We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

참고 : 모든 제브라 피쉬의 연구와 동물의 유지 보수는 메이요 클리닉 연구소 IACUC 승인 프로토콜 # A41213에 맞게 시행 하였다. Transgenesis 1. DNA를 구축 <ol><li> DNA 서식 파일로 (BACPAC 자원 센터 (BPRC)에서) CH211-270H11 BAC 클론을 사용하여 5.2 kb의 도파민 베타 수산화 (D βh) 프로모터 영역 (8)을 증폭. 2 분 94 ° C (94 ° C, 15 초, 50 ° C, 10주기 30 초, 68 ° : 긴 DNA 템플릿의 길고 정확한 PCR 증폭을위한 PCR 시스템 적절하고 PCR에 대해 다음주기 프로그램을 사용하여 (94 ° C, 15 초, 53 ° C, 30 초, 68 ° C, 8 분), 68 ° C, 4 분 (정방향 프라이머 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39;30 회 반복 C, 8 분), 역방향 프라이머 5&#39; GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> D βh -pDONRP4-P1R 항목 클리오 만들기NE 8 등 다중 게이트웨이로 상업 재조합 복제 시스템을 사용하는 경우. 정제 dβh PCR 제품 (172 NG / μL) 1 μL (150 NG / μL) pDONRP4-P1R 기증자 벡터의 1 μl를 혼합 (다른 게이트웨이 벡터 박사 카이 빈 치엔, 대학교에서 관대 한 선물은과 함께. 유타) , TE 완충액 (pH 8.0) BP clonase 효소 믹스의 2 μL와의 4 μL는 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 원샷 TOP10 관할 E.로 변환 대장균 제조 업체의 프로토콜에 따라. </li><li> 생성 D βh : EGFP-MYCN 유전자 변형 단계 1.2에서 언급 한 8 사용하여 재조합 복제 시스템을 구축. 각 항목 클론의 1 μL 5.2 킬로바이트 dβh 프로모터 (dβh -pDONR P4-P1R 구조), EGFP가 정지 코돈 (PME-EGFP 구조를) 부족을 포함하여 (150 NG / μL), 인간 MYCN의 cDNA를 혼합 (관대 한 선물 박사 호가 티에서 펜실베니아의 어린이 병원, MYCN - pDONRP2R-P3 구조), 1 μL I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)에서 관대 한 선물, TE 버퍼의 4 μl를 포함하는 수정 대상 벡터의 (150 NG / μL) ( LR Clonase 효소 믹스의 2 μL으로 pH 8.0), 25 ° C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 변환 화학적으로 유능한 E.을에 대장균과 같은 하나의 샷 10 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> MITF합니다 : MITF 유전자가 PNP-MITF 벡터 소화에 의해 8을 구성 NotI을 SalI을 제한 효소로 2 시간 동안 실온에서, 그리고 발표 2.65 kb의 서브 클로닝하여 (박사 D. Raible, 대학교에서 관대 한 선물을 워싱턴.) MITF 플 랭킹 프로모터 및 I-SceI 제한 효소 절단 부위를 함유하는 개질 된 벡터의 pBluescript 계을 NotI 및 MluI 부위에 지브라 피쉬 MITF 유전자의 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편 (휘 박사로부터 철 기질 선물NG, 보스턴 대학), 제조자의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리가 제를 사용. 