Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

참고 :이 프로토콜을 검토하고 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다. 수정 크렙스 솔루션 및 시험 약물 분취 1. 준비 <ol><li> 117.9의 NaCl, 4.7 KCl을 25의 NaHCO3, 1.3의 NaH 2 PO 4, 황산 1.2, 2.5 CaCl2를 11.1 D 글루코오스, 2 소듐 뷰티 레이트, (20), 아세트산 나트륨 (mm 단위)가 포함 개질 크렙스 용액 6 L 만들기 0.004 니페디핀 (자발적인 근육의 수축을 차단하기 위해), 0.003 인도 메타 신 (indomethacin)은 (내인성 프로스타글란딘의 합성을 차단하기 위해). 각각 조직의 절개 및 단일 섬유 녹음, 얼음처럼 차가운 따뜻한 크렙스 솔루션을 사용합니다. </li><li> 모든 화학 용액을 준비 (예를 들어, IS, 캅사이신, ATP) 원하는 농도로 분액. </li></ol> 대장 직장 - 신경 조직의 2 해부 <ol><li> 마취 및 수컷 마우스 안락사 (6-8주 이전, 20~30g)에서를10 변위 유량 CO 2 실 - 생쥐까지 분당 챔버 체적의 30 %는 가슴 움직임의 부재로 나타내는 바와 같이 호흡 완전히 멈춘다. </li><li> 즉시, 흉부 챔버를 개방 절단 우심방을 천공하고, 얼음처럼 차가운 크렙스의 충분한 볼륨 (~ 500 ml)에 마우스 시체를 침지 안락사,에게서 피를 뽑다 다음 (4 ° C) 솔루션은 carbogen (95 % O 2 버블 5 % CO 2). </li><li> 조심스럽게 모든 내장 그러나 콜론과 골반 장기를 제거합니다. 약간 횡격막 위 T12 척추 분절에 걸쳐 반 마우스 횡단면과 빙냉 함유 해부 챔버에 꼬리 절반을 전송하고, 크렙스 용액을 버블. </li><li> 실체 현미경 아래에서 요도에 자신의 접합에에 병행하여 방광 및 생식 기관을 제거하고 총장 골 동맥으로 분기합니다 때까지 하강 / 복부 대동맥을 제거합니다. PN 또는 surroundin에서 LSN 무료g의 무딘 절개하여 조직과 L6 및 S1 척추 (PN)에 열 또는 T13과 (LSN)에 L1 척추에 자사의 복부 진입 점까지 장골 외부에서 신경을 따릅니다. </li><li> 치골 치골 좌우 비구 관절을 잘라 및 장골 뼈를 제거합니다. 신경이 척추를 입력 어디까지 대장 직장 가까이에서 첨부 된 근육과 결합 조직에서 하나 PN 또는 LSN 조심스럽게 무료. </li><li> 조심스럽게 원위부 대장 직장을 노출 장골 뼈를 절제. 연속체에 부착 된 PN 또는 LSN과 원위부 대장 직장을 해부하다. </li><li> 티슈 챔버의 욕조에 부착 함과 함께 신경 대장 직장 전송. 더 해부 과도한 결합 조직을 제거하고 방지 장간막 국경을 따라 길이 방향으로 대장 직장을 엽니 다. </li><li> 이 위를 향하도록 점막면, chambe의 실리콘베이스에 기록 구획에 인접한 대장 직장의 장간막 가장자리를 고정R 및 힘은 액추에이터에만 연결 후크 긁어 대장 직장의 길이 antimesenteric 부착 (도 1에 도시되고도 2a에 촬영). </li><li> 마우스 홀 및 게이트에 의해 목욕 구획에 연결되는 기록 구획에 PN이나 LSN 연장. 