저자는 장비 설정 사이토 흐름에 그의 도움을 혈액 시스템 연구소에서 데일 Hirschkorn에게 감사의 말씀을 전합니다. NIH에 의해 지원되었다이 작품은 HL095470 및 U01의 HL072268과 국방부 계약 W81XWH-10-1-0023 및 W81XWH-2-0028을 부여합니다.

참고 : 다음 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든 제도적 국내 및 국제 지침에 따라 수행되고있다. 모든 인간의 주제 샘플은 기관 검토위원회 (IRB)가 승인 한 프로토콜에서와 주제의 동의와 시험 하였다. 1. 방법 A : 개별 탐지 방법 전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 1.1) 처리 <ol><li> 다음 2 단계 차등 원심 분리 프로토콜을 사용하여 ACD-솔루션 또는 다른 즉시 적절한 항 응고 및 프로세스 (30 분 이내 최대)의 1.5 ml에 포함 된 2 개의 10 ml의 유리 튜브에 기증자 / 환자의 혈액을 그립니다. 참고 :이 프로토콜은 그려진 혈액의 결합 ~ 17 ml의에서 약 10 ml의 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)의를 얻을 것입니다. 다소간 PPP가 필요한 경우, 혈액 수집 튜브의 수는 적절히 조절 될 수있다. </li><li> RT에서 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리버피 코트와 적혈구에서 혈장을 분리합니다. 버피 코트와 붉은 세포를 포함하는 바닥 층을 방해하지 않도록주의, 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 플라즈마 상층 액의 1.2 분취 량을 전송합니다. </li><li> 혈소판 및 대 세포 단편을 제거하기 위해 RT에서 10 분 동안 13,000 XG 스핀. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록하고 새로운 튜브에 PPP를 추가하는 200 ㎕를 뒤에 남겨두고, PPP를 전송합니다. </li><li> 이 시점에서, 나중에 분석을 위해 최대 2 년 (개요도 1a를 참조)에 대한 -80 ° C에서 분석하거나 새로운 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 1.0 ml의 분량에 전송 및 저장 즉시 PPP를 사용합니다. </li><li> 정제 전기 자동차는 초 원심 분리기 튜브에 기능 실험, 전송 PPP 6 ml의 필요와 0.2 μm의 필터링 된 인산염 완충 생리 식염수 28 ㎖ (PBS)를 추가하는 경우. 스윙 버킷 로터가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 만 XG에 60 분 동안 회전. 기음 뜨는에 resuspend의 EV 펠1.5 ml의 미디어 보자. 참고 : 가장 높은 재현성, 혈액 샘플을 기증자 기증자로 일관하게 처리해야한다. EV 분리 방법에서의 변화는 상당히 상관 검출 전기차의 수 및 유형에 영향을 미칠 수있다. </li></ol> 1.2) 분석을위한 시료 준비 참고 :이 시점에서, 단계 3 패널 14 마커 12 샘플을 분석하기위한 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 그러나, 다른 항체의 조합이 여기에 사용될 수있다; 프로토콜은 관심있는 사람들을 위해 제안 된 마커를 대체하여 다른 EV 개체군을 연구하기에 적합 할 수있다. <ol><li> 37 ° C에서 해동 (-80 ° C에 저장하는 경우) 냉장고에서 12 샘플을 제거합니다. </li><li> 피펫 내용을 위아래로 몇 번 혼합합니다. 각 샘플에서 320 μl를 제거하고 96 웰 플레이트의 맨 위 행에 추가합니다. 참고 : 폭 조절 멀티 웰 피펫이와 엉덩이에 걸쳐 많은 다른 단계에 매우 도움이된다네, 한 번에 여러 샘플을 분석 할 때 특히. </li></ol> 1.3) 염색 EV 샘플 <ol><li> 염색하기 전에 긍정적 인 신호를 발생할 수있는 집계를 제거하기 위해 모든 항체 (ABS)를 필터링 할 수 있습니다. <ol><li> Ab의 혼합물 모두는 필터를 통과 한 결합 항체는 2 분 동안 실온에서 고정 된 각도 단일 고속 원심 분리기 (~ 750 XG)를 사용하여 별도의 0.22 μm의 원심 필터 튜브와 원심 분리기 (3) 각 패널에 사용될 때까지 또는 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다. 