참고 : 안정적인 MYCN 발현 라인을 생성의 효율성을 높이기 위해, D는 βh : EGFP-MYCN와 MITF :. MITF DNA 구조는 하나의 세포 단계의 진주층의 배아에 coinjected되는 자개가 신경이 부족 돌연변이 물고기의 유형 지정 크레스트 유래 개발 36시 melanophore. 따라서, 안료 분사 배아 세포의 모양 MITF의 통합을 시사한다 : MITF DNA는 게놈에 생성한다. 이것은 두세 coinjected DNA 작 제물은 물고기 유전체 (31)에 공적분 될 수 있음을 입증되었다. EGFP-MYCN 유전자와 MYCN 안정적인 형질 전환 라인의 식별을 용이 : 따라서, MITF 발현에 의한 색소 침착은 dβh의 통합을위한 마커 역할을 할 수 있습니다. </li><li> EGFP-MYCN과 MITF : D의 βh 믹스 MITF DNA를I-SceI 제한 효소 효소 1 μL 버퍼 0.75 μL와 15 μL 반응의 총 부피 : 1 비율로 3에서 구축합니다. 반응에서 DNA의 총량이 750 NG를 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 4 시간 또는 O / N에 대한 RT에서 I-SceI 제한 효소 소화를 수행하십시오. 둘째 날, I-SceI-하는 DNA는이 마이크로 인젝션 준비 또는 미래에 주입 -20 ° C에서 저장 될 수 소화. 효소의 효율을 유지하기 위해 작은 분취 량을 -80 ℃에서 I-SceI 제한 효소를 저장. </li><li> 박사 C. Grabher에서 (관대 한 선물을 pENTRY1A 벡터의 EcoRI 및 NotI으로 ​​사이트에 한 pcDNA3TM 벡터에서 인간 ALKF1174L 및 야생 형 ALK 유전자 (다나 - 파버 암 연구소에서 박사 조지 관대 한 선물) 7 서브 클론, 기술의 카를 스루에 연구소, 카를 스루에, 독일)는 제조업체의 프로토콜에 따라 T4의 DNA 리가 아제를 사용하여. </li><li> D의 βh 생성 : ALKF1174L을 &lt;/ EM&gt; 또는 dβh 프로토콜 : 1.2에서 언급 한 바와 같이 시스템을 사용하여 재조합 ALKWT 유전자 작 제물. 간단히 세 가지 항목 클론을 결합, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (또는 ALKWT -pENTRY1A)과 P3E - 폴리 -A, I-SceI 제한 효소 인식 부위 (박사 C. Grabher, 카를 스루에에서 관대 한 선물을 포함하는 수정 대상 벡터에 기술 연구소, 카를 스루에, 독일), 제조 업체의 프로토콜에 따라, LR Clonase 효소 믹스를 사용하여. </li><li> 혼합 D βh : ALKF1174L (또는 dβh : ALKWT)과 dβh : mCherry DNA가 3에서 구축 : 1의 비율 및 프로토콜 1.5-1.6에 설명 된대로 I-SceI 제한 효소 효소로 선형화. </li></ol> 2. 미세 주입 <ol><li> 모든 주사 37 1.0 mm 직경 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 주입 전에 면도날 유리 마이크로 피펫의 팁을 끊다. 분사에 의해 주입 부피를 보정미네랄 오일 방울로 H 2 O를 보내고. 생성 된 방울의 직경을 측정하고 주입 부피는 하나의 셀 단 배아 세포의 총 부피의 10 % 미만임을 보장하는 마이크로 인젝터 (압력 또는 압력 펄스의 지속 기간)을 조정한다. </li><li> DNA를 함유하는 주사 용액 5 μL의 신선한 I-SceI 제한 효소 (5 유닛 / μL)을 추가로 0.5 μl를 추가하면 주입 transgenesis (38)의 효율을 증가시키기 직전 구성한다. 하나의 세포 단계의 배아의 세포질에 선형화 된 DNA 구조의 50 ~ 80 페이지를 주입한다. 주사의 성공을 보장하기 위해, 시각화를위한 0.25 % 페놀 레드 샘플을 섞는다. 세포 주입 후 빨간색을 설정하면, 미세 주입이 성공. 