대부분의 작업과 관련된 인력은 NIH 보조금 NS060677에 의해 부분적으로 NIH가 MH099559과 (BSK에) MH10406​​9 부여에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 CHDI 재단에 의해 지원되었다.

모든 동물 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 따라이었고, UCLA에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1.1) 마이크로 피펫 및 AAV2 / 5 바이러스로드 준비 <ol><li> 바이러스의 주입을위한 좋은 붕규산 유리 마이크로 피펫을 사용합니다. 수직 풀러와 두 단계 당기는 프로그램을 사용하여 마이크로 피펫을 당깁니다. 베벨 피펫 분쇄기를 이용하여 40 °의 각도로 피펫. 40 μm의 6 생크 길이 - - 7 MM 사용하기에 이상적이다 피펫 (20)의 팁 직경을 가질 것이다. 피펫 및 수술 도구를 압력솥. 드릴을 70 % 에탄올로 닦아 소독한다. </li><li> 10 μL 씩에 -80 ° C에서 바이러스 AAV2 / 5 GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 × 10 13 GC / ㎖)을 저장합니다. 그냥 수술 전, 냉동실에서 분주을 꺼내 번째를 채우기 사용까지 얼음에 저장전자 마이크로 피펫. </li><li> 바이러스가 시린지 펌프를 이용하여 함께 마이크로 피펫을 채운다. 단단히 강화 플런저 유리 주사기, 피팅 적절한 크기의 튜브 압축을 통해 튜브, 조각의 한쪽 끝을 연결합니다. 맞는 적절한 크기의 이동식 바늘 압축을 통해 튜브의 조각의 다른 쪽 끝으로 멸균 마이크로 피펫을 연결합니다. </li><li> 바이러스 벡터를 넣기 전에, 바늘 1ml의 주사기 수단 적색 IV (~ 1 ㎎ / 50ml)로 컬러 미네랄 오일 시스템 (27 G를 충전함으로써 튜브, 주사기 및 마이크로 피펫을 포함한 배기계로부터 공기 방울을 제거 ). </li><li> 유리 마이크로 피펫에서 파라 필름의 깨끗한 부분을 놓고 5 분배 - 파라 필름에 바이러스 벡터의 10 μl를. </li><li> 역방향 0.5 μL / 분으로 주사기의 플런저를 이동시킴으로써 바이러스 벡터를 빨아 및 유리 피펫에 벡터 및 오일 사이의 경계를 표시한다. </li></ol> 1.2) 마취, 머리 자르기, H개두술에 대한 EAD 고정 및 준비 <ol><li> N 2 O 및 O 2, 5 % 이소 플루 란 채워진 챔버 내로 마우스 (P49-63, C57BL / 6)을 넣어. 목적이있는 운동의 손실 둔화 호흡 (- 90 / 분 ~ 60)에 의해 마취의 깊이를 평가한다. 마우스를 마취 할 때 머리에 머리를 잘라. </li><li> 머리가 마취 및 환기 시스템에 배치 무딘 귀 바, 코에 의해 확보와 함께, 정위 프레임에 마우스를 맞 춥니 다. 2-3%에서 연속 이소 플루 란을 유지한다. 마우스가 마취하에 자신의 깜빡임을 잃게하기 때문에 두 눈에 인공 눈물 연고를 적용합니다. </li><li> 통증 완화를위한 피하 주사에 의해 프레 놀핀 (0.1 ㎎ / ㎖)의 0.05 mL로 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 10 % 포비돈 요오드 및 70 % 알코올로 3 회 면도 외과 영역, 두 용액 사이에서 교호 포비돈 요오드로 시작. 전면에서 시작하고 이미 잘라 머리카락을 제거하기 위해 뒤쪽으로 닦습니다. </li><li> 상단 O에 피부 절개를눈 사이에 시작하고 귀 사이에 끝나는 머리 F. </li></ol> 1.3) 개두술 Microinjections <ol><li> 면봉으로 쓸어 넘겨 골막을 분리 한 다음 치과 면봉과 두개골의 표면을 건조. 주사 부위 주위에 마크를 만들고, 고속 드릴에 의해 구동 소형 강철 버어를 사용하여 마크의 에지 주위 드릴. </li><li> 뼈를 제거하고 식염수로 표면을 청소합니다. </li><li> 전후방 0.8, 내측 - 외측 : 다음 좌표 (mm)과 선조체 (striatum) 측면 왼쪽 지느러미에 피펫을 놓고 +2.0, 지느러미 - 복부를 pial 표면 : -2.4 (13). 