우리는 IPSC 세대에 전문 지식과 프로토콜을 공유하기 위해, 각각 ChR2 및 Synapsin1-tdTomato 렌티 바이러스 구조에 대한 C. 차이를 K. Deisseroth 및 S. 이인제 감사, 와이오밍 레옹 기술 지원, 공유, 시약 및 전문 지식에 대한 총리 실험실의 구성원. 이 작품은 ELG에 경쟁력있는 연구 프로그램 (002-082 2008 NRF-CRP NRF)에 따라 연구 재단 싱가포르, 애보트 영양과 ELG에 우수 학술 센터 (ACE) 글락소 스미스 클라인 (GSK)에서 연구 수상에 의해 지원과 GJA, 교육, 과학, 한국의 기술 (교육 과학 기술부) 장관의 재원으로 한국 연구 재단의 세계 수준의 연구소 (WCI) 프로그램 (NRF)에 의해 (NRF 허가 번호 : 2009-003 WCI) GJA에

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. 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No conflicts of interest declared.

Optogenetics 뉴런 (13)의 정의 인구의 활성화를위한 시간과 공간 정밀도를 제공합니다. 실험에서, 현미경의 대물 필드는 전체 ChR2 표현 광 자극에만 피질 뉴런에 30 초 동안 조사 하였다. 이 시냅스 연결이 공동 문화 내에서 뉴런의 서로 다른 집단 사이에 형성되었는지를 우리가 결정하는 것을 허용했다. 우리의 결과는 photostimulation이 뉴런 ChR2을 표현하는 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 시냅스 입력을받을 것을 증명하는 IPSC 파생 된 신경 세포 PSC 주파수를 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은, 차례로, IPSC 유래 신경 성공적 피질 뉴런 회로에 통합하는 것이 확립. 본 공 배양 시스템의 생성을위한 몇몇 중요한 단계가있다. 그것은 도금을 진행하기 전에 마우스 NPC 파생 성상 세포 배양, 최소한의 세포 죽음으로 건강 있는지 확인하는 것이 중요하다다른 세포 유형. 대뇌 피질의 신경 세포와 인간의 NPC 건강 성상 세포에 잘 부착 및 전기 생리학 녹음 배양 조건에 크게 의존한다. 이 프로토콜의 다른 주요 단계는 성상 세포 배양 상에 전기와 대뇌 피질의 뉴런의 도금입니다. 다수의 셀이 전기 천공 후 다이로서, 적어도 6,000,000 피질 신경 세포를 24- 웰 플레이트에서 성상 세포 배양 물에 도금을위한 전기 천공되도록하는 것이 중요하다. 우리는보다 적은 세포 6,000,000 일렉트로 때, 뉴런의 생존 수를 전기 생리 학적 기록에 영향을 치밀 신경 네트워크를 형성하지 않은 것을 발견했다. 각 공동 배양 실험을 상이한 시험의 비교를 허용하기위한 전기 천공 피질 뉴런의 수는 일치한다. 소화 효소를 포함하는 모든 단계의 경우, 너무 오래는 세포 죽음으로 이어질 수 있으므로에 대한 소화 용액에서 세포를 남기지 않도록 필수적이다. 이방법은 다른 신경 세포와 시냅스 접촉을 형성하기 위해 환자 별 섬유 아세포 유래의 신경 세포의 기능을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 신경 발달 장애 레트 증후군 (RTT)을 앓고있는 환자에서 섬유 아세포 유래의 신경 세포가 시냅스 전달 결함을 나타낸다 : RTT 뉴런 아마도 인해 덜 시냅스 연결 14 건강한 신경 세포에 비해 PSC 주파수 및 진폭의 상당한 감소를 나타낸다. 