형질 전환 어류를 생성하는 높은 성공률을 보장하기 위해, 우리는 일반적으로 500 개의 배아를 주입. </li><li> EGFP-MYC : 안정적으로 MYCN를 발현하는 형질 전환 어류를 생성하려면, 선형화 된 D의 βh을 coinjectN과 MITF : MITF DNA 구조 (3에서 : 1 비율) 한 세포 단계에서 색소 돌연변이 진주층의 제브라 피쉬의 배아에. MITF의 발현은 물고기 게놈의 유전자 구조의 통합을위한 기자 역할을합니다. </li><li> dβh로 : ALK F1174L (ALKWT 또는 dβh :) : 야생 형 또는 MYCN 유전자 변형 배아에서 ALK의 모자이크 과발현를 들어, 선형 개발 βh 공동 주입 한 세포로 : mCherry DNA (1 비율 3에서) 구축 야생 형 AB 물고기 형질 전환 어류 : F1 이형의 Tg (EGFP-MYCN dβh)의 번식에 의한 배아. 따라서, 자손의 절반은 MCYN을위한 형질 전환하고 반은 야생 형이다. </li></ol> 안정 또는 모자이크 형질 전환 어류 3. 화면 <ol><li> tricaine (0.02 %)로 주로 주입 진주층 배아 마취, MYCN 안정한 발현 라인 식별의 효율성을 증가시키기t 일 색소 침착에 대한 postfertilization 및 화면의 3-5. 생식 세포에서 EGFP-MYCN 유전자 : D βh을 수행 설립자 물고기에 대한 추가 검사를 위해 성적 성숙에 신선한 계란 물에 새로운 배양 접시에 색소 침착 배아를 전송하고 올립니다. </li><li> EGFP-MYCN, 더 유전자형 1 ~ 2 일 후 수정에서 EGFP 양성 배아 야생 형 AB 물고기와 화면 교배 색소 F0 성인 물고기의 생식 전송과 설립자를 식별합니다. PCR 튜브에 하나의 EGFP 양성 F1 배아를 놓고 모든 액체를 제거합니다. 4 배 용해 버퍼의 12.5 μL, 35 μL의 H 2 O 2.5 ㎕의 단백질 분해 효소 K 단일 배아 (10 ㎎ / ㎖)를 포함 gDNA를 추출 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 4 배의 용해 완충액 50 mL로 K. 단백질 분해 효소를 불 활성화 98ºC에서 배양 10 분 뒤에 55 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 반응을 품어 1M 트리스의 500 μl를 추가 (PH 8.4), 2.5 ml의 1M의 의 KCl의 tH 2 O의 O를 47 ml의 참고 : F0 MYCN 안정적인 형질 전환 어류가 야생 형 AB 물고기와 자란 후, 자손의 모든 색소입니다. 따라서, 색소 침착 MYCN- 긍정적 인 물고기의 식별 마커로 사용될 수 없습니다. MYCN 형질 전환 어류에있는 동안, EGFP-MYCN 융합 단백질 등 및 연수에 같은 우수한 경부 신경절 및 교감 체인 순차 분절 신경절 및 비 PSNS의 도파민 성 뉴런의 교감 신경을 포함한 PSNS 표현된다 뇌 신경 8. 따라서, EGFP의 표현은 MYCN 안정적인 형질 전환 배아의 식별을위한 마커 역할을 할 수 있습니다. </li><li> , 템플릿으로 색소 F1 배아에서 추출한 gDNA를 2 μl를 사용하는 것은 MYCN을 프라이머 - 테스트 F1 : 5&#39;-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3 : 5&#39;-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 &#39;다음 프로그램 위트시간 GC-RICH PCR 시스템 : 3 분 95 ° C의 1주기, 30 초 동안 95 ° C의 25주기, 30 초 동안 58 ° C, 3 분 동안 72 ° C. 우리는 일반적으로 착색 된 배아의 통합 MYCN 전이 유전자의 존재, MITF와 MYCN를 과발현 6 개 이상의 설립자 물고기가이 방법에 의해 확인 된 사항을 확인하기 위해 하나의 결합에서 14 ~ 16 착색 된 배아를 유전자형. </li><li> EGFP 양성 F1 배아의 나머지 부분을 올립니다. 