부드럽게에 신경을 준수 할 수있는 친수성 ​​표면을 제공 녹화 실에서 작은 유리 거울에 신경 트렁크를하다. 따뜻한와 목욕 구획 Superfuse (30-32 ° C가), 크렙스 솔루션을 산소와 미네랄 오일과 기록 구획을 입력합니다. </li></ol> 3. 단일 섬유 녹음하고 받아들이는 필드의 현지화 <ol><li> 조심스럽게 높은 배율 (- 60X 50)에 입체 현미경 PN 또는 LSN에서 epineurium (신경초)를 벗겨. ~ 100 ㎛ 두께의 8 신경 다발 - 미세 집게를 사용하여, 5에 신경 트렁크를 애타게. </li><li> 백금 - 이리듐 참조를 배치티슈 챔버 크렙스 용액과 접촉하는 전극. 순차적으로 동일한 재료로 이루어진 기록 전극 상 개별 신경 다발을 배치. </li><li> 부드럽게 쓰다듬어에 의해 대장 표면 아래로 대장 구 심성에서 AP를 보여주고 부드러운 페인트 브러시를 사용합니다. 검출 AP (활동 전위) 녹음을 통해 콜론에 분포 신경 다발 (들)를 찾습니다. 참고 : PN과 LSN은 또한 방광과 골반 장기에 분포. </li><li> 추가로 10 μm의 두께 ~ 미세 필라멘트 다발로 신경 다발을 분할하고, 기록 전극 상 개별 필라멘트를 배치 30 G 바늘 팁의 쌍을 사용한다. </li><li> 전기적 현재 확산의 ~ 2mm 반경을 생산 초과 임계 자극 강도 (10mA 크기, 0.3 Hz에서 @ 0.5 밀리 초 시간)에서 구 심성 엔딩을 자극하는 점막 표면에 수직 라운드 팁 동심 전극을 배치합니다. 체계적 (~ 1.5 mm 단계를 전극 이동) 평평 대장 직장의 길이와 폭을 따라 수용 엔딩 현지화. </li><li> 구 심성 결말이 흥분 할 때, 최소한의 자극 강도 (자극 임계 값)이 필요 활성화 (수용 필드, RF)의 위치를​​ 정확히 파악할 수있는 전극의 위치를​​ 조정합니다. &gt; 3mA (19) 자극 임계 값 엔딩을 폐기하십시오. </li><li> 자극 인공물과 활동 전위의 발병 사이의 전도 속도 1 ~ (CV)) 수용 필드 (RF)에서, 자극 전극 및 상기 기록 위치, 2) 전도 지연 (예를 들어,도 2B의 간격)를 계산 . CV (m / 초) = 거리 (mm) / 전도 지연 (밀리 초). </li></ol> Mechanosensitive 대장 구 심성의 4 기능 분류 <ol><li> 전기 자극에 의​​한 RF를 찾은 후, RF에 다음과 같은 세 가지 기계적인 자극을 적용 <ol><li> CALIBRA의 끝을 눌러 프로빙 자극을 실시테드 프레이 같은 나일론 모노 필라멘트 (0.4 1g의 힘) 수직으로 평탄화 된 대장 직장에서 RF쪽으로. </li><li> 부드럽게 RF에 작은 표면 전단 응력을 생성하는 좋은 나일론 필라멘트 가닥 (10 mg의 힘)으로 대장 점막을 쓰다듬어하여 쓰다듬어 자극을 실시한다. </li><li> 경 스트레칭 력을 얻어 컴퓨터 제어 동력 액츄에이터를 이용하여 원주 연신을 실시 - 