우리는 안티 리프트 밸리 열병 바이러스의 혈청을 제공하는 CISA-INIA에서 알레한드로 브룬 감사합니다. 우리의 실험실에서 작업 Forschungsförderung 보석에 의해 지원됩니다. 2 상승률 §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum 기센 운트 마르부르크, 신흥 바이러스 성 질병에 대한 라이프니츠 대학원 (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 및 DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

감염 A549 세포의 1. 시드 <ol><li> 37 ° C에서 A549 세포의 T75 플라스크를 육성하고 5 %는 세포 배양 배지에서 CO 2 (DMEM 10 % FCS, 526.6 ㎎ / ℓ의 L-글루타민, 50.000 U / L 페니실린, 50 ㎎ / ℓ의 스트렙토 마이신과 보충). </li><li> 세포를 수확을 시작하기 전에 37 ℃로 가열 수조에 세포 배양 배지, PBS 0.05 % 트립신-EDTA를 따뜻하게 </li><li> 매체를 제거하고 10 ㎖의 PBS로 세포를 씻어. 다시 PBS를 제거합니다. </li><li> 트립신-EDTA의 3 mL를 넣고 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 37 ° C로 인큐베이터에서 플라스크를 전송하고 5 % CO 2. </li><li> 모든 세포가 분리되면, 세포 배양 배지 12 mL를 넣고 세포를 재현 탁하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> RT에서 5 분 동안 800 XG에서 세포를 원심 분리하고 상등액을 10 ㎖의 신선한 세포 배양 배지에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 카운팅 챔버와 함께 세포를 카운트. </li><li> 두 T25 플라스크 각 세포 배양 배지 5 ㎖에 2.5 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ° C에서 16 시간 동안 배양하고 5 % CO 2. 한 플라스크 모의 제어 및 망할 CIA 13 감염에 대한 하나 제공합니다. </li></ol> 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 2. 감염 된 (C1 13) <ol><li> 참고 : 망할 CIA (13)가 독일에서 BSL-2 조건에서 처리 할 수​​있는 약독 화 바이러스의 돌연변이이다. 해당 국가의 지침을 참조하십시오. 다른 일반적인 IFN 유도제 센다이 바이러스 (변형 Cantell) 뉴캐슬 질병 바이러스 일 것입니다. </li><li> 5 % FCS를 함유하는 사전 따뜻한 PBS, 무 혈청 배지 및 세포 배양 배지. </li><li> 5 감염 다중도 (MOI)로 2.5 × 106 A549 세포를 감염 혈청 배지에서 망할 CIA 13 1.25 × 10 7 PFU / ㎖를 준비한다.을 고려하는 데 필요한 것보다 약간 (약 10 %)보다 많은 양을 준비 피펫 오류. </li><li> 1.3에 설명 된대로 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 망할 CIA 13 ml의 희석 또는 추가무 혈청 배지의 세포 (감염되지 않은 제어, 모의), 37 ° C에서 1 시간 5 % CO 2 알을 품다. 각각 망할 CIA 13 희석 혈청 배지의 동등한 분배를 보장하기 위해 매 15 분 조심스럽게 플라스크를 이동합니다. </li><li> 감염의 1 시간 후, 접종을 제거 5 % FCS로 예열 된 세포 배양 배지 5 ㎖를 추가하고, 37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 알을 품다. </li></ol> 세포 용 해물의 3. 준비 <ol><li> 4 ℃에서 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100을 준비 세린 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오. </li><li> 차가운 PBS로 세포를 세척하고 신선한 PBS의 10 ML을 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 800 XG에서 세포 팔콘 튜브 서스펜션, 원심 분리기를 전송하고, 세포를 긁어. </li><li> 상층 액을 제거하고 30 ㎕의 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100에있는 세포 펠렛을 resuspend. 새로운 1.5 ML 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 적어도 10 분 동안 품어 </li><li> 10.00 해물을 원심 분리기0 ~ 4 ° C에서 10 분 동안 XG와 신선한 튜브에 명확히 세포 용 해물 (상층 액)을 전송합니다. </li><li> 다른 33 설명한대로 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> -20 ° C에서 보관 또는 트립신 소화 (4.1) 또는 기본 페이지 (5.1)로 진행합니다. </li></ol> 패턴 인식 수용체의 구조적인 변경 4. 결정 <ol><li> 세포 용 해물의 TPCK - 트립신 처리 <ol><li> 2 ㎍ / μL의 최종 작업 농도로 PBS에 L-1-tosylamido-2 - 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 처리 (TPCK) 트립신을 희석. </li><li> 두 개의 새로운 튜브 PBS 9 μL의 최종 볼륨 (모의 또는 망할 CIA 13) 각 단백질의 용해 액의 25 μg의 최종 단백질 농도를 조정합니다. 따라서, 그것은 두 번 모의 두 번 망할 CIA 13 감염 25 μg의 해물을 각각 네 개의 튜브해야합니다. 하나는 입력 제어 (치료) 및 TPCK - 트립신 처리를위한 하나의 세트로 설정합니다. </li><li> PBS의 1 μl를 추가합니다 (치료)또는 1 ㎍ / ㎕의 TPCK-트립신 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL) ㎕의 세포 용 해물을하고 피펫으로 반응을 섞는다. 