이 작품은 정신 분열증 연구에 대한 국가 연합과 우울증 (NARSAD) 젊은 연구자 상과 건강의 국립 연구소 AV에 R01NS073635을 부여에 의해 지원되었다.

1. 시약 및 솔루션의 준비 <ol><li> 35mm 문화 요리의 코팅 : 콜라겐 타입 1 용액은 20 mM의 아세트산 (~ 100 mg의 단백질 / 유리 병)의 수용액으로 공급된다. 무균 조직 배양 등급의 물을 사용하여 0.01 %의 작업 농도로 콜라겐 용액의 적절한 볼륨을 희석. 1 실온 (RT)에서 3 ~ 4 시간 동안 콜라겐 솔루션의 ML 37 ° C, 또는 밤새 2-8 ° C에서와 코트 요리 코팅 접시에서 여분의 용액을 제거하고 밤새 건조 할 수 있습니다. 미디어를 추가하기 전에 조직 문화 등급 물 또는 PBS와 함께 요리를 씻어. 코팅 요리는 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 완전한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)을 준비합니다. (, 1 ml/100 ML 1X 농도) 10 % FBS와 항생제 항진균 솔루션 DMEM (500 ㎖) 보완. 전체 DMEM는 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 분취 DNA 분해 효소 I (0.001 ㎎ / ㎖)과의 DMEM (50 ㎖)을 준비하고, (D라고도MEM-DNA 분해 효소 I). </li><li> 콜라게나 제와 디스 파제 (DMEM-collagenase/dispase라고 함) (1 ㎎ / ㎖)로 DMEM의 또 다른 분취 액 (10 ㎖)을 준비한다. </li><li> EGF (5 μg)로 보충 내피 세포 배양 매체 (ECCM, 500 ㎖), 준비, 심전도 (100 mg)을하고 항생제 항진균 솔루션의 5 μL. ECCM은 두 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 사용하기 전에 모든 미디어를 Prewarm. </li><li> 0.5 % BSA, 2 mM의 EDTA와 PBS, pH를 7.2 : 정화 버퍼를 준비합니다. 차가운 버퍼를 유지 (2-8 ° C). </li></ol> 2. Telencephalon의 태아 및 해부 제거 실험 동물을 사용하는 모든 실험은 맥린 병원의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침을 준수하고 있습니다. <ol><li> 시간이 초과 임신 CD1 마우스 (배아 일 15)를 사용합니다. 질 플러그 발견의 날은 배아 일 0 (E0)로 간주됩니다. CD1 댐은 일반적으로 큰 새끼를 생산, 그래서 10 ~ 12 배의는 임신 댐에서 예상된다. </li><li> 자궁 절개술의 경우, 케타민 (100 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 임신 한 쥐를 마취. 쥐 20 ~ 30의 G, 10 ㎖ / kg 케타민 / 자일 라진 마취 솔루션의 0.3 ML를 제공하고 그 고통을 확인하고 조난 마취의 복강 내 주사시 최소한의 것입니다. 주사를 손 구속을 사용합니다. </li><li> 발가락 핀치에 의해 깊은 마취를 확인합니다. 깊이 마취 생쥐에서 배아를 제거합니다. 바로 어머니로부터 제거시 각각의 배아 목을 벨. 얼음 차가운 PBS의 멸균 페트리 접시에 배아 머리를 놓습니다. </li><li> 2013 판 : 마취제를 과다 복용 (130 ㎎ / ㎏ 펜토 바르 비탈, IP), 동물의 안락사에 대한 AVMA 가이드 라인과 일치 안락사를위한 방법으로 즉시 안락사에 의해 자궁 적출술을 따르십시오. </li><li> 스테레오 현미경, 미세 마이크로 팁 가위와 미세 집게로 머리에서 뇌를 제거합니다. 참고 : 높은 품질의 해부를이온 성공적으로 배아 뇌에서 pial 막을 제거하는 것이 필수적입니다. 이것은 연습에 의해 달성된다. 미세 집게와 마이크로 팁 가위는 좋은 해부를 가져 오기위한 중요한 도구입니다. </li><li> pial 막을 벗겨하는 두뇌와 마이크로 팁 가위에 확고한 그립을 얻을 수있는 집게를 사용합니다. 중뇌와 metencephalon를 제거하고 telencephalon을 격리 할 것. 얼음에 2 ㎖의 PBS와 35mm 배양 접시에있는 모든 배아에서 pial없는 telencephalon을 전송합니다. </li></ol> 3. 세포 격리 <ol><li> 메스 블레이드 1-2 밀리 조각으로 telencephalon을 말하다하고 완전한 DMEM 2 ㎖를 포함하는 15 ML 팔콘 튜브에 조직을 수집합니다. </li><li> 수풀이 사라지고 유백색 현탁액을 얻을 때까지 1 ㎖ 피펫으로 부드럽게하지만 철저하게 조직을 떼어 놓다. </li><li> 원심 분리기는 RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 세포를 분해. </li><li> 조심스럽게 CE 해리 부드럽게 DME​​M-DNA 분해 효소 I.