저자는 원고에 대한 의견에 대한 제프리 파렐, 제임스 가뇽, 제니퍼 버그만에게 감사의 말씀을 전합니다. KWR는 FDAP 분석의 개발 기간 동안 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 활동 프로그램에 의해 지원되었다. 이 작품은 AFS에 NIH로부터 보조금과 독일 연구 재단 (에미 뇌터 프로그램), 막스 플랑크 사회, 오후에 인간 프론티어 과학 프로그램 (경력 개발 상)에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. Photoconvertible 퓨전 구축 및 삽입하기 Dechorionated Zebrafish의 배아를 생성 <ol><li> 다음 뮐러 등., 2012 (19)에서와 같이 융합 단백질을 코딩하는 캡핑 된 mRNA를 생성하는 시험 관내 전사를 사용하여, 녹색 대 적색 photoconvertible 단백질 (설명 참조)에 융합 된 관심있는 단백질을 함유하는 기능성 구조체를 생성한다. </li><li> 하나의 세포 단계에서 약 30 제브라 피쉬 배아에서 chorions을 제거하는 프로 나제​​를 사용합니다. 또한, 수동 집게 (28)를 사용하여 배아를 dechorionate. 주 : 태아의 후속 이미징 dechorionated해야합니다. 원하는 경우, 배아는 촬상 직전에, 나중에 융모막 통해 주입하고 dechorionated 수있다. <ol><li> 표준 제브라 피쉬 배아 매체 (19)의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) griseus의에서 프로 나제의 5 ㎎ / ㎖ 원액을 확인합니다. 10 분은 단백질 분해 효소가 분해 할 수 있도록하기 위해 부드럽게 실온에서 솔루션을 바위. 나누어지는 2m-20 ° C에서의 microcentrifuge 튜브에 L과 동결. </li><li> 배아 ~ 8 ml의 배지를 함유 5cm 직경 유리 또는 코팅 된 플라스틱 아가 페트리 접시로 이동 한 세포 단계 배아. 접시에 해동 프로 나제​​ 원액 2 ㎖를 추가하고 5 ~ 10 분 동안 실온에서 품어. </li><li> dechorionated 배아가 파열 될 것 중 하나와 접촉으로, 공기 또는 플라스틱으로 배아를 노출시키지 마십시오. 배아 매체와 200ml의 유리 비커를 입력합니다. 매체에 침수 동안 배양 접시를 기울여 비커에 배아를 전송합니다. </li><li> 배아는 비커의 바닥에 정착 한 후, 다음 비커에 신선한 배아 매체를 부어, 배아 매체의 대부분을 부어. 비커에 쏟아져 매체의 가벼운 소용돌이는 배아가 약화 chorions을 잃게됩니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.4. </li></ol></li><li> 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 코팅 분사 요리 (29)에 dechorionated 배아를 전송합니다. 불타는피펫 팁은 부상 배아에서 가장자리의 계단 현상을 방지 할 수 있습니다. </li><li> (그림 1B, 제안 mRNA와 Alexa488 - 덱스 트란 양의 토론 참조) mRNA와 3 kDa의 Alexa488 - 덱스 트란 결합체 (29, 30)을 공동-주입. 분열이 시작되면도의 mRNA의 분포와 형광 염료를 보장하기 위해 셀 (안 노른자)의 중심에 직접 주입한다. 주 : Alexa488 신호는 세포 내 및 세포 외 형광을 구별하기 위해 구획되지 마스크를 생성하기 위해 데이터 분석에서 사용된다. </li><li> 배아 매체 가득 여섯 아니라 플라스틱 접시의 1 ~ 2 % 아가로 오스 코팅 잘로 전송 주입 배아. 배아 늦게 구 단계 31 (약 5 시간 포스트 수정을)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 어둠 속에서 품어. 