단계 2.8에 기재된 후크 퀴 통하여 대장 직장의 항 장간막 가장자리를 따라 원주 방향 (0~5 mN의 / 초에서 170 MN) . </li></ol></li><li> 장막으로, 점막을 (프로빙 둔 만 응답) 구 심성을 분류 근육 (원주 스트레칭에 대응하고 프로빙 둔) 근육 / 점막을 (원주 스트레칭, 점막 쓰다듬어에 대응하고 프로빙 둔), 또는 (쓰다듬어 점막 및 프로빙 둔 응답) MIA (세 기계적 자극의에 반응하지 않음). </li><li> 만에 (장간막 구 심성의 경우어려운 LS​​N의 신경 분포)은 전기 자극에 의​​해 선택적으로 활성화 장간막의 프로빙 / 기계 쓰다듬어하여 수용 엔딩을 찾습니다. </li><li> 스트레칭에 민감한 구 심성 (근육과 근육 점막)의 경우, 경 스트레칭 중 첫 번째 AP를 불러 일으키는 힘으로 정의 된 응답 임계 값을 결정합니다. </li><li> 장막 심성 들면, 컴퓨터 제어 동력 구동되는 액추에이터에 의해 수용 필드의 프로빙 점상의 수준을 상승 그들의 응답을 기록. </li></ol> 받아들이는 엔딩 5. 화학 응용 프로그램 / 변조 <ol><li> 기계적인 자극에 대한 기본 응답을 기록 (즉, 경 스트레칭, 프로빙 반점, 또는 점막 쓰다듬어에 응답). </li><li> 코트 바닥 튜브 (10mm 높고 4 × 4mm 2 정사각형 또는 4 황동 또는 스테인레스 스틸, - 5 mm 직경)의 조각의 가장자리에 바셀린과 대장 직장의 수용 필드 위에 놓습니다. </li><li> 제거화학 물질 (들)을 검사 할 함유하는 용액을 5 분에 170 μL - 크렙스 내부 튜브 용액 및 3에 대해 수용 결말을 노출. </li><li> 화학 응용 프로그램 중 심성의 반응을 모니터 (일부 구 심성은 chemosensitive 있습니다). </li><li> 화학 물질의 작용을 정지하고, 약액 튜브를 제거한다. 내 4 - 6 분, 기준선 응답과 동일한 기계적 자극에 대한 구 심성 응답을 테스트한다. </li><li> 워시 아웃의 충분한 기간 (&gt; 15 분) 후 다시 기계적인 자극을 다시 적용합니다. </li></ol> 6. 녹음 및 차별 AP 스파이크 <ol><li> 20 kHz에서 축삭에서 기록 된 전기 신호를 디지털화하여 컴퓨터에 데이터를 저장한다. 오디오 모니터에 의해 온라인 신호를 모니터링합니다. </li><li> 오프라인 AP 스파이크를 분석하고 개별 스파이크 파형 (25)의 주성분 분석을 기반으로 하나의 단위를 구별. 참고 : 하나의 기록이 일 더 이상 포함되어야합니다두 쉽게 식별 가능한 활성 단위. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 체외 대장 직장 - 신경 준비는 잘 내장 감각 신경에 다른 비 기능적 접근 방법 (예를 들면, 세포 분자, 조직 학적 연구)를 보완 개별 대장 구 심성 신경의 신경 인코딩 기능 (연구 할 수있는 강력한 방법이 될 입증되었습니다 ) 자세한 내용은 리뷰 27을 참조하십시오. 통각 및 장기 대장의 과민 반응에 기여하는 신경 메커니즘은 밝혀지지하고 약리 조작은 내장 통...