그것은 소화의 효율성을 손상하기 때문에, 동결 TPCK-트립신 분주을 해동하지 마십시오. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 배는 (250 MM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 25 %의 β-머 캅토 에탄올, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀) 샘플 버퍼를 변성 추가하여 95 ℃에서 5 분간 끓여 반응을 중지 그것은 트립신 보육 시간을 연장하지하는 것이 중요합니다. 더 프로테아제 저항하는 조각이 검출없는 경우, 트립신 소화의 시간을 단축 할 수 있어야합니다. </li><li> 끓는 후, 샘플은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)과 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 황산 도데 실 나트륨 12 % 해결 젤에 5 %의 스택을 포함하는 (SDS) 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 샘플을로드합니다. 까지 젤 당 25mA에서 단백질을 분리브로 모 페놀 블루 밖으로 실행됩니다. </li><li> 메탄올로 30 초 동안 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 전송 버퍼 (48 mM 트리스, 39 mM의 글리신, 1.3 mM의 SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 반 건조 블로 팅 시스템과 블로 팅을 준비하고 1 시간 동안 10 V에서 단백질의 전송을 할 수 있습니다. 멤브레인을 꺼내 물로 간단히 씻어서 말리면. </li><li> 곧 메탄올로 전송하여 막 활성화하십시오. TBS로 5 분 씻으십시오. 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 TBS에서 10 % 탈지 우유로 차단 5 분 TBS 각각의 막 배를 씻으십시오. </li><li> 표 1에 권장 항체 희석을 준비하고 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 막 부화 </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 씻으십시오. TBS의 1 % 탈지 우유 1:20,000 희석에 고추 냉이 퍼 옥시 다제과 함께 적절한 보조 항체를 추가합니다. 실온에서 45 분 알을 품다. </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 세척하고, 오TBS와 네브라스카 추가 시간. </li><li> 신호 검출을위한 상용 chemiluminescense 키트 및 디지털 겔 이미징 시스템을 사용한다. </li></ol></li><li> 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색법 <ol><li> 4.2.1에 설명 된대로 SDS-PAGE를 수행합니다. 브로 모 페놀 블루가 소진 될 때까지로드 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 샘플 및 젤 당 25mA에서 젤을 실행합니다. </li><li> RT에서 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색을 수행합니다. 일정한 진탕 모든 배양을한다. </li><li> 40 % 메탄올, 30 분 동안 10 % 아세트산을 함유하는 고정액으로 겔을 전송. </li><li> destaining 용액 (25 % 에탄올과 8 % 아세트산)에 버퍼를 교환하고 5 분 동안 품어. </li><li> 40 % 메탄올로 1 시간 동안 10 % 아세트산 0.2 % 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 겔을 염색. </li><li> destaining 용액 겔을 Destain하고 10 분, 30 분 및 60 분 후에 버퍼를 교환한다. </li><li> 4 ° C에서 25 % 에탄올, 8 % 초산, 4 % 글리세롤에 젤을 저장 </lI&gt; <li> 4.2.8에 설명 된대로 이미징 및 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 패턴 인식 수용체의 올리고머 미국의 5. 분석 <ol><li> 기본 페이지 <ol><li> PBS 10 μL의 최종 부피로 세포 용 해물 50 μg를 준비의 최종 농도 5 × 네이티브 샘플 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 50 % 글리세롤, 블루 0.5 % 브로 모 페놀)를 추가 1X. </li><li> 스태킹 5 % 젤을 해결하는 등의 8 %와 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤에 즉시 샘플을로드합니다. 지연은 네이티브 단지 (34)의 손실이 발생할 것입니다. </li><li> 양극과 50 mM 트리스 산도 8.3, 384 MM의 글리신, 음극 버퍼로 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 등으로 50 mM 트리스 - 수산화 나트륨의 pH 9.0, 384 mM의 글리신과 4 ° C에서 젤 당 20mA에서 젤을 실행합니다. 1.5 시간 후 전기가 완료 (브로 모 페놀 블루 밴드는 약 45 분 이전에 젤 남아있다). </li></ol></li><li> 웨스턴 블로 팅 <ol><li> polyv 활성화메탄올 30 초 동안 플루오 라이드 (PVDF) 막을 inylidene 및 Towbin 버퍼 (25 MM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 젖은 얼룩 챔버를 조립하고 Towin 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 4 ℃에서 1.5 시간 동안 250mA로 블로 팅을 수행합니다 </li><li> 모래 바닥 경우는 4.2.3에서 설명 된대로 진행으로 완성되고 있습니다. </li></ol></li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