에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거LLS 다시 실온에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 1 ㎖ 피펫과 원심 분리기를 사용하여. </li><li> 따뜻한 완전한 DMEM에서 펠렛을 재현 탁. 멸균 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 세포. 필터링 된 세포를 수집하고 얼음에 보관. </li><li> 메시에 보관 세포 일부를 수집하고 실온에서 1 ~ 2 분 동안 DMEM-collagenase/dispase (2 ml)로 더 소화. RT에서 5 분 동안 800 ~ 1,000 XG에서 원심 분리를 통해 DMEM-DNA 분해 효소 나 세포 배를 씻으십시오. 단계 3.5에서 수집 한 필터링 된 세포와이 세포 해변. 완전한 DMEM에 한 번 전체 세포를 씻으십시오. 휴대폰 번호 및 자기 라벨 단계를 결정하기 위해 진행합니다. 주 : 자기 라벨링 전에 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요하다. </li></ol> 4. 자기 레이블 <ol><li> 이 프로토콜은 10 7 세포의 자기 라벨을 보여줍니다. 세포 수의 경우보다 낮은 10 7은 동일한 시약 볼륨을 사용하는 세포 수에 대한보다 큰 10 7, 모든 시약 볼륨과 전체 볼륨을 확장이에 따라 (예를 들어, 2 × 10 7 합계 셀에 대한 모든 지시 시약의 두 배 볼륨을 사용). 얼음의 모든 시약 및 세포를 유지합니다. </li><li> 혈구와 세포 수를 결정합니다. </li><li> RT에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. </li><li> CD31 마이크로 비즈의 10 μL 다음 세포 펠렛을 정화 버퍼의 90 μl/10 7 세포를 추가합니다. 제조사에 의해 제공된 마이크로 비드 항 마우스 CD31 항체 단클론 접합된다. </li><li> 잘 섞어 냉장고에 15 분 동안 품어. 참고 : 자기 라벨 동안 높은 온도 및 / 또는 더 긴 배양 시간이 비특이적 결합이 발생할 수 있습니다. </li><li> 10 분 300 XG에서 정화 버퍼와 원심 분리기의 1-2 ml/10 7 세포를 추가하여 세포를 씻으십시오. 정화 버퍼 500 μL에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 자기 분리 또는 정제 단계로 넘어갑니다. </li></ol> 5. 푸rification <ol><li> MACS 분리기의 자기 분야에서 MS의 열을 놓습니다. </li><li> 정화 버퍼 500 μL에 열을 씻어. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 높은 세포 수는 열을 방해 할 수 있으므로 MS의 열을 셀의 해당 번호를 넣습니다. 주의 : 각 MS의 열은 열을 사용, 높은 세포 수에 대한 2 × 10 7 세포의 최대 수를 수용 할 수 있습니다. </li><li> 수집 및 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 정화 버퍼 500 μL로 3 회 열을 씻으십시오. 세척 단계에서, 열 저장 후속 정화 버퍼 분주을 추가하기 전에 비어 있는지 확인합니다. </li><li> MACS 분리기에서 열을 제거하고 15 ML 팔콘 튜브에 놓습니다. </li><li> 플런저는 MS의 칼럼과 함께 제공됩니다. 피펫 MS의 칼럼에 즉시 정화 버퍼의 1 ㎖를 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지 세포를 세척하십시오. </li><li> 플레이트 CEL콜라겐 1 형 프리 코트와 95 % O 2 5 % CO 2와 37 ° C로 설정 인큐베이터에 ECCM의 세포를 성장 35mm 배양 접시에 LS. </li><li> 4 일마다 매체를 변경합니다. 요리가 합류 할 때 10~12일 후 실험 또는 하위 문화에 대한 PVECs를 사용합니다. </li></ol> 6. PV ECS의 서브 컬쳐 <ol><li> ECCM을 제거하고 멸균 PBS의 1 ~ 2 ㎖로 PVECS의 단층을 씻어. </li><li> 조심스럽게 세포 단일 층을 포함하는 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 5-7 분 내에 세포 접시의 표면으로부터 분리된다. </li><li> 세포를 분리 한 후, 즉시 트립신 억제제의 동량을 추가하고 여러 번 씹다. </li><li> 멸균 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송합니다. 5 분 동안 500 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 예비 가온 ECCM의 1 ml의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 문화, 메신저를 확장하기위한 세포를 씨앗노화 또는 다른 분석. </li></ol>