핀은 상기 클립 물고기로 MYCN 트랜스의 통합을 확인하기 프로토콜을 사용하여 상기 세 2-3 개월 째 그들을 유전자형. F1 MYCN에게 야생 형 AB 물고기 안정적인 유전자 변형 물고기 새끼를 낳. ALK F1174L (또는 dβh : ALKWT) dβh과 : 선형화 개발 βh을 공동-주입 프로토콜 2.4에 설명 된대로 mCherry DNA는 하나의 세포 배아로 구성한다. </li><li> 정렬 실험에서 배아를 발현 MYCN는 입체 불소를 사용하여 프로토콜 2.4에 설명escence 현미경 일 PSNS에서 EGFP-MYCN의 발현에 대한 postfertilization 1-3에서 주로 주입 된 배아를 화면. 그런 다음, 일 postfertilization의 2-5시, tricaine (0.02 %)와 배아를 마취 및 입체 형광 현미경을 사용하여 PSNS에 mCherry의 발현에 따라 다시 그 MYCN- 양 또는 음의 배아를 정렬 할 수 있습니다. mCherry의 발현은 모자이크 차 주입 동물의 조직에서 ALK의 동시 발현 마커 역할을합니다. 참고 : ALK F1174L 및 dβh : mCherry, dβh : ALKWT 및 dβh : mCherry, 또는 dβh 야생 형 물고기와 MYCN 안정적인 형질 전환 어류의 번식으로 인한 ~ 600 자손 D의 βh 포함, 선형화 된 DNA 구조와 그룹 당 주입 하였다 : mCherry 혼자, 각각. mCherry의 모자이크 식을 주로 주입 물고기 70 ~ 90 %를 관찰 할 수있다. 한 반은 일 대주입 된 물고기의 세 번째는 종양 시계의 애벌레 단계를 통해 살아 남았다. </li><li> mCherry + MYCN + 및 mCherry + MYCN의 모든 올립니다 - 제브라 피쉬의 책 (39)의 표준 프로토콜에 따라 배아를 5 주 postfertilization에서 시작 종양 발병을 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 모자이크 형질 전환 어류 4. 종양 시계 <ol><li> 종양 발병의 증거 5 주 postfertilization에서 시작하여 매 2 주마다 mCherry- 긍정적 주로 주입 물고기를 모니터링합니다. </li><li> mCherry의 존재 tricaine (0.02 %)와 화면 물고기 마취 -와 EGFP가 디지털 광경 DS-U1 카메라 장착 니콘 SMZ-1500 형광 입체 현미경 PSNS 종양에서 발현. </li><li> 종양이 ALK 변이 유전자를 발현 여부를 확인하려면 mCherry-와 ALK 유전자 분석 PCR에 대한 EGFP 양성 대중을 격리 할 것. </li><li> PCR을 사용하여, 게놈 DNA를 증폭ALK P7 : 5&#39;-AGG CCA GGT GTC CGG AAT의 GC-3 &#39;와 ALK P18 : 5&#39;-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3&#39;과 다음 PCR 반응 : 1주기 다음 프라이머와 개발 종양에서 추출 5 분 94 ° C의 30주기 (30 초 30 초 94 ° C, 55 ° C, 60 초 동안 72 ° C). 이어서, 시퀀스의 ALK P7 프라이머로 PCR의 생성물은 더 mCherry 양성 종양에서 돌연변이 또는 야생형 ALK의 존재를 확인한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 대표 연구에서는이 유전자가 현저히 화합물 안정적인 형질 전환 어류 coexpressing에서 우리의 이전 연구 결과와 일치하는 신경 모세포종의 발병을 가속화하기 위해 협력 것을 보여주기 위해 유전자 변형 물고기를 발현 MYCN의 mCherry 리포터 유전자로 과도 공사 출 활성화 ALK의 동시 발현을 사용 모두 ALK와 MYCN 8 활성화. 이 형질 전환 방법은 모자이크 종래 방법에 ...