바이러스의 존재와 I 시스템을 IFN 항 바이러스 유형의 활성화를 감지 성공적으로 타고난 면역 반응 22 중요하다. 바이러스 탐지함으로써 신속한 대응 및 항 바이러스 방어 메커니즘의 활성화를 가능하게 RIG-I와 PKR 같은 병원체 인식 수용체 (PRRS)에 의해 매개된다. 여기, 우리가 직접 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 평가하기 위해 두 가지 방법을 설명합니다. RIG-I과 PKR의 구?...

항 바이러스 숙주 방어에서 중요한 이벤트는 소위 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1,2에 의해 병원균의 신속한 검출입니다. RNA 바이러스 감염 세포 내 검출은 두 가지 세포 내 RNA의 헬리, RIG-I (레티노 산 유도 유전자 I) 및 MDA5 (흑색 종 분화 관련 단백질 5) 3-5에 따라 달라집니다. RIG-I은 두 개의 N-말단 카스파 모집 도메인 (카드), 중앙 DECH 박스 타입 RNA 헬리 케이즈 도메인과 C-말단 도메인 (CTD) 4,6로 구성되어있다. CTD 및 헬리 케이즈 도메인이 아닌 자기 (바이러스) RNA를 인식에 필요한 반면, 카드는 항 바이러스 호스트 상태의 설립에 이르는 다운 스트림 신호를 중재. RIG-I가 특정 RNA 리간드의 부재 즉 무음 상태에있는 경우, 제 CARD는 중앙 헬리 케이즈 도메인과 상호 작용하고 자동 억제 입체 7-11 RIG-I를 유지한다. RIG-I는 짧은에 바인딩 더블5&#39;-트리 포스페이트 (5&#39;PPP), 긴 dsRNA에, 그리고 polyU / UC 풍부한 RNA, 많은 RNA 바이러스 12-16의 게놈에 존재하는 고전적인 서명 구조 베어링 가닥 (DS) RNA. RIG-I 활성화의 두 가지 주요 특성은 닫힌 형태 6,17 및 호모 올리고머 6,18,19로 전환합니다. 구조적 스위치, RNA 바인딩 향상 다운 스트림 신호의 카드를 노출하고 활성 ATP 아제 사이트 8,9,11,20을 재구성한다. 올리고머 RIG-I 복합체의 형성은 항 바이러스 신호 전달 (11)를위한 플랫폼을 형성하도록 하류 시그널링 어댑터 분자의 향상된 모집에 이르게한다. RIG-I-조절 신호 체인은 결국 전사 인자를 활성화 IRF-3 위로 규칙 전체 바이러스 반응 (21, 22)에 대한 인터페론 (IFN-alpha/beta) 유전자와 인터페론 자극 유전자의 따라서 유전자 발현 (ISGs)의 . 최고의 특성화 ISGs 중 하나는 RNA 활성화 PROTEI입니다N 키나제 (PKR) 23. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2 알파 (eIF2α) 키나아제의 가족에 속하는 N-말단 이중 가닥 RNA 결합 도메인과 C-말단 키나제 도메인으로 구성되어 있습니다. 키나아제는 PKR 활성화를위한 이량 인터페이스 중요한 구성하고 단백질의 촉매 기능을 수행한다. 바이러스를 dsRNA에 PKR의 바인딩의 구조적 변화가 다른 잔류 물 사이의 Thr 446에 이합체 및 자동 인산화를 허용로 연결됩니다. PKR는 따라서 바이러스의 mRNA 23-27의 번역을 차단 eIF2α의 인산화를 중재. RIG-I와 PKR 모두 주요 구조 재 배열을 받아야 올리고머 단지를 형성하고 포스트 병진 인산화 / 탈 인산화와 유비퀴틴 10,11,19,23,24,26-29에 의해 수정됩니다. 바이러스 성 RNA의 구조는 RIG-I과 PKR 활성화 (그리고 어떤 단계에서 바이러스 성 길항제 ㄴ 수있는의 더 나은 이해를위한E) 간섭, 그것은 정확하게 활성화 상태를 결정하는 것이 중요하다. 모두 PRRS를 위해 이전에 활성화가 트립신 내성 단백질 조각 6,17,30 및 고차 올리고머 6,18,19의 출현에 이르게 설명했다. 그러나, 항 바이러스 호스트 응답 1,2,24 이러한 핵심 요소에 대한 문학의 재산을 주어, 직접 방법의 응용 프로그램은 비교적 드문 것 같다. 광범위한 사용을 촉진의 희망, 우리는 견고 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 분석 할 수있는 편리하고 민감한 프로토콜을 제공합니다. IFN 유능한 인간 세포주 A549은 RIG-I과 PKR, 감쇠 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) (31, 32)의 설립 활성화에 감염된다. 간단한 용해하는 과정을 거친 후, 감염된 세포의 추출물 구조적 전환을 평가하기 위해 제한된 트립신 소화 / 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트되고 파란색 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE) / 웨스턴 블롯 분석가로올리고머의 형성을 측정하는 것이다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (&lt;font class=&quot;font6&quot;&gt;DMEM)&lt;/font&gt;</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-IRF-3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &quot;C2&quot; (MP-12)</td><td>Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td><td>Cell Signalling</td><td>3700</td><td>WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS</td></tr><tr><td>Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS</td></tr></tbody></table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

