배지에서 배양. </li><li> 3 % FBS, 5 % 토끼 혈청, 1 μM 덱사메타손으로 보충 유지 배지 지방 형성 유도 배지에서 배양, 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 33 μM 바이오틴, 5 μM 로시글리타존 16 17 μM 판토텐산. </li><li> 오일 레드 O로 염색하여 지질 방울을 르벨. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 해결 PBS로 세척 및 이소프로판올 0.35 % 오일 레드 O로 염색. </li></ol></li><li> 7 × 103 세포 / cm (2)와 다음의 자극 단층에서의 조골 세포 분화 중간 엽 줄기 세포 배양의 경우 : <ol><li> 고급 DMEM (GIBCO) 루타 + 5 % FBS, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 501; M L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 10mM의 글리세의 ß-10​​0 nm의 덱사메타손. </li><li> 폰 코사 염색 (5 % AGNO 3)에 의한 광물 예금을 확인합니다. 간단히, 10 % 포름 알데히드와 세포를 고정 5 % 증류수에 AGNO 3 PBS와 얼룩 씻는다. </li></ol></li><li> 연골 세포의 분화 <ol><li> 스폰지 형 의료 장치로부터 절단 조각 (면당 3mm)는, 동결 건조 된 콜라겐 형 I로부터 구성되고 셀 (17)을지지하는 지지체 재료로서 사용된다. </li><li> 4 × 106 세포 / ml (~ 70,000 세포 / 큐브)의 농도로 큐브의 위에 시드 엽 줄기. </li><li> 매체의 첨가에 앞서, 세포를 30 분 동안 큐브에 부착 할 수있다. </li><li> DMEM / F12 + 루타, 2.5 % FBS, 100 단위 / ml의 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2.5 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B, 40 NG / ㎖ 덱사메타손 (dexamethasone), 50 ㎍ / ㎖의 아스 코르 빈산으로 구성된 연골 미디어 MSC-콜라겐 구조를 유지 산 -2- 포스페이트,50 ㎍ / ㎖의 L 프롤린, 1X 인슐린 - 트랜스페린 - 셀렌 X 및 성장 인자 β1 변형 10 ng / ml이되게 준비 하였다. </li><li> 구조 섹션에 프로테오글리칸의 축적을 시각화하는 알 시안 블루 염색을 사용합니다. 간단히, 0.01 %의 H 2 SO 4 및 0.5M 구아니딘 하이드로 클로라이드에 용해하고 0.4 % 알 시안 블루 섹션 O / N 얼룩. 다음, 세척 섹션은 40 % DMSO와 0.05 M의 MgCl 2에서 30 분 동안 세척 하였다. 세포 핵 빠른 빨간색으로 대조되었다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

환자가 약간의 추가 작업 만이 동작 극장 요원에 의해 수행되어야하는 이점, (우리의 경우 주로 척추 수술) 수술을하는 동안 일상적으로 우리는 골수 샘플. 샘플은 즉시 인출 후 구연산 나트륨과 혼합 되더라도 그들이 처리 실험실에 도착했을 때, 많은 샘플이 부분적으로 응고했다. 이 단계에서, 응고 표본을 대체 할 리샘플링은 별도의 추가 작업이 다시 로컬 또는 전신 마취 6 필요로 할 ?...