이 좌표는 미세 주사 바늘의 끝이 약간이 핵 내에 침투 즉, 단지 배 외측 선조체 (그림 1A, B) 위에 앉아 있다는 것을 의미합니다. 손상 혈관을 피하십시오. 피펫은 혈관에 바로 될 일이있는 경우, 버스를 조정0.2 mm - 0.1 ~에 의해 조정합니다. </li><li> 0.2 μL / 분으로 설정 주입 속도로 주입을 시작하고 일반적으로 바이러스의 1-1.5 μl를 주입. </li><li> 10 분 동안 주입 한 후 장소에 피펫을두고 천천히 피펫을 철회. </li><li> 연속 봉합 외부 나일론 봉합 수술 상처를 닫아 마칩니다. </li></ol> 1.4) 복구 <ol><li> 24 시간 동안 가열 패드에 깨끗한 케이지에 마우스를 넣습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. </li><li> 트리 메소 프림 Sulfamethoxiazole 추가 일주일 동안 물 (40 mg을 트리 메소 프림과 200 mg을 sulfamethoxiazole이 포함 된 500 ml의 물에 5 ml의). 수술 후 프레 놀핀에게 최대 3 일 동안 하루에 두 번 관리합니다. </li><li> , 먹이 12 시간 명암주기에 마우스를 유지하고 매일 물을차 수술 후 3 일에 한 번 일까지 당 가중된다. 이 3 일 동안, 10 % 이상의 체중 감량과 함께 임의의 마우스는 손실, 대신 실험 실시되는 안락사 될 것으로 간주된다. </li><li> 별도로, 일주일에 두 번 마우스 케이지를 변경하고, 적어도 하루에 한 번 건강을 모니터링. 정위 microinjections 후 3 주 - 일반적으로 마우스는 2 내에서 사용된다. </li></ol> 공 초점 칼슘 이미징 2. 급성 뇌 조각 준비 절단 및 녹화 솔루션 2.1) 준비. <ol><li> (MM)을 포함하는 용액을 절단 준비 : 194 크로즈, 30의 NaCl, 4.5 KCl을 10 D 글루코스, 하나의 MgCl 2, 1.2의 NaH 2 PO 4, 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 된 26의 NaHCO3를. </li><li> 포함하는 기록 용액 (mM)을 준비한다 (124)의 NaCl, 4.5 KCl을, 하나의 MgCl 2, D-10 글루코스,이 CaCl2를 1.2의 NaH 2 PO 4 </서브&gt;, 26의 NaHCO3; pH가 7.3-7.4을, 290 - 95 % O 2 및 5 % CO 2로 포화 295 mOsm. 레코딩 솔루션과 뇌 조각을 들고 비커를 입력하고 34 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 2.2) 슬라이스 <ol><li> 2-3 주 정위 microinjections 후, 깊이와 끝으로 마우스를 마취 한 다음 목을 벨. </li><li> 뇌를 추출하고, uninjected 우반구를 제거하는 블레이드를 사용하고, 강력 접착제를 사용하여 vibratome 트레이에 왼쪽을 탑재합니다. 차가운 얼음 절단 버퍼와 vibratome 트레이를 입력하고 95 % O 2 5 % CO 2로 포화 유지. </li><li> 300 μm의 두께로 관상 또는 시상 선조체의 뇌 조각을 잘라. 일반적으로, 4-5 관상, 또는 6-7 시상 선조체 슬라이스는 수집 할 수 있습니다. </li><li> 34 ° C에서 따뜻하게 슬라이스 잡고 비커에 조각을 이동하고, 이후 recordi 실온에서 그들을 저장하기 전에 30 분 동안 그들을 거기 유지NG. </li><li> [칼슘] 난 촬상 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 산화 된 기록 버퍼에서 뇌 조각 부화. </li></ol> 3. 