실체 현미경을 이용하여 배아마다 한 2 시간을 확인하고 사망 한 배아에 의해 생성 된 이물질을 제거합니다. </li></ol> 2. P에 대한 Zebrafish의 배아를 장착거꾸로 공 초점 현미경에 hotoconversion 및 이미지 <ol><li> 1-5 배아 건강을 식별하고, 접시에서 제거 골조 팁 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 실체 현미경을 사용한다. </li><li> 부드럽게 1X Danieau 배아의 매체에 용해 1 % 저 융점 아가로 오스 ~ 1㎖를 함유 마이크로 원심 분리 튜브로 배아를 토출 (도 2a) (자재 목록 참조). 참고 : 아가로 오스 40, 42 ° C 사이의 온도를 가져야한다; 높은 온도는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 일부 아가와 함께 다시 피펫으로 배아를 그립니다. 조심스럽게 유리 바닥 접시 (그림 2B)의 커버 유리 위에 아가로 오스와 배아를 꺼냅니다. 커버 유리의 두께가 공 초점 현미경의 목표와 호환되는지 확인하십시오. <ol><li> 원하는 경우 유리 피펫을 다시 사용합니다. 피펫에서 잔류 아가로 오스를 청소하고 위아래로 빠르게 막힘, 피펫 배아 매체를 방지합니다.다음이 목적을위한 실체 현미경으로 배아 매체의 ~ 5 ml로 가득 15 ML 튜브를 놓습니다. </li></ol></li><li> 동물 극 (배반)는 커버 유리를 향하도록 위치를 배아 금속 프로브를 사용한다. 아가로 오스 20 ~ 30 초에서 응고하기 때문에 신속하게 작업 할 수 있습니다. 배아 &#39;의 위치를​​ 모니터링하고 아가로 오스 견고 때까지 필요한 재조정 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 배아의 원하는 번호가 장착 될 때까지 반복 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 참고 : 일반적인 실험에서, 네 다섯 배아 각을 포함하는 4 개의 아가로 오스 방울은 커버 유리에 쉽게 맞습니다. 약 16 배아는 하나의 이상적인 실험 (그림 2C) 동안 이미지를 만들 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스가 응고되면, 1 배 Danieau의 배아 매체와 유리 바닥 접시를 채운다. </li></ol> 3. Photoconverting 및 Photoconverted 신호의 감소를 측정 25X 또는 40X 물 목표 내가크기와 제브라 피쉬 배아의 굴절률에 적합한이야. 물 여섯 시간 실험의 과정 동안 증발하기 때문에 그것은 수중보다는 실제 물과 같은 굴절률 액침 오일을 사용하는 것이 최선이다. 침지 기름이 물 (석유가 아닌) 목적으로 사용할 수 있도록 설계되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 목적과 커버 유리 사이의 오일 필름 이미징 동안 다른 배아 위치로 무대 이동으로 중단되지 않도록하기 위해 목표에 몰입 오일의 큰 하락을 놓습니다. 요리 할 때 단계 이동을 이동하지 않도록 확실하게 무대에 유리 바닥 접시를 놓습니다. 가능하면 28 ° C, 제브라 피쉬의 개발을위한 최적의 온도에서 가열 단계를 사용합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 소프트웨어 패키지의 각 배아의 위치를​​ 정의합니다. 각각의 배아 용 Z-깊이를 조정하고, 각각의 배아 대략 동일 평면을 대상으로 시도한다. 참고 : 약 30 μm의 동물 극에서이 이동입니다배아의 포락 층을​​ 회피 할 수있는이 깊이에서 보낸 외경 깊이 이미징 영역이 극대화되고, 광 산란이 최소이다. ~ 3.3 ㎛의 두께로 슬라이스 한 광은 충분한 데이터를 제공한다; Z-스택 (섹션 5 참조)을 취득 할 필요가 없다. </li><li> 실험 기간 동안 두 개의 신호를 수집 : Alexa488 - 덱스 트란에서 &quot;녹색&quot;신호를 공액-있는이 photoconverted 후 세포 외 및 세포 내 형광 및 융합 단백질에서 &quot;빨간색&quot;신호를 분리하기 위해 데이터 분석시 사용됩니다. <ol><li> 488 nm의 레이저를 사용하여 Alexa488을 자극하고, ~ 500 및 540 nm의 사이에 방출되는 형광을 수집합니다. 참고 : 광 변환 후, 많은 녹색 - 투 - 붉은 photoconvertible 단백질 (예를 들어, Dendra2)는 543 nm의 레이저로 흥분하고 ~ 550 및 650 nm의 사이의 형광을 방출 할 수있다. 