우리의 공동 문화 시스템은 발달 결함을 표시하는 신경 세포에 약물 효과를 검사 할 수 있습니다. 이 병에 걸린 사람의 NPC 시드 동안뿐만 아니라 신경 세포의 분화의 시간에 걸쳐 연속 화합물 노광 중에 관심 화합물의 첨가를 통해 수행 될 수있다. 본 공 배양 시스템은 또한 약물 테스트에 대한 모델로서 사용될 수 있지만,이 방법의 한계는 각 후보 화합물의 효과를 조사하는 과정이 길고 지루 수 있다는 것이다그것은 높은 처리량 스크리닝 방법이 아닙니다. 후보 화합물과 치료 후, I​​PSC 파생 뉴런은 개별적으로 PSC를 각 화합물의 효과를 결정하기 위해 패치해야합니다. 또한, 현재 환자의하지 사용할 수있는 많은 섬유 아세포 및 iPSCs있다. 따라서, 환자의 세포를 더 갖고 있으며 높은 처리량 스크리닝이 프​​로토콜을 적응 가까운 미래에 관심이있을 것이다. 예를 들어, 이온 또는 막 전위의 유전자 인코딩 센서 등의 작동 표시와 IPSC 유래의 신경 세포를 라벨링함으로써, 사이드 스테핑 시간이 소요되는 전기 생리 학적 절차에 의해 실질적으로 처리 속도를 높일 수있다. 전기 생리 학적 기록을 수행 아세포 재 프로그래밍에서,이 공존 배양 시스템을 생성하는 전체 프로세스로서, 90 일 이상, 그것은 각각 리 프로그래밍 및 신경 유도 단계 후에, 인간 iPSCs 나 NPC의 하나가 확장 될 것을 권장 필요동결 보존 및 미래 실험에 필요한 시간을 감소시킨다. 우리의 실험에서, 우리는 synapsin1 프로모터에서 대뇌 피질의 신경 세포에 ChR2을 표현했다. 이 프로모터는 팬의 연결이기 때문에, 우리는 아마 모두 억제와 흥분 대뇌 피질의 신경 세포를 photostimulating했다. 미래의 실험의 목적은 구체적으로 흥분성 또는 억제 회로 중 심문하는 경우,보다 특이 적 프로모터가 사용될 수있다. 또한, 대뇌 피질의 신경 세포는 유전자 변형 (또는 바이러스가 주입 된 쥐) ChR2 표현 특별히 신경 세포의 유전자 정의 주민들을 대상으로 얻을 수 있었다. 예를 들어, Cre 호텔 재조합 효소가 마우스에서 수확 대뇌 피질의 조직 ChR2을 표현하는 유일한 대뇌 피질의 신경 세포가 태양 광 발전의 interneurons 15됩니다 상황을 얻을 것입니다 floxed ChR2와 마우스로 교차 parvalbumin 함유의 interneurons (태양 광 발전의 interneurons)로 표현. 이러한 ChR2 발현 우리에서의 interneurons을 공동 CU의 사용lture 시스템 패치 IPSC 유래 뉴런의 PV의 interneurons와 회로에 통합 할 수 있는지 여부의 판단을 가능하게 할 것이다. 이전 연구 (9)을 바탕으로, 대뇌 피질의 신경 세포는 체외 14 일 후에 수상 돌기 겹치는 성숙. photostimulation 패치 된 IPSC 유래 신경 세포 반응을 유발하지 않는 경우 즉, 그것은 뉴런 피질 뉴런과 시냅스 연결을 할 수있는 능력을 갖고 있지 않음을 표시한다. IPSC 파생 된 신경 세포는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 또는 대뇌 피질의 신경 세포에서 하나의 시냅스 입력을 수신 할 수있다. 전통적인 패치 클램프 기록을 사용한 경우, 시냅스 입력이 어디에서 오는 구별 할 수 없을 것이다. 우리의 시스템의 장점은 피질 시냅스 입력에서 시냅스 반응은 선택적으로 유발하고 식별 할 수있다. 여기에 설명 된 절차를 통합하는 IPSC 유래 신경 세포의 능력을 평가하는 간단한 방법을 제공한다정의 된 신경 네트워크에.