바이러스 감염에 대한 숙주 방어는 타고난 면역 시스템의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의한 신속한 검출에 따라 달라집니다. 세포질에서, PRRS RIG-I 및 특정 바이러스 성 RNA의 리간드 PKR 바인딩. 이것은 첫 번째 구조적 전환 및 올리고머를 중재하고 항 바이러스 인터페론 반응의 활성화를 가능하게한다. 바이러스 숙주 유전자 발현을 측정하는 방법은 잘 확립되어 있지만, 직접 RIG-I 및 PKR의 활성 상태를 모니터링하는 방법은 부분적으로 만 이하이며 잘 확립. 여기, 우리는 설립 인터페론 유도, 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) 감염시 RIG-I과 PKR 자극을 모니터링하는 두 가지 방법을 설명합니다. 제한 트립신 소화 PRRS의 구조적 변화를 나타내는 단백질 분해 효소의 감도 변화를 분석 할 수 있습니다. RIG-I과 PKR, wherea의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 결과에서 해물의 트립신 소화망할 CIA의 13 감염은 단백질 분해 효소 내성 RIG-I 조각의 출현에 이르게한다. 또한 PKR은의 Thr 446에 그것의 특징 인산화와 일치 트립신 소화에 바이러스에 의한 부분적인 저항을 보여줍니다. RIG-I과 PKR 올리고머 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 확인 된의 형성. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 감염되면, RIG-I과 PKR 올리고머 단지의 강한 축적이있다. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지는 RIG-I과 PKR 활성화의 두 다양한 단계의 민감하고 직접 측정을 허용, 웨스턴 블롯 분석을 결합 둘. 이 기술은 상대적으로 쉽게 수행 할 수 신속하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.

RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 성 작용제의 인식은 구조적 전환 6,17,30 및 올리고머 6,18,27를 트리거합니다. 우리는 각각 제한된 단백질 분해 효소의 소화와 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해이 두 활성화 마커를 정량. 인간의 A549 세포는 IFN 길항제 NSS (35, 36)의 돌연변이에 의해 특징 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 (망할 CIA...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K 조회수.  Philipps-University Marburg.  바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다. 

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

연구

면역학 및 감염병학

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals are currently not available, methods measuring the impact of potential antiviral agents are required. Here, a dual fluorescence reporter that allows the analysis of the BKPyV non-coding control-region (NCCR) driven early and late promoter activity was constructed to quantify the impact of potential antiviral drugs on viral gene expression via tdTomato and eGFP expression. In addition, by cloning BKPyV-NCCR amplicons which in this protocol have been exemplarily obtained from the blood-derived DNA of immunocompromised renal transplanted patients, the impact of NCCR-rearrangements on viral gene expression can be determined. Following cloning of the patient derived amplicons, HEK293T cells were transfected with the reporter-plasmids, and treated with potential antiviral agents. Subsequently, cells were subjected to FACS-analysis for measuring mean fluorescence intensities 72 h post transfection. To also test the analysis of drugs that have a potential cell cycle inhibiting effect, only transfected and thus fluorescent cells are used. Since this assay is performed in large T Antigen expressing cells, the impact of early and late expression can be analyzed in a mutually independent manner.