사용 photoconvertible 단백질에 따라 필요한 조정합니다. </li></ol></li><li> 취득 &quot;전 광&quot;이미지 및 이미지에 적절한 이미징 조건 (단계 3.2) 이전에 정의 된 각각의 위치를​​ 공 초점 현미경의 소프트웨어를 구성하는 다섯 시간 시간 코스마다 10 또는 20 분 (5 장을보고 토론). </li><li> 융합 단백질을 photoconvert하려면, 2 분 동안 100 %의 출력에서​​ ~ 300-400 nm의 여기 필터와 수은 아크 램프로부터 UV 광에 배아기를 10X 대물 렌즈로 전환 노출. . 균일 한 광을 (5 장 참조) 홍보 z 축에있는 z 포커스를 이동 침지 오일 광 동안 10 배 목표에 떨어지지 않도록하십시오. 주 : 광 중 포커스의 이동은 실험자 간의 변동을 방지하기 위해 자동화 될 수있다. </li><li> 바로 광 변환 한 후 다시 25 배 또는 40 배 목표로 전환합니다. 단계 3.2에서 이전에 정의 된 위치가 여전히 정확한지 확인하십시오. 요리 photoconv 동안 이동하는 경우ersion, 태아의 위치를​​ 다시-정의합니다. <ol><li> 3.4 단계에서 만든 프로그램을 시작하고 영상 5 시간 동안 계속 할 수 있습니다. 광 및 각각의 배아에 대한 영상의 시작 사이에 경과 된 시간을합니다. </li></ol></li><li> 때때로 실험에서 확인합니다. Danieau의 매체의 수준을 모니터링하고 필요하면 더 추가 할 수 있습니다. 이 멈춘 경우 소프트웨어를 다시 시작합니다. </li><li> 지수 감소 모델의 점근선을 추정 데이터 분석에서 사용되는 배경 형광 값을 결정하기 위해, 실험 Alexa488 덱스 트란 아니라 mRNA를 주입 한 배아 일부를 포함한다. 후속 데이터 분석에서 사용되는 기기 노이즈를 측정하기 위해, 샘플의 부재하에 화상을 취득. </li></ol> 4. PyFDAP를 사용하여 데이터를 분석 <ol><li> 시각 각 배아 시간 코스 데이터 세트를 검사한다. IMAG 중 사망 한 배아에서 데이터 세트를 폐기photoconverted 신호의 매우 낮은 수준, 또는 그 특이한 모양과 이동 (부상 또는 병 배아의 일반) 분할 중지 세포의 영역을 포함하는 상당히 이동 ING,,. 참고 : 때때로, 침지 오일에 기포 나 다른 유물 그렇지 않으면 사용할 수있는 데이터 세트에 하나 또는 두 개의 이미지에 표시됩니다. 아티팩트를 포함하는 모든 이미지를 참고; 나중에는 폐기 될 것이며, 이러한 데이터 세트로부터 남은 시점 ​​여전히 분석 될 수있다. </li><li> FDAP 데이터를 분석하는 파이썬 기반의 소프트웨어 패키지 PyFDAP을 사용합니다. PyFDAP 각 화상의 평균 세포 내 및 세포 외 적색 형광 강도를 결정하고, 지수 감소 함수 (56) (도 3)로 데이터를 끼워 맞춤으로써 반감기를 계산한다. <ol><li> PyFDAP 다운로드 (참조 재료 목록). </li><li> 사용 PyFDAP 세포 내와 세포 외 photoconverted 신호 (그림 3A를, B)로 구분합니다. 우리세포 내 마스크를 만들기 위해 엄격 세포이다 Alexa488 신호를, 예. 평균 세포 외 농도를 계산할 때 고려되는 세포 내 픽셀을 방지하기 위해 해당 빨강 채널 이미지에이 마스크를 적용합니다. 평균 세포 내 농도를 측정하기 위해, 마스크를 반전. </li><li> PyFDAP, 단계 4.2.2에서 생성 된 마스크 화상을 표시. 시각적으로 이러한 이미지를 검사하고 마스크 정확하게 세포 외 공간에서 세포 내 (이 드문되어야 구별하지 않은 데이터 세트를 폐기, 즉 세포막은 세포 외 공간 마스킹되어있는 이미지에 포함되어 참고하지만 이들은 임계 값을 변경함으로써 제거 될 수 알고리즘 또는 멤브레인 마스크를 도입하여 (예를 들어, 사용하는 막 - CFP)). 