최근 몇 년 동안, 신경 세포와 신경 회로 기능에 대한 우리의 이해는 신경 세포의 흥분을 제어하는​​ 여러 optogenetic 도구에 의해 혁명되었습니다. 이러한 도구 중 하나가 빛 활성화 양이온 채널입니다, channelrhodopsin-2 (ChR2) : 가벼운 자극 1-3 응답 ChR2 화재의 활동 전위를 표현하는 뉴런. 신경 세포는 빛에 일반적으로 구분하지 않습니다 때문에,이 놀라운 능력은 뉴런 4의 유전자 정의 인구의 활동의 정확한 시간적 및 공간적 제어를위한 새로운 길을 열어 크게 뇌 기능의 연구를 가속화하고있다. ChR2 신경망 (6)의 활동을 조절에 신경 개발 5 모니터링에서, 서로 다른 목적을위한 줄기 세포 연구에 적용되고있다. 여기서 우리는 신경 세포 공동 배양 시스템의 유용성을 높이기 위해 ChR2을 사용했다. 공동 문화 시스템은 서로 다른 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 평가를 할 수 있습니다.신경원과 신경교의 공동 배양, 신경계의 주된 세포 유형은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 간의 시그널링을 조사 할뿐만 아니라 생리적 반응이 시그널링의 중요성을 평가하기 위해, 손상 및 전파를 조사하는 데 사용 잠재적으로 7 시그널링에 관여하는 분자 메커니즘. 이전 연구는 인간의 iPSCs 쥐 대뇌 피질의 차 문화를 포함하는 신경 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포 (8)의 존재에 신경 세포에 매우 빠르게 분화 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에서 파생 된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 뉴런 사이의 시냅스 연결을 심문하기 위해 공동 배양 시스템에서 ChR2을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성상 세포로 해부하는 단계와 수확 뇌 조직 (9)뿐만 아니라 마우스 신경 전구 세포를 유지하고 차별화 (NPC들)을 설명하고 인간의 NPC 값 int오 신경 세포 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 본 공 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 오키타 동부 등에 의해 설명 된 통합 무 리 프로그래밍 방법을 사용 하였다. 10 인간 iPSCs를 생성하기. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 선택된 iPSCs는 효율적 소분자 억제제를 사용하여 화학적으로 정의 된 조건에서의 NPC를 분화시켰다. 11 공동 문화에서 신경 세포의 다른 인구 토마토 (tdTomato) 이량 체 형광 단백질, 탠덤를 통해 IPSC 파생 된 신경 세포의 대뇌 피질의 뉴런에서 ChR2 표현의 감지 및 태그를 통해 확인할 수있다. 피질 뉴런의 optogenetic photostimulation와 IPSC 유래 뉴런으로부터 전기 생리 레코딩 결합 서로 회로를 형성하는 뉴런이 두 가지 유형의 능력을 평가할 수있다. 특히, 대뇌 피질의 뉴런 ChR2가 발현의 photostimulation는 시냅스 회로를 형성 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 반응을 불러 일으킨다광 여기 대뇌 피질의 신경 세포 네트워크와. 우리는 증가 된 시냅스 후 전류가 실제로 이러한 조건에서 IPSC 파생 된 신경 세포에서 발견되는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 병 환자로부터 유래의 섬유 아세포를 이용하여 iPSCs 다른 신경 학적 질병 모델의 재현부 포함한 실험 조건 하에서 다양한 시냅스 회로의 평가를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Neurocult Proliferation Kit (Mouse)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement</td></tr><tr><td>Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>MEM without glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Human LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Research Grade FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>For astrocyte differentiation medium</td></tr><tr><td>Defined FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>For primary neuron medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>For primary neuron medium</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>For harvesting brains</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m filter unit</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>For electrophysiological studies</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>For electrophysiological studies</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 flasks</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm cover glasses</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>For electroporation of primary cortical neurons</td></tr><tr><td>Neon Transfection System&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>For electroporation of human fibroblasts</td></tr><tr><td>Mini Analysis&amp;nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>For measurement of PSCs</td></tr><tr><td>Normal Dermal Human Fibroblasts</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Mercury short-arc lamp</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