In this manuscript, a protocol is presented to perform FACS-based measurement of BK-polyomavirus transcriptional activity by using HEK293T cells transfected with a bidirectional reporter plasmid expressing tdTomato and eGFP. This method further allows to quantitatively determine the influence of novel compounds on viral transcription.

유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

유전학

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

생화학

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like receptor myeloid differentiation primary response gene 88 (TLR-MyD88) signaling pathway. IRF5 activation involves phosphorylation, dimerization, and subsequent translocation from the cytoplasm into the nucleus, which in turn induces the gene expression of various pro-inflammatory cytokines. A detection assay for IRF5 activation is essential to studying IRF5 functions and its relevant pathways. This article describes a robust assay to detect endogenous IRF5 activation in the CAL-1 human plasmacytoid dendritic cell (pDC) line. The protocol consists of a modified nondenaturing electrophoresis assay that can distinguish IRF5 in its monomer and dimer forms, thus providing an affordable and sensitive approach to analyze IRF5 activation.

A native Western blot method for analyzing endogenous interferon regulatory factor 5 dimerization in the CAL-1 plasmacytoid dendritic cell line is described. This protocol can be applied to other cell lines as well.

내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially described to occur by apoptosis, programmed cell death is now known to encompass three interconnected pathways: pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, together coined as one process, PANoptosis. Influence A virus (IAV) infection induces PANoptosis in mammalian cells by inducing the activation of different caspases, which, in turn, cleave various host as well as viral proteins, leading to processes like the activation of the host innate antiviral response or the degradation of antagonistic host proteins. In this regard, caspase 3-mediated cleavage of host cortactin, histone deacetylase 4 (HDAC4), and histone deacetylase 6 (HDAC6) has been discovered in both animal and human epithelial cells in response to the IAV infection. To demonstrate this, inhibitors, RNA interference, and site-directed mutagenesis were employed, and, subsequently, the cleavage or resistance to cleavage and the recovery of cortactin, HDAC4, and HDAC6 polypeptides were measured by western blotting. These methods, in conjunction with RT-qPCR, form a simple yet effective strategy to identify the host as well as viral proteins undergoing caspase-mediated cleavage during an infection of IAV or other human and animal viruses. The present protocol elaborates the representative results of this strategy, and the ways to make it more effective are also discussed.

Influenza A virus (IAV) infection activates the caspases that cleave host and viral proteins, which, in turn, have pro- and antiviral functions. By employing inhibitors, RNA interference, site-directed mutagenesis, and western blotting and RT-qPCR techniques, caspases in infected mammalian cells that cleave host cortactin and histone deacetylases were identified.

인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 단백질을 절단하는 카스파아제와 그 모티프 식별

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical regulators of necroptosis, an inflammatory form of cell death with important antiviral functions. Autophosphorylation of RIPK3 induces phosphorylation and activation of the pore-forming executioner protein of necroptosis MLKL. Trafficking and oligomerization of phosphorylated MLKL at the cell membrane results in cell lysis, characteristic of necroptotic cell death. The nucleic acid sensor ZBP1 is activated by binding to left-handed Z-form double-stranded RNA (Z-RNA) after infection with RNA and DNA viruses. ZBP1 activation restricts virus infection by inducing regulated cell death, including necroptosis, of infected host cells. Immunofluorescence microscopy permits the visualization of different signaling steps downstream of ZBP1-mediated necroptosis on a per-cell basis. However, the sensitivity of standard fluorescence microscopy, using current commercially available phospho-specific antibodies against human RIPK3 and MLKL, precludes reproducible imaging of these markers. Here, we describe an optimized staining procedure for serine (S) phosphorylated RIPK3 (S227) and MLKL (S358) in human HT-29 cells infected with herpes simplex virus 1 (HSV-1). The inclusion of a tyramide signal amplification (TSA) step in the immunofluorescent staining protocol allows the specific detection of S227 phosphorylated RIPK3. Moreover, TSA greatly increases the sensitivity of the detection of S358 phosphorylated MLKL. Together, this method enables the visualization of these two critical signaling events during the induction of ZBP1-induced necroptosis.

Tyramide signal amplification during immunofluorescent staining enables the sensitive detection of phosphorylated RIPK3 and MLKL during ZBP1-induced necroptosis after HSV-1 infection.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...