면역 조직 화학 (IHC) <ol><li> 두 주 바이러스 주사 후, PBS로 transcardially 가진 마우스 PBS에서 10 % 포르말린 관류 하였다. </li><li> 제거 하룻밤 후 수정, 적어도 2 일 동안 버퍼링 30 % 자당의 뇌를 cryoprotect. </li><li> 그라 이오 스탯 마이크로톰을 사용하여 40 μm의 섹션을 준비합니다. </li><li> 10 분 간격으로 섹션을 PBS로 3 회 헹군다. </li><li> 10 % 정상 염소 혈청과 PBS에서 1 시간 동안 0.5 % 트리톤 X-100으로 섹션을 품어. </li><li> 0.5 % 트리톤 X-100와 PBS에서 준비 차 항체로 4 ℃에서 하룻밤 섹션을 품어. 다음과 같이 사용되는 일차 항체이었다 : 닭 항 GFP 1 : 1,000, 마우스 항 S100β 1 : 400, 마우스 항 NeuN 1 : 600, 마우스 항 글루타민 신테 1 : 300. </li><li> 10m에서 섹션을 PBS로 3 회 씻어간격. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 10 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 제조 된 이차 항체 섹션을 인큐베이션. 다음 두 번째 항체는 같았다 : 염소 항 - 마우스 Alexa546 1 : 500, 염소 항 - 닭 Alexa488 1 : 500. </li><li> 천천히 유리 커버 슬립과 섹션을 포함, 건조 유리 슬라이드에 섹션을 마운트하고 antifade 설치 매체의 몇 방울을 적용합니다. 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li><li> 1.3의 개구와 40X 기름 침지 렌즈와 공 초점 현미경에서 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 공 초점 [칼슘 2 +] 나는 영상 참고 : [칼슘 2 +] 나는 0.8의 개구와 40 배 침수 대물 렌즈와 공 초점 현미경을 사용하여 수행되었다 이미징. <ol><li> 1 ㎖ 당 2 - 시간 1 ~ 5의 기록 챔버 내에서, 도시 슬라이스 및 슬라이스 (1)의 유량을 갖는 실온에서 산소 기록 버퍼와 superfuse 후분. 그 후 실험 기간 동안 움직임을 최소화하기 위해 슬라이스 위에 나일론 문자열 백금 하프 배치. </li><li> 시각화 및 10 배 침수 목적에서 밝은 필드 발광과 등쪽 선조체 (striatum)를 찾습니다. </li><li> 40 배 침수 대물 렌즈로 전환 한 아르곤 레이저의 488 nm의 라인을 켭니다. 초점면을 변경, 소마, 지점과 branchlets의 기초 형광 표시, 약 20 μm의 슬라이스 표면 아래에있는 세포를 찾을 수 있습니다. 참고로, 손상된 세포는 일반적으로 피해야한다 평균 이상 형광 수준을 표시합니다. </li><li> 스캔을 시작하는 &#39;프레임 스캔&#39;모드를 사용합니다. 통상적으로, 0.5로 조정 한 레이저 강도 - 최대 출력의 5 % [칼슘] 전 사이토-GCaMP3 가진 이미지에 충분하다. 성상 세포의 전체 영역에 [칼슘 2 +] 나는 역학을 모니터링하기위한 프레임 이상의 속도 당 1 초의 스캔 속도와 &#39;프레임 스캔&#39;추천!입니다nded하지만,이 문제의 실험에 따라 결정해야합니다. </li><li> 보기의 전체 필드 2 성상 세포 - 1을 모니터 3 배 - 필요한 경우, 이미지에 [칼슘 2 +] 나는 과정에서, 2의 디지털 배율을 사용합니다. </li><li> 녹화 중에 포화 픽셀을 방지하기 위해, 세포를 사색하는 &#39;히로&#39;조회 모드를 사용합니다. 항상 붉은 색은 채도의 표시로 나타나는 경우 테스트하기 위해, 약 5 분 동안 &quot;파일럿 녹화&quot;로 시작합니다. 이 경우, 레이저 출력을 낮추거나 PMT를 낮추고 / 이득 / 오프셋 값과 화소 값은 비 포화 영역에있는 테스트하는 다른 파일럿 기록을 수행한다. - 5 % (10 메가 와트), PMT 550-650 볼트, 게인 2.0 - 레이저 출력 전력 0.5 3.5 배, 0 오프셋 : 일반적으로 결합 된 매개 변수 영상 성상 세포에 사용 [칼슘] 선조체에서 나는 다음과 같습니다 - 5 %. </li></ol>