스토어 구간 최대 2 주 동안 냉장고에 칵테일하지만 다시 필터를 사용하기 전에 각각의 시간. </li></ol></li><li> 잘 2 행의 각 여과 Ab의 혼합물의 적절한 금액을 추가 (예를 들면, 나는 각 Ab의 2 μL 묻 패널의 샘플은, 그래서 필터링 Ab의 칵테일 12 μL 총 2 행 잘 당 추가됩니다). 제안 된 판지도의 개요에 대해도 1b를 참조하십시오. 이 또한 반복이상의 패널이 실행되는 경우 아래의 행에의 (여기에 잘 사를 행하기 위해 패널 III 칵테일의 3, 11 μL /는 행 8 μL / 웰 패널 II 칵테일의 추가, 특정 패널 정보에 대한 자료 목록 참조). </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 상하 1 행 PPP 샘플들을 혼합하고 혼합 2. 상하 행의 웰에 1 행의 웰에서 100 μl를 옮긴다. 30 분 동안 4 ° C에서 행 3, 4 품어의 행에 1에서 100 μl를 전송 변경 팁과 반복. </li></ol> 1.4) 세척 MV 샘플 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에 96 웰 4 ° C 접시와 전송을 제거합니다. / 잘 행 6-8 PBS의 220 μl를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용하여 (/ 린스 스테인드 PPP를 포함하는 우물을 세척에 사용되는). </li><li> 항체의 패널 (3), 12 × 3 = 36 필터 튜브와 함께, 샘플 (12)의 폭 조절이 다중 채널 피펫 (미리 라벨링하여 원심 필터 튜브로 각 웰의 내용물을 옮길 것이다) 필요. 동일한 팁 사용 세척 행에서 PBS 200㎕를 제거하고 PPP 방금 제거 된 대응하는 웰에 추가한다. </li><li> 우물을 씻어 PPP 이전에 추가 된에 동일한 필터로 세척 용액을 전송 아래로 섞는다. 원심 필터의 확대 꼭대기. 변경 팁. </li><li> 모든 스테인드 PPP 샘플을 원심 필터 그들의 린스 솔루션과 함께 전송 될 때까지 남아있는 스테인드 샘플이 과정을 반복합니다. </li><li> RT에서 3 분 동안 850 XG에 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에​​ 원심 필터를 전송합니다. 참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 &quot;건조&quot;로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 PPP 샘플은 필터를 통해 효과적으로 이동 원심 긴 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 원심 필터 튜브를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 돌아갑니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 300 ㎕의 PBS에 필터의 상단을 재현 탁. 재현 탁 내용이 즉시 FCM 분석을위한 튜브를 표지가 미리 전송합니다. 주 : 샘플 간 변동을 피하기 위해 샘플 간의 일관성 피펫 플런저 함몰 힘과 수를 유지하는 것이 매우 중요하다. 이 이상적으로 최대 특정 볼륨 아래로 피펫하도록 프로그램 된 전자 피펫을 사용하여 수행해야합니다 (예를 들어, 280 μL), 각 샘플에 대한 시간 (예를 들어, 8 회)의 정확한 숫자. </li></ol> 1.5) 사이토 설치 <ol><li> FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에. </li><li> EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 : <ol><li> 이전으로 보상 구슬 2 방울을 추가표지 된 튜브 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)과 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어. </li><li> 기기에 포함되어있는 소프트웨어 흐름 cytometer를 사용하여 각 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널에서 가장 높은 (밝은)되어 있는지 확인하고 필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다. </li><li> 다음 선택 &quot;실험&quot;탭을 선택 &quot;보상&quot;을 모든 샘플에 보정 값을 적용하는 &quot;계산 보상&quot;을 선택합니다. </li></ol></li><li&gt; 규모를 기록하고 각 세포 계수기 (FSC = 200 SSC = 200)에 의해 허용되는 가장 낮은 임계 값을 선택하려면 앞으로 분산 형 (FSC)와 측면 산란 (SSC) 전압 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터 PBS의 관을 실행하는 동안, (즉, 단지 이벤트 레이트 5 이벤트 / 초를 상회하는 전압 임계치 아래) 배경 잡음의 대부분을 배제 최고 값 FSC 및 SSC 전압을 조정한다. </li><li> 필요한 경우 PBS에 희석 1.0 ㎛의 비드, - 다음으로, 0.2 ㎛의 함유 튜브를 실행. FCS SSC 대 플롯에서, [㎛ 0.2 내지 1.0 이벤트를 캡처하는 비드 인구 주위에 게이트를 그립니다. 