통증 과민 명백 병인 학적 원인이나 조직 손상의 유무에 존재 과민성 대장 증후군 (IBS)을 포함하여 위장 기능 장애로부터 고통받는 환자의 주된 불만이다. 예를 들어, IBS 환자 (복부의 촉진에 즉, 부드러움) 정상적인 장 기능 동안 직장 풍선 팽창 증가 감도 높게 응답을 포함하는 과민 반응,뿐만 아니라 체세포 추천의 과민 반응을 나타내는 일. 의 개선 이해, 대장 구 심성을 대상으로하는 IBS 환자에서 (구 아닐 레이트 사이 클라-C의 효능 linaclotide 4-6 경구 섭취 예를 들어, 국소 마취제 2,3의 내 직장 점안을) 통증과 과민을 완화에 효과적 일 수 있기 때문에 대장 직장의 구 심성 신경 분포가 중요합니다. 대장의 구 심성을 포함하여 내장 구 심성,/ nutrient- 화학적 및 열적 양상 (예를 들면, 7-9)에 응답 할 수있다. 그러나, 기계적 자극 (즉, mechanosensitive 구 심성)에 응답 내장 구 심성이되었습니다 기계적 자극 (예를 들어, 내강 팽만, 스트레칭) 일반적으로 불편과 고통 10-16을 포함하여 의식이 감각에 야기 할 것들이기 때문에 가장 철저하게 연구했다. 또한, 내장은 일반적으로, 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)에 의해 신경 지배를 자동 또는 자고 통각 수용기 (17)이라고합니다. 정상적인 생리 조건에서, 실종자는 기계적인 자극에 응답하거나 매우 높은 응답이 18 임계 값이 있지만 활성화 및 병태 생리 학적 조건에서 mechanosensitivity를 획득 과민 반응에 공헌 할 수 없습니다. 여기에 설명 된 시험 관내 제조 방법 및 프로토콜을 이용하여, 우리는 개발 바다 전기 자극 전략을 채용<html> 대장 직장 (19) 모두 mechanosensitive 및 MIA 엔딩의 편견 식별을 가능하게 수용 엔딩에 대한 RCH. 대장 신경 분포는 요추 내장의 (LSN)과 골반 신경 (PN) 경로에서 파생 다섯 mechanosensitive 클래스 (장막, 점막, 근육, 근육 점막, 장간막) 한 MIA 클래스 (20)으로 분류 할 수있다 대장 구 심성을 포함한다. 이 체외 준비를 사용하여, 우리는 대장 실종자 인수 mechanosensitivity는 LSN 경로에 PN 경로에서 실종자의 71 %와 실종자의 23 %를 증감 염증 수프 (IS), 그들의 수용 필드의 짧은 노출 다음 (민감) 발견 19. 우리는 또한 오래 지속되는 행동 내장 과민 반응의 맥락에서 실종자의 장기 감작 (최대 28 일) 문서화 (모산 (21) 또는 2,4,6- 트리니트로 산으로 결장 내 치료를받은 쥐에서, 즉 (TNBS) 22) . mechanosensitive 구 심성 신경, 근육과 근육 점막 구 심성 중 jove_content은 &quot;&gt; (즉, 스트레칭 구분) 및 유해 대장 팽만 (23, 24)의 인코딩을 보조하다 카나비노이드 대장 직장의 원주 스트레치를 인코딩 할 수있는 유일한 클래스입니다. 컴퓨터 제어를 사용하여 동력 액츄에이터, 우리는 평면화 대장 암 조직의 원주 방향의 표준, 균질하고 재현성 램핑 신축성을인가하고 상기 스트레치 성 구 심성을 낮은 임계치와 높은 임계치 (23)를 분류. 또, 신축성 감작를 시간 경과에 따라 결장 내 모산 21 TNBS (22) 치료 후 과민 구 심성은 내장 통증 및 과민 반응의 스트레칭에 민감한 대장 구 심성의 역할을 제안, 행동 내장 과민 반응의 시작, 지속, 및 / 또는 복구에 해당합니다.