여기서, 성상 세포로 구성된 공존 배양 생성에 관련된 여러 단계를 설명하는 프로토콜, 및 인간 대뇌 피질 뉴런 뉴런 도시된다. 인간 iPSCs 고밀도 (그림 1A)에서 유지되었다 NPC들 (11)을, 작은 분자 억제제의 칵테일 신경 계통에 에피 솜을 사용하여 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하여 얻은 10 벡터 및 지정되었습니다. tdTomato (그림 1B) 태그 인간의 NPC의 성상 세포에 마우스의 NPC의 차별화, ChR2을 표현하는 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 도금 및 시드 : 몇 가지 단계가 공동 문화를 생성해야합니다. 분화 일 2시, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) + 성상 세포는 쉽게 우리의 문화 (그림 1C)에서 관찰 할 수있다. 마우스의 NPC는 성상 세포 단일 층 (그림 1D)에 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포를 도금하기 전에 적어도 일주일 차별화시켰다. 3 후인간의 NPC 분화의 사주로, tdTomato + 뉴런은 문화 (그림 1E)에서 검출되었다. 이 공동 문화 시스템은 빛의 자극 (그림 2A)에 대응하여 개별 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 전류의 일관성을 검출 할 수있다. 빛에 의해 자극되면, 활동 전위는 ChR2 (그림 2B)를 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포에서 생성되었다. 전류 펄스를 탈분극의 진폭 증가 활동 전위 소성을 보여 뉴런도 (그림 2C) 고르기가 있습니다 IPSC 파생 (그림 2D)를 증가 하였다. 따라서, 이들 세포는 성숙한 신경 특성을 나타낸다. 광 부재에서 IPSC 유래 신경 자발 시냅스 입력 (도 2e)을 받았다. GABA 수용체를 통해 전류가 외부 것이기 때문에이 안쪽으로 시냅스 전류는 주로, AMPA 수용체에 의해 매개하고 NMDA 수용체는 전류를 운반하지 않습니다-70 MV의 유지 가능성을 t. 빛 자극이 크게 시냅스 후 전류 (그림 2E)의 주파수를 증가하기 때문에 적어도 이러한 입력의 일부는, ChR2 표현 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 있었다. 시냅스 입력의 증가의 시간 과정은 그림 2 층에 표시됩니다 : 대뇌 피질의 뉴런의 photostimulation은 30 초 긴 빛 플래시에 걸쳐 지속되었다. ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런 (그림 2G) 광 여기 때 PSC를의 주파수가 상승하는 동안, 자신의 진폭 (그림 2H)의 영향을받지이었다. 요약하면, 이러한 결과는 IPSC 파생 된 신경 세포가 성숙한 신경 세포의 특성을 나타내과 연접 대뇌 피질의 뉴런과 시냅스 연결을 형성 할 수 있음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 공동 문화의 생성을위한 개략도iPSCs 및 NPC들에 신경 유도로 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그래밍 시스템. (A) 타임 라인. 대뇌 피질의 신경 세포와 성상 세포 문화에 성숙한 신경 세포로 인간의 NPC의 터미널 차별화를위한 (B) 타임 라인. (C) 마우스의 NPC가 빠르게 GFAP로 분화 + 성상 세포 (2) 후 체외에서 일. (D) 일주 후, ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포가 GFAP + 성상 세포에 배양 하였다. (E) 4~5주에서 인간의 NPC의 분화 후, 전기 생리학 녹음은 tdTomato + 뉴런에서 수행되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 기능 시냅스 연결의 Optogenetic 분석. tdTomato (빨간색) 태그 (A) IPSC 유래 세포는 대뇌 피질의 신경 세포가 발현와 공동 배양 한 빛 활성화채널 ChR2 (녹색). IPSC 파생 된 신경 세포에서 녹음은 대뇌 피질의 신경 세포 또는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 하나에서 올 수 시냅스 전류 (PSC) 응답을 밝혔다. (B) 조명 (파란색 막대)는 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포의 활동 전위의 시리즈를 유발. ( C) IPSC 유래 세포 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 신경 세포 (E) Photostimulation (파란색 막대). IPSC 파생 된 세포의 전류 곡선 대 D) 발사 (. 전류 주입에 의해 유발 IPSC 파생 된 신경 세포에서 PSC를의 주파수를 증가 . photostimulation 의해 제조 PSC 주파수의 증가 (F) 경시. 블루 바는 photostimulation의 시간을 나타냅니다. PSC 주파수 photostimulation (G) 증가 동안 (G, H), PSC 진폭은 영향을받지 않습니다 (H)이었다. * P &lt;0.05는 학생의 t-test로 대조군에 비해 나타냅니다.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.4K 조회수.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 

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Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

연구

신경과학

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

생물학

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

발생학

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

 CNS 상호작용 연구를 위한 1차 미세아교세포 및 뉴런 공동 배양 프로토콜

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

저자 스포트라이트: 질병 상태에서 미세아교세포-신경 세포 상호 작용을 연구하기 위한 체외 공동 배양 모델

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

A Co-culture Technique for Differentiating Human Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Su, C. T. E., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52408">An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a method to differentiate human neural progenitor cells (NPCs) into neurons. The NPCs are introduced onto an established mouse astrocyte-rat cortical neuron co-culture, promoting NPC differentiation into neurons. The differentiation is confirmed by visualizing the cells under a confocal microscope.

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

1. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells

	Culture human fibroblasts in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) in 6-well plates.
	...

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

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다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술