또한, SSC-H의 히스토그램, 1.0 μm의 구슬보다 작은 모든 이벤트를 포함하는 게이트를 그립니다. </li><li> &quot;소호&quot;(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정합니다. 구슬 튜브를 사용 (또는 구슬의 공지 농도를 함유하는 다른 튜브) 직전까지 사이토에 유량을 조절 다이얼NT 속도는 약 200 이벤트 / 초에 도달한다. 같은 유량으로 모든 샘플 튜브를 읽고 그 흐름 속도가 실행 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 동일한 비드 농도를 사용합니다. </li><li> PBS에 희석 무지개 입자의 형광 관을 실행. 5000 이벤트를 취득. FSC, SSC, 각 컬러 채널에 대한 평균 휘도 값을 기록한다. 그 형광 강도 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 전압을 조정하기 위해이 값을 사용합니다. </li></ol> 1.6) 샘플 읽기 <ol><li> &quot;소호&quot;(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정하고 정확하게 1 또는 2 분 동안 각각의 샘플을 실행합니다. </li><li> 먼저 읽은 후, NP-40 아래 각 샘플, 피펫 최대 10 %의 20 μl를 추가하고, 검출 긍정적 인 이벤트의 공제 할 수 있도록 같은 시간 (1 또는 2 분)에 대해 다시 읽어 동일한 기간 동안 분해 된 샘플. 참고 : 그것은 매우 꼬마 도깨비입니다샘플 피펫보다는 와류로 혼합되는 것이 ortant. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 볼텍스 EV-흉내 긍정적 인 이벤트로 이어지는, 일부 항체의 자체 집계가 발생할 수 있습니다. </li><li> 일단 모든 샘플 수출이 별도의 파일로 모든 파일 .fcs FCM 분석 소프트웨어를 이용하여 추가 분석에 사용되는, 판독되었다. </li></ol> 1.7) 데이터 분석 <ol><li> FCM 분석 소프트웨어를 엽니 다. 새로운 실험 파일로 .fcs 파일을 모두 가져옵니다. </li><li> 구슬 전용 튜브를 엽니 다. SSC-A 플롯 대 FSC-A에서 0.2 μm의 1.0 μm의 사이에 크기가 모든 구슬을 문을 그립니다. 이 EV 게이트입니다. 드래그 모든 샘플에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 부정적인 컨트롤을 용해 샘플을 사용하여, 사용 된 각각의 형광 채널에서 배경 형광의 가장자리에 문을 그립니다. 해당하는 각 비 용해 샘플의 EV 게이트에 형광 문을 끕니다. 참고 :이 시점에서 그것은 또한 듀얼 형광 이중 매개 변수 플롯을 검사하는 데 유용합니다. 로켓 모양마커는 관련이없는 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 경우 특히 이중 양성 사분면 응집 또는 다른 소포 흉내 낸 사건으로부터 아티팩트를 나타낼 수있다 (도 8 참조). </li><li> 각 형광 마커를 들어, 비 - 분해 된 샘플의 이벤트 수와 샘플의 용균 이벤트 수를 뺀다. 선택적 % 양의 값을 얻기 위해 비 용균 EV 게이트 내에 전기차의 총 개수로이 번호를 나눈다. </li></ol> 2. 방법 B : 비즈 방법 전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 2.1) 처리 <ol><li> (1.1 절) 방법에 설명 된 혈액 처리 방법을 참조하십시오. </li></ol> 2.2) 분석을위한 시료 준비 <ol><li> 원하는 경우, 엑소 좀과 마이크로 소포에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기차를 분별. 0.22 μm의 원심 필터에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차의 250 μl를 추가하고 750 X에서 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에​​ 전송실온에서 2 분 동안 g. 