또한 단계 4.1에서 확인 된 유물 (예, 침지 기름에 거품)를 포함하는 단일 이미지를 버린다. </li><li> EAC 평균 세포 외 및 세포 내 형광 강도를 계산하는 PyFDAP를 사용하여시간 이미지. PyFDAP 합산은 픽셀들의 총 개수에 의해 마스크 및 분할 벗어나는 픽셀의 휘도를 합산하여 이들의 평균을 계산한다. </li><li> 다음과 같은 지수 함수와 형광 데이터 (그림 3C)를 장착 : <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> t 시간 후의 광, C (t) t의 주어진 값에서의 강도는이고, C 0 t = 0에서의 강도이고, k는 제거율 상수이며 Y 0 함수가 형광으로 접근 점근선 감소한다 (도 1D). Y는 0 3.8 19 단계에서 측정에 기초하여 제한 될 수있다. </li><li> 다음의 관계를 이용하여 제거율 상수 (K)에서 세포 외 및 세포 내 단백질 반감기 (τ)을 계산하기 위해 사용 PyFDAP : <img fo:contENT 폭 = &quot;1 인치&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot;폭 = &quot;153&quot;/&gt; </li></ol></li></ol> 5. 제어 실험 광표백, 부주의 광 및 광 균일 성을 평가하기 위해 <ol><li> 평가 광표백 주 : 광표백 관심 단백질의 간극 이외에 형광 단백질의 표백 특성을 반영 형광 강도에 인공적 저하 될 수있다. <ol><li> 가능한 광표백을 평가 이미징 및 영상 사이에 ​​20 분 간격 (그림 4)와 두 번째 세트 사이에 10 분 간격으로 FDAP 실험 한 세트를 수행합니다. 4 절에 설명 된 실험을 이용 PyFDAP 세트 모두로부터의 데이터를 분석한다. </li><li> 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 긴 반감기가 20 분 간격 실험에서 상당한 광표백을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, PHOTobleaching는 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 또한, 즉시 광 후 ~ 30 일련의 이미지를 획득하여 photobleaching에 평가합니다. 형광 강도의 유의 한 감소는 상당한 광표백을 나타냅니다. </li><li> 광표백가 검출되었을 경우, 낮은 파워의 레이저를 사용하여 촬상 시간을 단축하거나, 더욱 광 안정성 photoconvertible 단백질 (32)을 사용하는 것을 고려. </li></ol></li><li> 실수로 광을 평가. 참고 : Dendra2는 488 nm의 조명 (27)를 사용하여 photoconverted 수 있습니다. 488 nm의 레이저로 Alexa488이 흥미 관심 단백질의 겉보기 반감기의 단계 3.3.1, 부주의 광 따라서 인공적 증가하는 경우에 기재된 바와 같이 가능하다. 그러나, 우리와 다른 사람 (33)는 488 nm의 조명은 제브라 피쉬 배아의 광 변환의 비효율적 인 방법이다 것을 발견했다. <ol><li> 부주의 한 광을 검출하는 단계 5.1.1에서 설명 대조 실험을 사용하여. 도 10 및 20 분 간격 실험에서 반감기 비교. 20 분 간격 실험에서 짧은 반감기는 중요한 실수로 광을 나타냅니다. 두 실험에서 반감기가 동일한 경우, 부주의 한 광은 큰 문제가되지 않습니다. </li><li> 부주의 한 광이 검출되면, Dendra2 photoconverting 실수를 방지하기 위해 낮은 488 nm의 레이저 출력과 짧은 촬상 시간을 사용한다. </li></ol></li><li> 광 균일 성을 평가. 주 : 광이 동물의 배아 극 치우쳐있는 경우, 형광의 감소가 깊은 평면 (도 5a)로 단백질 또는 세포의 확산 이동에 의해 영향을 받는다. <ol><li> 광이 균​​일 여부를 확인하려면, (세포 융합 단백질과 실험) 분비 photoconvertible 단백질 또는 (세포 융합 단백질과 실험) 세포질 photoconvertible 단백질을 발현. 평소와 같이 Photoconvert, t암탉은 80 분마다 20 분 배반 엽의 대부분을 포괄 Z-스택을 획득. </li><li> 광은 동물 극 치우쳐 있으면 깊이 평면에서 형광 강도 때문에 확산 또는 세포 이동 (도 5b)에 시간에 따라 증가 할 것이다. 불균일 한 광이 검출되면, 광 동안 배아을 깊은 초점. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 충돌이 전혀 없습니다.