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 stereo microscope</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D camera</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Low-noise differential amplifier</td></tr><tr><td>Two-compartment tissue chamber</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Data acquisition, analog signal input/out</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Software package that works with the Power1401</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Natus</td><td>Am 8</td><td></td></tr><tr><td>Square pulse stimulator</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Photoelectric isolation unit</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Stimulus isolation to reduce noise</td></tr><tr><td>Concentric bipolar microelectrode</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>To deliver electrical stimuli</td></tr><tr><td>Dual-mode lever system</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Series 300C</td><td>To deliver mechanical stimuli</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Forceps with fine tips</td></tr></tbody></table>

in vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings

이 비디오 상세히 마우스 대장 직장 - 신경 제제를 사용하여 시험 관내 전기 생리 단일 섬유 기록 프로토콜을 설명한다. 접근 방식은 편견 식별 및 개별 대장 구 심성의 기능을 특성화 할 수 있습니다. 하나 또는 몇 심성에서 발생하는 전파 활동 전위 (APS)의 세포 외 녹음 (즉, 단일 섬유) 대장 직장에서 수용 필드 (RI의)을 조롱 신경 섬유 다발로 만들어진다. 대장 직장은 골반 (PN) 또는 요추 내장의 (LSN) 신경 부착 길이 방향으로 열 중 하나를 제거한다. 조직 플랫 피닝 및 산소화 크렙스 용액으로 관류, 기록 챔버에 배치된다. 초점 전기 자극은 기능적으로 다섯 mechanosensi에 구 심성을 분류 (프로빙 점막 쓰다듬어 원주 스트레칭을 무디게) 더 세 가지 기계적인 자극에 의​​해 테스트 대장 구 심성 엔딩을 찾는 데 사용됩니다적인 클래스를 제공합니다. 이러한 기계적 자극 없음에 응답 엔딩 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)으로 분류됩니다. 화학 물질에 대한 RI의 지역화 된 노출에 의해 mechanosensitive 및 실종자가 과민 반응 (즉, 향상된 응답 감소 임계 값 및 / 또는 mechanosensitivity의 취득)에 대한 평가 될 수는 모두 (예를 들어, 염증 수프 (IS), 캡사이신, 아데노신 삼인산 (ATP)). 우리는 장비와 대장 직장 - 신경 기록 준비, 부착 PN 또는 LSN, 신경 다발에서 대장 직장, 단일 섬유 녹음에 RI의 식별과 대장 직장의 수확 및 RF에 화학 물질의 지역화 된 응용 프로그램을 설명합니다. 또한, 표준화 된 제조 기계적 자극의 적용 과제도 논의된다.

설치는 그림 1에 예시되어있다. 그것은 실리콘 늘어선 목욕 구획 및 연속 미네랄 오일 충전 실에 첨부 된 신경의 대장 직장을 수용하는 맞춤형 조직 챔버를 포함한다. 두 챔버는 구획 CNC 기계에 의해 아크릴 수지의 고체 블록으로부터 기계 가공 하였다 두 구획의 바닥이어서 결장 조직 다운 핀을 쉽게 허용하도록 기업 실리콘 늘어서 하였다. 조롱 신경 다발에서 세포 외 AP는 공통 모드...

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In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

9.5K 조회수.  University of Pittsburgh. This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation. 

비디오: In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Flexible Colonoscopy in Mice to Evaluate the Severity of Colitis and Colorectal Tumors Using a Validated Endoscopic Scoring System

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental endoscopy has been highly useful for studies that require repeated assessments in a single laboratory animal, such as those evaluating mechanisms of chronic inflammatory bowel disease and the progression of colorectal cancer. However, the methods used across studies are highly variable. At least three endoscopic scoring systems have been published for murine colitis and published protocols for the assessment of colorectal tumors fail to address the presence of concomitant colonic inflammation. This study develops and validates a reproducible endoscopic scoring system that integrates evaluation of both inflammation and tumors simultaneously. This novel scoring system has three major components: 1) assessment of the extent and severity of colorectal inflammation (based on perianal findings, transparency of the wall, mucosal bleeding, and focal lesions), 2) quantitative recording of tumor lesions (grid map and bar graph), and 3) numerical sorting of clinical cases by their pathological and research relevance based on decimal units with assigned categories of observed lesions and endoscopic complications (decimal identifiers). The video and manuscript presented herein were prepared, following IACUC-approved protocols, to allow investigators to score their own experimental mice using a well-validated and highly reproducible endoscopic methodology, with the system option to differentiate distal from proximal endoscopic colitis (D-PECS).

Over the past few years, new generation endoscopes have emerged as important diagnostic research aids for evaluating murine colitis and colorectal tumors. We present herein a detailed protocol for endoscopic assessment of inflammation and colorectal tumors in mice, as well as a novel scoring system that uses decimal identifiers to document the endoscopic severity of colitis and colorectal tumors.