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	<li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system.">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li><li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo.">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS:+a+new+twist+on+an+old+tale.">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li><li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li><li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia,+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits.">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream.">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

PVEC의의는 더 생리학 관련 신경 혈관의 상호 작용에 초점을 맞추고 연구를위한 다른 조직 소스에서 성인 뇌의 내피 세포와 내피보다도 치료 가능성이있다. PVEC 준비, 그것은 죽은 세포가 CD31 마이크로 비드에 비특이적으로 결합 할 수 있기 때문에 좋은 가능성을 달성하기 위해 빠른 작업 박리 중요한 시작입니다. 단일 세포 현탁액은 종래 자기 라벨링 단계에 도달하지 않은 경우 세포 덩어리가 열?...

혈관, 신경 및 신경 세포의 이주는 중추 신경계 (CNS) 개발, 수리 및 재생에 중요한 이벤트입니다. 여러 우아한 연구는 내피 세포 용해 인자의 방출을 통해 직접 접촉에 의해 신경 세포의 증식과 그 반대를 자극하는 것으로 나타났습니다. 우리는 호기심이 신경 전구 세포 / 신경 줄기 세포가 배아의 뇌에서 분리하는 동안 이러한 연구 1-3의 대부분에서, 그들은 성인의 뇌, 다른 성인 조직 소스, 또는 내피 세포 라인에서 내피 세포와 공 배양 된 것으로 나타났습니다. 이 부분에서 배아 뇌에서 혈관 내피 세포의 순수한 인구를 분리하고 배양과 관련된 기술적 인 문제로 인해 수 있습니다. 그러나, 혈관, 신경 및 신경 세포의 이동은 정상 성인의 뇌에 비해 배아 뇌의보다 강력한 규모의 명령에서 발생하는 동시 이벤트입니다. embryoni의 뇌실 주위 혈관 네트워크C의 전뇌 (telencephalon)는 기저핵 primordium 내에 위치한 용기에서 유래 및 배아 일 11 (E11) 4,5에 의해 telencephalon을 등쪽에 복부에서 질서 그라데이션의 형태로 개발하고 있습니다. 뇌실 주위 혈관 네트워크의 혈관이 혈관 따위의 기원, 해부학 적 위치, 성장 패턴 및 개발 규제 4.5에 따라 pial 혈관에서 구별된다. 뇌실 주위 혈관의 그라데이션의 전파 방향은 telencephalic 가로 neurogenetic 그라데이션과 일치합니다. telencephalon 내에서 뇌실 주위 혈관의 그라데이션 및 마이그레이션 GABA 신경 세포의 기울기가 접선 ​​방향으로뿐만 아니라 공간적으로 6 겹칩니다. 타이밍에 대하여, 혈관 신생 구배는 약 하루 neurogenetic 구배 및 GABA 뉴런 구배 앞서있다. 따라서, 뇌실 주위 내피 세포는 공간적이며 시간적 잘 telencephalic 신경을 지원하는 중요한 단서를 제공하는 위치 결정신경 세포의 이주 4,6. 따라서, 신경 전구 세포 및 / 또는 신경 세포와 공 배양 실험에서 배아 뇌실 주위 내피 세포의 사용은 뇌 혈관의 상호 작용을 공부하고 신경 퇴행성 질환이나 허혈성 / 외상성 뇌 손상의 치료를위한 새로운 수단을 개발하기위한보다 유리한 모델을 제공 할 것이다. 우리는 상피 세포의 오염을 제한 할뿐만 아니라, 분자 및 뇌실 혈관 네트워크 4,6 (pial되는 EC 구별하기 칭했다 PVECs)의 내피 세포에서 기능적으로 구별되는 pial 내피 세포를 분리하는 것뿐만 아니라, pial 막 제거의 중요성을 강조 . 여기에서, 우리는 우리가 일상적으로 PVECs의 풍부하고 순수한 수율을 얻을 수 있도록 실험실에서 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 내피 세포는 하나의 정해진 임신 마우스에서 분리 된 배아 forebrains에서 준비가되어 있습니다. 그들은 나중에 사용하기 위해 성공적으로 확장 계대 배양, 아래로 고정 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagen, Type 1 solution from rat tail&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Quality Biologicals</td><td>114057-131</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MS column</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CD31 microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MACS separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MACS multi stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiotic and antimycotic solution</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Culture dish</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECCM kit</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>Cell Applications</td><td>R819-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue culture grade water</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Biotinylated Isolectin B4 antibody</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Von Willebrand factor</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein Animal Health Supply</td><td>44028</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine microtip scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain

배아 뇌 혈관 내피 세포는 혈관 및 신경 혈관 개발 및 상호 작용의 연구에 중요한 도구 역할을 할 수 있습니다. 배아 전뇌, pial 뇌실 주위 백질의 두 혈관 네트워크는 공간적 특징이며, 서로 다른 기원과 성장 패턴이 있습니다. pial과 뇌실 주위 혈관 네트워크에서 내피 세포는 고유의 유전자 발현 프로파일과 기능을 가지고 있습니다. 여기서 우리는 배아 전뇌 (telencephalon)의 뇌실 주위 혈관 네트워크 (PVECs)에서 내피 세포의 순수한 인구의 분리, 배양 및 검증을위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 이 방법에서는, 배아 일 15 쥐에서 얻은 pial 막의없는 telencephalon는, 다진 콜라게나 / 디스 파제로 소화, 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 분산. PVECs은 강한 자석을 사용하여 마이크로 비드에 접합 anti-CD-31/PECAM-1 항체와 긍정적 인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정제된다분리 방법. 그들이 합류하고 추가 계대 배양 될 때까지 정제 된 세포는 내피 세포 배양 배지에서 콜라겐 1 코팅 된 배양 접시에서 배양한다. 위상차 광학 현미경과 형광 현미경에 의해 시각으로 PVECs,이 프로토콜 전시 조약돌 스핀들 모양의 표현형을 얻을. PVEC 문화의 순도는 내피 세포 마커로 설립되었습니다. 우리 손에,이 방법은 확실하고 일관되게 PVECs의 순수한 인구를 산출한다. 이 프로토콜은, 전뇌 혈관 신생에 기계적인 통찰력을 얻고 PVEC 상호 작용 및 신경 세포 유형과 상호 대화를 이해하고 치료 혈관 신생에 대한 엄청난 잠재력을 보유하기위한 연구를 도움이 될 것입니다.

하루 1-12 PVECs의 표현형 특성은 위상 대비 광학 현미경 (그림 2)으로 표시됩니다. 세포 분열 (그림 2A)의 1 일 쇼 형태 특성에 접시에 부착 된 세포. 5-8일 사이에 자갈 돌에서 PVECs의 전환은 내피 세포 (그림 2B 및 2C)의 생체 상태에 더 가깝다 전형적인 모양의 형태를 스핀들. 하루 12 PVEC 문화 전체 합류 (그림 2D)을 달성한다. PVECs 식?...

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K 조회수.  Harvard Medical School.  이 비디오 10-12 일 이내에 배아 전뇌에서 내피 세포의 순수 문화의 준비를위한 간단하고 신뢰할 수있는 전략을 설명하고 뇌 혈관의 여러 측면에 초점을 맞춘 연구를 위해 도움이 될 것입니다. 

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Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

연구

발생학

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

신경과학

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

생물학

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

마우스 관상 내피 세포의 분리

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...