참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 &quot;건조&quot;로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 샘플은 유체가 필터를 통해 효과적으로 이동하기위한 원심 약간 긴 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 2 ㎖에 코팅 6 μm의 폴리스티렌 비즈 (예를 들어, 음의 ABC 구슬) RPMI 매체와 배, 그리고에 resuspend을 씻으십시오. 각 FACS 튜브에 6,​​000 구슬을 추가합니다. 음성 대조군 튜브에, 구슬 형 RPMI 매체의 400 μl를 추가. 다른 모든 튜브, PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차 (또는 그 분획물) 200 μL와 RPMI 미디어 200 μl를 추가합니다. </li><li> 미디어 400 μl의 모든 튜브의 최종 볼륨을 조정하고, 진탕 기에서 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 다음 날 아침, 미디어의 2 ml로 구슬을 씻는다. 뜨는을 대기음. </li><li> 4 ℃에서 3 시간 동안 미디어 (400 μL)에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단# 176; 통에 C. </li><li> 미디어의 2 ml로 구슬을 씻으십시오. 배지 100 ㎕에 대기음에 resuspend 펠렛. </li></ol> 2.3) 염색 EV 샘플 <ol><li> 모든 항체를 필터링합니다. 방법에 사용 된 동일한 항체 패널을 사용하거나, 필요한 경우, 그만큼의 형광체들간에 호환성으로 항체의 상이한 조합을 생성한다. </li><li> 결합 된 항체는 모두 0.22 μm의 필터 원심 튜브에 단일 패널에 사용될 수있다. 2 분 동안 또는 혼합물 구간까지의 모든 각도 고정 된 단일 고속 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 필터를 통과 한 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다. </li><li> 모든 튜브에 필터링 된 항체 칵테일의 적절한 볼륨을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 품어. </li><li> 사이토 흐름에 미디어의 400 μL 미디어, 재현 탁 2 ml로 구슬을 세척하고 즉시 실행 (또는 같은 날 내에서). </li></ol> 2.4) 설치 및 샘플 읽기 사이토<ol><li> FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에. </li><li> EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 : <ol><li> 튜브를 표지가 미리 보상 구슬 2 방울 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)을 추가하고 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어. </li><li> FCM 소프트웨어를 사용하여, 각각의 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널 (밝은) 가장 높은 있는지 확인하고필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다. </li><li> 탭 선택 &quot;실험&quot;다음 &quot;보상&quot;을 선택한 후 &quot;계산 보상&quot;모든 샘플에 보정 값을 적용합니다. </li></ol></li><li> 규모를 기록하고 각 세포 계수기 (FSC = 200 SSC = 200)에 의해 허용되는 가장 낮은 임계 값을 선택할 수있는 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 변경합니다. </li><li> 중항 비즈 인구에 실행 샘플, 게이트 및이 게이트에 2000 이벤트를 취득. 수출 .fcs 파일. </li><li> 파일을 .fcs 분석 FCM 분석 소프트웨어를 사용합니다. 중항 구슬에 문입니다. 각각의 형광 색소에 대한 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하고, 음성 대조군의 MFI 비교. </li></ol>