FDAP 실험의 성공은 기능 photoconvertible 융합 단백질의 생성에 의존한다. 단백질에 태그를 자사의 생물학적 활성 및 / 또는 현지화, 용해도, 안정성 36-41을 포함한 생물 물리학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 활성 하나를 찾기 위해 여러 가지 융합 구조의 활동을 테스트 할 준비를하십시오. 발명자들은 관심 단백질 photoconvertible 단백질의 위치를 변경하거나 긴 링커를 사용하여 (예를 ?...

세포와 생물의 단백질의 수준은 생산 및 통관 자신의 속도에 의해 결정됩니다. 단백질의 반감기는 분에서 일 1-4까지를 범위로 할 수 있습니다. 많은 생물학적 시스템에서 키 단백질의 안정화 또는 통관 세포 활성에 중요한 영향을 미친다. 세포 내 단백질 안정성의 조절은 세포주기 진행 5,6- 발달 시그널링 7-9, 아폽토시스 (10), 정상 기능의 유지 뉴런 11,12 요구된다. 세포 외 단백질의 안정성은 조직 내 분포 및 morphogens 13, 14 등의 분비 단백질의 가용성에 영향을 미친다. 지난 몇 년 동안, 단백질의 안정성은 주로 방사성 펄스 라벨 또는 사이클로 헥 체이스 실험 (15)를 사용하여 세포 배양에서 평가되고있다. 이러한 펄스 추적 실험에서, 세포 중 방사능 일시적 아미노 &quot;펄스&quot;에 노출 될산 전구체 새롭게 합성 된 단백질에 통합하거나 단백질 합성을 저해 사이클로 헥시에 노출되어있다. 배양 된 세포를 상이한 시점에서 수집하고, 어느 (방사성 펄스 추적 실험에서) 오토 라디오이어서 면역 또는 (사이클로 헥 실험에서) 웨스턴 블로 팅은 시간이 지남에 따라 단백질의 클리어런스를 정량화하는데 사용된다. 기존의 단백질 안정성 분석은 몇 가지 단점을 가지고있다. 우선, 단백질의 분석 방법은 종종 그의 내인성 환경에서 발현되지 않고, 다른 종으로부터의 세포 조직 배양에서 때로는. 그 안정성 문맥 의존적 인 단백질이 방법은 문제가있다. 둘째, 시간이 지남에 따라 각각의 세포 또는 생물체 단백질 클리어런스를 수행하는 것이 불가능하고, 상기 분석으로부터의 데이터는 상이한 시점에서 상이한 세포의 집단의 평균을 반영한다. 각각의 세포는 시작 할 수 있기 때문에단백질의 다른 양, 서로 다른 시간에 방사성 라벨 또는 사이클로 헥를 촬영했거나 다른 통관 반응 속도 등의 데이터를 집계 오해의 소지가있을 수있을 수 있습니다. 마지막으로, 사이클로 헥 체이스 실험의 경우, 단백질 합성 억제제의 첨가는 인위적으로 단백질의 안정성을 바꿀 수 16-18 의도하지 않은 생리 학적 효과를 가질 수있다. 이러한 단점은, 광 (FDAP) 후 photoconvertible 단백질이 생물에게 19-25 생활에 동적으로 단백질의 간격을 측정하기 위해 활용하는 기술을 형광 붕괴를 사용하여 방지 할 수 있습니다 (FDAP 기술의 한계에 대한 토론 참조). Photoconvertible 단백질은 그 여기 및 방출 특성 빛 (26)의 특정 파장에 노출 된 후 변경 형광 단백질이다. 하나는 일반적으로 사용되는 변형 Dendra2, 처음에 전을 가진 &quot;녹색 - 투 - 빨간색&quot;photoconvertible 단백질이다표창장 및 배출 녹색 형광 단백질 유사한 특성,하지만 UV 라이트 - &quot;광&quot;에 노출 된 후 여기를 왔나은 / 방출 특성은 적색 형광 단백질 (23,27)와 유사하게된다. 중요한 것은, 광 변환 후 생성 된 새로운 단백질은 photoconverted 단백질 만 풀의 광에 따라 생산 및 통관의 디커플링과 관찰을 허용, photoconverted 단백질과 동일한 여기 / 방출 특성이 없습니다. photoconvertible 단백질과 관심의 단백질에 태그를 지정하는 것은 따라서 펄스 ​​레이블하는 그대로, 광학적으로 접근 생물체의 단백질을 수있는 편리한 방법을 제공합니다. FDAP 분석법 (도 1a)에있어서, 목적 단백질은 단백질 photoconvertible 태그로되어 생체 (도 1b)로 표현. 융합 단백질 photoconverted되며, 시간이 지남에 photoconverted 신호의 감소는 fluorescen에 의해 모니터링CE 현미경 (그림 1C). 데이터는 융합 단백질 (도 1D)의 반감기를 측정하기 위하여 적절한 모델이 장착된다. 여기에 설명 FDAP 분석은 19 초 동안 배아 제브라 피쉬 배아 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 반감기를 결정하도록 고안되었다. 그러나, 이러한 접근 방식은 라이브 영상을 견뎌, 어떤 taggable 세포 내 또는 세포 외 단백질의 간격을 모니터링하는 데 이용 될 수있는 투명한 모델 생물에 적용 할 수있다. 여기에 설명 된 기술의 변화는 배양 세포 20,23 초파리 (22)와 마우스 (21) 배아에서 수행되었다.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td></tr><tr><td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td></tr><tr><td>6-well plastic dish</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1&amp;nbsp;mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Protease from &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1&amp;nbsp;mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>5 cm diameter glass Petri dish</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>200 ml glass beaker</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>Microinjection apparatus</td><td></td><td></td><td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>For injecting and mounting embryos</td></tr><tr><td>1x Danieau&#039;s medium</td><td></td><td></td><td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.3 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5&amp;nbsp;mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#039;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#039;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1&amp;nbsp;ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &amp;deg;C, re-melted at 70&amp;nbsp;&amp;deg;C, and cooled to 40&amp;#8211;42 &amp;deg;C when ready to use</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td></tr><tr><td>Metal probe</td><td></td><td></td><td>For positioning embryos during mounting</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td></tr><tr><td>15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td></td><td></td><td>A mercury arc lamp, 488&amp;nbsp;nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td></tr><tr><td>Heated stage</td><td></td><td></td><td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &amp;deg;C during the experiment</td></tr><tr><td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td><td></td><td></td><td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25X or 40X water objective</td><td></td><td></td><td>Objective for imaging</td></tr><tr><td>10X air objective</td><td></td><td></td><td>Objective for photoconversion</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td></td><td></td><td>Immersion oil with the same refractive index as water</td></tr></tbody></table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