암은 시간이 지남에 병리학 적 돌연변이, 삭제 및 염색체 이익의 축적에 의해 표시 진보적 인 질병이다. 이러한 유전 적 이상이 저산소증과 같은 스트레스 반응 세포 골격의 세포주기, 세포 사멸, 에너지 대사 및 조립에 이르기까지 다수의 세포 과정에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 종양은 생물학적 과정의 스펙트럼에 걸쳐 여러 유전 수차의 집단 행동을 반영한다. 전체 게놈 시퀀싱, 진유 전체 시퀀싱, 타겟 시퀀싱, 깊은 시퀀싱 및 게놈 넓은 협회 연구 등을 포함하여 통합 게놈 연구 노력은, 종양 1-4 본질적으로 모든 종류의 새로운 유전 적 변화의 증가를 확인했다. 많은 경우에, 유전 적 병변은 질병의 발병 기전에서의 협력을 제안, 랜덤하지 않은 방식 5-8에서 함께 발생합니다. F를 결과 비정상적으로 발현 유전자의 큰 배열의 발암 역할을 해부이러한 게놈 병변 ROM 새로운 치료 전략을 고안하고 이러한 에이전트에 종양 세포의 반응을 이해할 필요가 있지만, 이것은 높은 처리량 기능적 게놈 분석의 수행에 대해 매우 강력한 동물 모델 시스템을 필요 곤란한 과제를 증명했다 생체. 포유 동물, 특히 쥐가 암 생물학에서 선호하는 모델이지만, 제브라 피쉬는 상당한 관심을 끌기 시작했다. 경골 제브라 피쉬 (다리오 레 리오 (rerio))는 1960 년대 이후 개발 연구를위한 모델 생물로 사용되었으며, 1982 9-11 종양 발병 기전의 연구에 적용 하였다. 유지 보수, 작은 몸 크기, 높은 생산력의 용이성 제브라 피쉬의 이상과 병리학 적 표현형 (10)을 부여 돌연변이를 확인하는 대규모 앞으로 유전 화면을위한 강력한 모델합니다. 제브라 피쉬 배아의 광학 투명성,이 암 모델의 넓은 사용을 지원하는 또 다른 핵심 기능입니다그것은, 실시간 9 설치류 (12)에 상대적으로 어려운 응용 프로그램을 종양 발생을 찾기 위해 실시하는 생체 내 이미징에 있습니다. 제브라 피쉬 참조 게놈 (Zv9)의 최근 비교 게놈 분석은, 71 %는 82 %가 남자 (OMIM) 데이터베이스 (13)에 온라인 멘델의 상속 질병 관련 유전자와 상관 관계가있는 인간의 orthologues을 갖는, 26,206 단백질 코딩 유전자를 밝혀 (14). 따라서, 제브라 피쉬가 신경 모세포종 (8)을 포함하여 인간의 암의 다양한 유형을 모델링하는 데 사용되었습니다, T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL) 15, 16, 흑색 종 (17, 18), 유잉 육종 (19), 횡문근 육종 (20, 21), 췌장암 22, 간세포 암 (23)과 골수는 24, 25을 악성 종양, 이종 이식에 대한 암 모델 11,26 연구로 선정되었습니다. 안정적인 형질 전환제브라 피쉬의 접근 방식은 일반적으로 기능 획득 정상적인 발달 또는 질병의 발병 기전 (27, 28)에서 유전자의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 모델 (도 1a)을 개발하기 위해, 하나의 셀은 하나의 야생형으로 배아 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 관심 유전자를 포함하는 DNA 작 제물을 주사. 주입 된 배아는 성적 성숙에 도달하면 세 4 개월 주사 후, 그들은 설립자 물고기로 라이센스를 자신의 생식 세포에 건설 DNA의 통합을 보여주는 것들에 대한 선별 야생 형 물고기와 outcrossed된다. 그러한 카피 수와 트랜스 진의 통합 사이트 등 많은 요소, 안정한 유전자 변형 라인에서의 유전자 발현에 영향을 미친다. 그러므로, 트랜스 제닉 종양 모델을 개발하기 위해, 하나의 종양 유전자를 과발현하는 형질 전환 계통 안정 다중 먼저 생성되고 종양을 유도 이어질 수도 수준에서 트랜스 유전자를 발현하는 라인에 대해 스크리닝 할 수있다. 그러나, 후보 O 과발현ncogene가 생식 세포에 독성이며, 직접 트랜스 29 과발현 형질 전환하여 안정된 선을 생성하는 것이 곤란하다. 따라서, 이러한 접근법은 적절한 암 모델을 생성하기 위해 고장 위험이 높은, 시간 소모적 일 수있다. 