검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

The use of modern endoscopy for research purposes has greatly facilitated our understanding of gastrointestinal pathologies. In particular, experimental ...

연구

의학

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

신경과학

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

마우스 헤어 난포 피침 엔딩에서 기계적으로 자극 된 수입 성의 산출과 신경 터미널 라벨의 결합 기록

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

마우스 Jejunal과 대장 세그먼트에서 장간막 구 심성 신경 활동의 생체 외 녹음에서

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

생체 외에서 쥐에 있는 저 승 구심 성 섬유의 Electrophysiological 속성의 특성

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the protocol for in vivo calcium imaging of the exposed DRG in response to various visceral and somatic stimuli. Pirt-GCaMP6s mice or C57BL6 mice intrathecally injected with AAV viruses packaged with GCaMP6s were utilized to capture Ca2+ transients. The amplitude of these transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. Afferent fibers originate from internal organs, with primary neuronal cell bodies in spinal or vagal ganglia. Studies on visceral nociception and acupuncture analgesia can potentially be conducted on primary sensory neurons using advanced imaging technologies like in vivo calcium imaging, allowing for the recording of neuronal activity ensembles in the intact animal during stimulation or intervention. The responses of DRG neuron ensembles to somatic and visceral stimuli applied to their corresponding receptive fields were recorded. This technique illustrates how neuronal populations react to various types of somatic and visceral stimuli. It is possible to comprehensively compare neuronal ensemble responses to different stimuli, which is a particularly valuable approach in research on visceral pain and segmental mechanisms of somatic stimulation, such as acupuncture.

The present protocol outlines in vivo calcium imaging for measuring the responses of ensembles of lumbar-6 DRG neurons to somatic and visceral stimuli. Thorough comparisons can be made among neurons responding to different stimuli. This protocol is valuable for investigating mechanisms of visceral pain and somatic stimulation, such as acupuncture.

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

생물학

Generation of Mouse Proximal Colon Loop Model: A Surgical Procedure to Generate Proximal Colon Loop and Measure Intestinal Permeability by Detection of Fluorescent Markers in Serum Following Intraluminal Injection

Source: Boerner, K. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/62093">Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a surgical procedure to generate mouse proximal colon loop or pcLoop segment followed by intraluminal injection of fluorescent markers into the segment to study the intestinal epithelial permeability.

Mouse Proximal Colon loop Model의 생성: 내강내 주사 후 혈청 내 형광 마커를 검출하여 근위 결장 루프를 생성하고 장 투과성을 측정하는 수술 절차

Source: Boerner, K. et al. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Rodent Models

Adult

Electrophysiological Recording from Colonic Afferent Nerves in an Ex Vivo Rat Colon

Source: Meng, Y. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56090">In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to record the activity of colonic afferent nerves in an ex-vivo rat colon, cannulated at both ends and infused with saline to increase intraluminal pressure. As pressure increases, the nerve signal rises, indicating its stimulation.

생체 외 쥐 결장에서 결장 구심성 신경의 전기생리학적 기록

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Neuroscience

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in an Ex Vivo Mouse Jejunum Segment

In this procedure, using a micromanipulator, lower the tip of the suction electrode into the organ bath. Then, gently aspirate some Krebs solution from the organ bath so that the tip of the electrode is submerged in the Krebs solution. Ensure that the Krebs solution covers the wire electrode inside the suction electrode.
Next, position the tip of the suction electrode immediately next to the transected afferent nerve strand, and draw the transected nerve strand into the capillary over its entire length. Maneuver the tip of the electrode towards the adipose tissue, and aspirate it into the glass capillary with the plunger, thereby mechanically sealing the nerve in the capillary from the contents of the organ bath.
To verify the recording of afferent nerve activity, perform a ramp distension-induced increase in afferent firing by closing the output port to lead to a gradual rise in pressure in the intestinal segment. Only perform the desired experimental protocol when three consecutive ramp distensions yield a reproducible multi-unit discharge.