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여기에 설명 된 방법은 우리가 현장에서 후속 [칼슘 2 +] 나는 영상을 위해 생체 내에서 선조체의 성상 세포에서 사이토-GCaMP3을 표현 할 수있다. 이 방법은 형질 전환 또는 강력한 대상 단백질, 신속성의 표현과 실험적인 구현 및 해부학 적 특이성의 유연성을 포함 노크에서 마우스를 사용하여보다 이점이있다. AAV2 / 5 사용 GCaMP3의 발현은 구체적이고 강력한 것으로 밝?...

성상 세포는 뇌의 유비쿼터스와 풍부한 신경 교세포 있습니다. 그것은 잘 성상 세포가 중요한 지원 및 세포 외 공간에서의 K + 농도의 버퍼링, 흡수 신경 전달 물질의를 제공 할뿐만 아니라 영양소를 포함 항상성 역할을 역할을한다는 설정됩니다. 그러나, 최근의 연구들은 또한 자연적으로 발생하여 신경 세포의 활동을 1 증가 [칼슘] 내가 신호를 표시하는 것을 알 수있다. 성상 세포의 존재는 [칼슘 2+] I 시그널링 점점 뉴런과의 통신을 유발하는 것으로 생각되고 있으며, 이와 같이 성상 내의 &quot;칼슘 흥분성&quot;의 형태로 해석되었다. 지난 20 년 동안 사용할 수있는 데이터는 성상 세포와 신경 세포는 아마도 양방향 방식으로 통신 할 수있는 두 가지 설정을 제안한다. 첫째, 성상 세포는 종종 내가 신경 전달 물질에 의해 활성화 [칼슘]의 증가로 응답신경이 해제 신경 조절. 둘째, [칼슘 2 +] 성상 세포 내에서 내가 증가는 다시 신경과 혈관에 영향을 미칠 수있는 성상 세포에서 신호 전달 분자의 방출을 야기한다. 증거는 성상 세포에서 방출 분자가 성상 세포 간 신경 신호를 통해 ​​시냅스 회로와 궁극적으로 행동 3-5의 기능의 변화로 이어질 것이 좋습니다. 그러나이 급속히 발전 연구 분야 남아 있고, 이는 성상 세포의 더 상세한 이해는 [칼슘 2+] I는 현재의 불확실성 (6)의 일부를 해결하기 위해 필요하다고 주장하고있다. 과거의 연구에서,이 성상 세포에 유기 칼슘 지표 염료의 대량로드가 확실하게 감지하지 못하는 것을 증명했다 [칼슘 2 +] 문화 및 현장 7-10에서 전체 성상 세포 내에서 내가 신호. 이러한 연구 결과는 우리와 다른 사람 6,11,12에 의해 논의되었다. emerginG 사진은 [칼슘 2 +] 나는 신경과 혈관과의 상호 작용에 대한 기본 사이트입니다 성상 세포 프로세스 (예를 들면, 지점 및 branchlets) 내에서 신호를 거의 자세히 살펴되어 있지 않은 것입니다. 최근에는 세포질 GCaMP3, GCaMP5G 및 GCaMP6 및 세포막과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 사용이 닿는 버전 (예를 들어, Lck에-GCaMP3)는 성상 세포 등의 작은 구획에 [칼슘] 내가 신호의 연구를 허용하고있다 얇은 프로세스, 세포막 근처 전체 지역 7,8 내. 그러나 GECIs 유기 칼슘 2 + 지표 염료를 통해 한 가지 단점을 가지고 GECIs 적절하게 할 표현하는 유전 적 방법은 주 단위로 생체 내에서 성상 세포에 선택적으로 인코딩 유전자를 전달하기 위해 그 요구 사항입니다. 생체 내에서 발현은 일반적으로 노크에 쥐 또는 바이러스를 기반으로 배달 응용 프로그램과 함께, 형질 전환 마우스를 사용하여 달성된다바퀴벌레. 본 조브 기사에서 우리는 아데노 - 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상 세포에 GECIs을 제공하기 위해 사용되는 방법과 절차를보고합니다. 우리는 예를 들어 사이토-GCaMP3에 초점을 동일한 기본 절차는 다른 GECI 또는 형광 단백질 기반 기자 모든 작동합니다.

<table><tbody><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette grinder</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>syringe needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virus</td><td>UPenn vector core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan red IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>CVS Pharmacy</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&amp;reg;Glue</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopes</td><td>Olympus</td><td>FV300 and FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-s100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti-glutamine synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-chicken-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

줄무늬 체에서 사이토-GCaMP3의 성상 세포 특이 적 발현을 위해, 우리는 이전에 견고 GCaMP3 및 리포터 유전자를 구동하는 도시 된 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 5 혈청 형 및 GFAP GfaABC 한 D 촉진제 (도 1A)를 사용 해마와 대뇌 피질의 성상 세포 8, 14의 식입니다. 2 주 마우스 선조체에 바이러스 미세 주입 한 후, 마우스 (~ 10 주)을 관류하고 IHC는 선조체 (그림 1B)의 ?...

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

이미징 세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K 조회수.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

연구

신경과학

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

생물학

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

이미징 세포 내 칼슘

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