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E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients.">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li><li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes.">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Miguet, L., Be&#769;chade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis.">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li><li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

격리, 치료 및 전기 자동차의 분석을위한 두 개의 서로 다른 프로토콜이 각각 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여, 발표되었다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 선택하는 것은 간단하지 않다 항상 관심 개별 소집단뿐만 아니라 테스트되는 샘플의 이해를 요구한다. 가장 적절한 방법을 선택할 때 또한, 취득 사용 계측기의 감도가 고려되어야한다. 때때로 아니라, 방법의 조합은 혼자 어느...

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다. 또한 미세 입자로 알려진 전기 자동차는 세포 - 세포 통신에 관여 생물학적 과정 (1)의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이되는 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 4 - 다양 표면 마커 및 / 또는 생물학적 물질의 직접 전사 식을 통해, 전기차가 활성화 또는 세포 간 통신 (2)에서의 역할을 억제하거나 재생받는 세포의 기능을 변경할 수있다. 다른 종양 촉진 metasta에서, 광범위한 조건에 기여하는 것으로 도시되었지만 임상 혈소판 유래 전기차는 강력한 항 응고 활성을 5 것으로 알려진질병 (7)에 대한 보호에 동생 (6). 전기차는 크기와 (8)의 생성 메커니즘에 따라 엑소 좀과 같은 마이크로 소포 (조작량) 등을 세포 유래 소포 작은 범주로 분류 될 수있다. MVS가 100~1000를 클수록 동안 세포 유래 소포 개체군의 명칭이 지속적인 논쟁 -8,9- 화제가되고 있지만, 엑소 좀은 일반적으로 소형으로 세포막과 엔도 좀의 융합으로부터 유도 40~100 nm의 입자를 설명한다 나노 입자들은 세포막의 열 발산에 의해 형성되어있다. 여기서, 일반적인 용어 &quot;전기 자동차&quot;는 세포에 의해 세포 외 방출 생물학적 소체의 모든 유형을 참조하는 데 사용된다. 전혈에서 전기차의 분리 다단계 절차 및 다양한 처리 변수는 보관 온도와 기간 (11, 12), 항응고제 / 방부제를 사용하고 (13)를 포함하여 EV 콘텐츠에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다원심 분리 방법 (14)을 사용했다. 이러한 변수의 표준화에 대한 요구가 혈전증 및 지혈 과학 적절한에 대한 표준화위원회 (ISTH SSC) 혈액 처리 및 EV 격리 절차 15, 16에 대한 국제 사회에 의해 추천되었다, 아직 최적의 프로토콜에 연구자간에 합의가 존재하지 않았다 (12)를 사용합니다. 대부분 미리 엄격하게 제어 변수 분석이 정확하고 재현성에 매우 중요한 데이터 있다는 것이 동의. 전기차를 분석하기 위하여, 연구자들은 22, 23, 20, 21 및 웨스턴 블롯 산란 투과 전자 현미경 (17), 주사 전자 현미경 (18,19), 원자력 현미경, 동적 광을 포함한, 다양한 방법을 이용했다. FCM은 많은 연구자 9,24에 대한 선택의 방법이지만 - 인해 높은 처리 능력을 26, FCM을 사용하여 전기 자동차의 분석은있다32 - 그들의 크기와 이산 긍정적 인 인구 27의 부족으로 어렵기로 악명이 높다. 세포의 분석에 비해 필요가 입자 당 항원의 적은 수로 인해 방출 1) 적은 형광의 전기 자동차 결과의 작은 크기와 후 얼룩 세척 2) 제한된 타당성, 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 연구자들 사이 일반적인 문제는 면역 글로불린 집계 (27, 28) 및 항체 (29)의 자체 집계에서 발생하는 신호를 포함한다. 또한, 긴 처리 시간 및 현재 프로토콜 33,34 많은 의해 사용 긴 세척 / 분리 절차는 그들에게 높은 처리량 애플리케이션에 이상적 미만을, 적은 수의 샘플을 분석하기 위해 여러 날 동안의 투입을 요구한다. 일부 연구자들은 정확하게 혈중 알코올 농도를 평가하기위한 형광 물질 하나를 뺀 (FMO)과 항체 이소 타입 쓸모으로 전통적으로 사용 FCM 음성 대조군 렌더링, 모두 세척 단계를 지내다kground 형광 (30). 항체 집계 및 기타 비 소포, 언 바운드 항체를 제거하는 어려움과 식별 할 수있는 긍정적 인 인구의 부족에서 발생하는 신호 : 우리의 프로토콜은 전기 자동차의 적절한 FCM 분석을 방해 할 수있는 세 가지 일반적인 문제를 해결합니다. 여기에 기재된 기술은, 일반적으로 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거하는 신호 대 잡음비를 증가시키고 배경 형광의 검출을 최소화 합리적인 방식으로 게이트를 설정을 지원한다. 두 개의 서로 다른 검출 방법들이 여기에 제시된다 : 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은, 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.

<html> 도 1은 분리 및 비드 기반 방법 또는 개별 검출 방법 중 하나를 사용하여 전기차의 검출을위한 전반적인 프로세싱 방식을 설명. FCM 큰 전기차를 분석 잘 작동하지만 대부분의 세포 계측기 개별적으로 엑소 좀 같이 입자에게 작은을 검출 할 수없는 사용하여 전기 자동차의 개별 감지. 비드 - 기반 접근은 표 1에 요약 된 작은 전기 자동차는, 그러나,이 방법의 사용과 관?...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K 조회수.  Blood Systems Research Institute.  많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다. 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

연구

생물학

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

세포외 소포의 정량화 및 크기 측정을 위한 나노 입자 추적 분석

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...