여기서 우리는 생체 내에서 기능 게놈 연구에 대한 기존의 안정적인 transgenesis를 통해 독특한 장점을 제공 모자이크 과도 transgenesis (그림 1B)에 따라 다른 전략을 설명한다. 이 방법에서는, 하나 이상의 형질 전환 유전자 구조체는 형질 전환 또는 야생형의 하나의 배아 세포 단계로 주입된다. 유전자를 포함하는 주입 된 DNA 구조는 개별 물고기 (30)의 여러 세포 집단 내에서 혼합 된 유전자형의 결과로, 다음 mosaically 무작위로 차 주입 물고기에 통합되어 있습니다. 또한, 여러 DNA의 공사 출 하나의 세포 배아의 구축은 공동의 통합을 위해 임의의 사이트에서 동일한 셀에, TRA 하나를 허용 리드유전자의 발현과 세포를 CE 및 모자이크 동물 (31)의 질병 발병시 다른 유전자의 상호 작용을 탐구한다. 원리의 증거로서, 우리는 일시적으로 야생 형 물고기와 MYCN 과발현 형질 전환 어류의 도파민 베타 수산화 (D의 βh) 프로모터의 제어하에 주변 교감 신경계 (PSNS)에 mCherry 리포터 유전자와 mutationally 활성화 ALK를 (F1174L) 과발현. 수용체 티로신 키나제를 코딩 ALK는 고위험 신경 모세포종 5-7,32,33에서 가장 빈번하게 돌연변이 된 유전자이다. ALK 가장 빈번한 활성화 및 유력한 체세포 돌연변이 중 하나 (F1174L)은, 표현 위에-IS MYCN- 고위험 신경 모세포종 환자를 증폭하고 안정적인 형질 전환 마우스 및 형질 전환 제브라 피쉬 모델 8,34,35 모두에서 신경 모세포종의 종양 발생을 촉진 MYCN 과발현과 synergizes. 모자이크으로MYCN 유전자 변형 물고기 mCherry와 ALK (F1174L)의 과도 과발현, 우리는 모자이크 transgenesis 전략에 신속하고 효율적으로 사용될 수 있음을 시사 ALK (F1174L) 및 MYCN 모두를 과발현 안정적인 형질 전환 어류에서 관찰 된 종양 발병의 가속도를 효과적으로 요약 생체 내 종양 개시에 여러 개의 종양 유전자의 상대적 기여도를 평가합니다.

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

mutationally 활성화 ALK의 F1174L 또는 야생형 ALK의 과발현은 신경 모세포종 유도에서 MYCN과 협력 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 MYCN를 과발현하는 형질 전환 어류의 PSNS의 개발 βh 프로모터의 제어하에 활성화 인간의 ALK 또는 야생 형 인간 ALK를 과발현. ALKF1174L 또는 dβh - - 다음과 같은 구조, dβh 중 하나 ALKWT는 dβh와</em...

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

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11.1K 조회수.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

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Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

연구

암 연구학

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

의학

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

발생학

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

생물학

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

면역학 및 감염병학

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

요약

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종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

향상제 시퀀스를 평가하기위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법