중간 엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 재생 의학 및 조직 공학에 중요한 역할을합니다. 그들은 그들에게자가 치료 2,3를위한 이상적인 후보자를 표현하는 다양한 세포 유형 1로 분화와 접목, 마이그레이션 할 수 있습니다. 최근, 뼈와 연골 수리를 위해 중간 엽 줄기 세포를 이용하여 임상 시험은, 호스트 질환이나 심장 질환 이식편 대 4를 출시했다. 이러한 중간 엽 줄기 세포는 제대혈이나 지방 조직에서 수확 할 수 있지만 가장 유망한 결과는 골수 유래 줄기 세포 5 얻었다. 장골 골수 상당한 양의를 수집 할 수 있으므로 흡인 6의 메인 사이트의 역할을한다. 그러나 대기음의 품질 인출 골수 부피가 증가함에 따라 감소한다. 골수 흡 인물의 제 5 ㎖ 고품질의 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 반면, 많은 양의 취하 말초 혈액 F와 흡 인물의 희석에 이르게높은 혈관 뼈 7 롬. 항응고제를 사용하지 않고서 본 거핵 혈소판, 골수 흡 인물은 응고되기 쉽다. 그러나 심지어 항응고제, 혈전이 발생할 수 있습니다. 골수에서 중간 엽 줄기 세포는 전체 풀 (8)의 단지 작은 부분을 나타내고, 대부분의 조직 공학 또는 치료 응용 4 배양에서 확장해야한다. 이러한 문화의 품질은 크게 초기 셀 풀, 즉에 따라 달라집니다., 다양성과 높은 기동 번호 9. 인출에서 중간 엽 줄기 세포의 낮은 숫자는 부분적으로 기증자의 변화에​​ 의해 설명 될 수있다. 한편, 낮은 품질의 샘플들로부터 중간 엽 줄기 세포의 수를 달성하기 위해 더 긴 시간 배양 및 계대 확장을 필요로한다. 어느 경우에도, 연장 계대는 세포 노화의 소스이고 10 분화 잠재력의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 셀 (Y)을 극대화 할 수있는 프로토콜을 최적화과의 ield 11,12 악영향이 개발 될 필요가 방지. 우리가 개 중간 엽 줄기 세포와 함께 작업을 시작했을 때 다행히 응고 인간의 샘플 (열에서 하나) 덜 자주있는 동안, 우리는 3 ~ 4 개에서 골수 샘플 혈전 포함 된 것을보고 깜짝 놀랐다. 반면에 우리가 응고 샘플에서 중간 엽 줄기 세포의 훨씬 낮은 수익률을 관찰하는 것이, 놀랍지 않습니다. 응고 된 샘플의 반복 문제를 해결하기 위해, 우리는 리샘플링 대신 혈전 용해 약물 유로 키나아제를 사용하는 프로토콜을 개발했다. 혈전 용해 요법은 심장 마비, 뇌졸중 또는 때문에 원치 않는 응고의 색전증을 일으키는 혈관의 폐색과 같은 생명을 위협하는 상황에 대처 할 수 있습니다. 그들은 플라스 민과 효소 플라스 미노 겐 활성제에 의한 섬유소의 효소 분해를 통해 혈전의 분해에 의해 작동합니다. 환자의 치료에 널리 사용에도 불구하고, 매우 소수의 서적은 활용도가 혈전​​ 활동하는 것이 존재실험실 응용 프로그램이 응고 샘플을 구출하기 위해, 대부분의 림프구에 초점을 맞추고. 1987 년, 니쿠 등. (13)와 4 년 뒤 기능 림프구의 결과로 혈전을 용해 스트렙토의 사용을 설명, 드 비스 등. 유세포 애플리케이션 (14)에 대한 혈액 및 골수에서 백혈병 세포를 분리 스트렙토의 사용을 확장. 최근 간행물은 암 진단 15 Alteplase의 사용을 제안한다. 동일한 효소 적 방법을 사용하는 동안, 우리는 프로토콜 줄기 세포 연구 분야를위한 툴을 제공하는 MSC의 분화능 양식 골수의 분리에 초점을 맞춘다.

<table><tbody><tr><td>Basal Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Heat Inactivated</td><td>Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Osteogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Silver nitrate (AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Chondrogenic Medium Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopad - sponge shaped medical device&amp;nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-proline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrate dihydrate</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urokinase</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml reaction tube</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican needle (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Microtubes</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>sterile forceps</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>sterile scalpel</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria cell cuture dish</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flask - Flask T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological biosafety cabinet class II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>water bath</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Serological Pipette 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>humidified incubator Heracells 240</td><td>Thermo scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

an enzymatic method to rescue mesenchymal stem cells from clotted bone marrow samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

함께 그들은 우리의 실험실 (그림 1A)에 도착했을 때 개 골수 샘플의 74 % (N = 54) 혈전을 포함한다는 사실은 우리가 중간 엽 줄기 세포의 상당수가 혈전 내에 갇혀 있다고 생각했고, 이러한 샘플에서 MSC 수율을 감소 . 실제로, 단면 응고 재의 간단한 DAPI 얼룩은 고밀도 (도 1B)에 유핵 세포의 존재를 확인한다. 이것은 궁극적 유로키나제를 사용하여 프로토콜을 개발하기 위해 ?...

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An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K 조회수.  Swiss Paraplegic Research. Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

연구

발생학

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

유전학

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

생물학

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

생체공학

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

의학

흉선과 골수에서 기질 세포 분리 최적화

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

저자 스포트라이트: 단일 세포 염기서열 분석을 위한 기질 세포 분리를 사용한 조혈 연구 발전

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

요약

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중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

Hoechst의 분리 및 특성^낮은 CD45^부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)