단백질 안정성은 생물학의 여러 측면에 영향을 미친다, 단백질의 클리어런스 동역학을 측정하는 중요한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. FDAP 실험에서 생체 내에서 단백질의 클리어런스를 측정 할 수있다. 관심있는 단백질은 형광 단백질 photoconvertible 태그로 생체 내에서 발현시키고 photoconverted하고 시간의 photoconverted 신호의 감소를 모니터한다. 데이터는 단백질의 반감기를 결정하는 적절한 클리어런스 모델 붙인다. 중요하게는, 다른 생물체의 구획 단백질 집단의 동력학 클리어런스는 구획되지 마스크를 적용함으로써 별도로 검사 할 수있다. 이 접근법은 제브라 개발 중에 분비 신호 전달 단백질의 세포 외 및 세포 내 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 FDAP 실험을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 간극의 역학을 결정할 FDAP을 사용하는 것이 가능해야광학적으로 접근 유기체의 모든 taggable 단백질.

FDAP 지브라 피쉬 19 배아 세포 외 신호 전달 단백질의 반감기를 결정하는 데 사용되었다. 이들 단백질 중 하나 퀸트가 배아 발생 동안 34 mesendodermal 유전자의 발현을 유도한다. 곁눈질-Dendra2가 QRT-PCR에 의해 현장 하이브리드 분석 (19)에서 입증 된 바와 같이, 태그가 곁눈질 비슷한 수준에서 mesendodermal 유전자의 발현을 활성화합니다. 배아 Alexa488 덱스 트란 및 mRNA...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.2K 조회수.  Harvard University.  세포와 조직에서 단백질 수준은 종종 단단히 단백질 생산 및 통관의 균형에 의해 조절된다. 광 (FDAP) 후 형광 감쇄를 사용하면, 단백질의 클리어런스 동력학 실험적 생체 내에서 측정 할 수있다. 

비디오: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

연구

발생학

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

유전학

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

생물학

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

요약

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Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivation

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

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Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

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제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

라이브 Zebrafish 태아에서 두 광자 기반 Photoactivati​​on

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An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

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