스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.

1. 면역 형광 다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에서 이소 펜탄에 담가 냉동. 코로나 뇌 저온부 (20 μm의)는 직렬로 잘라 면역 프로토콜 11, 6을 실시한다. 사용하기 전에 실온에 모든 시약 및 샘플을 가져와. 항체 혈청의 제시 작업 희석이 최적의 성능을 얻기 위해 만든 시험의 결과주의하시기 바랍니다. 다른 항체 및 혈청을 사용하는 경우, 프로토콜은 검증 될 필요가있다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 안티는 CD11b 및 안티 CD68 모두 차 항체는 쥐에서 만들어지기 때문에, 우리는 형광 신호 증폭과 함께 다음에 안티는 CD11b의 높은 희석을 사용 안티 쥐 알렉사 546에 의해 교차 신호를 방지 할 수 있습니다 TSA 키트 (Cy5에 Tyramide). 우리는 단계 1.17을 제외하고는 설명 프로토콜을 수행하고 표 1에보고 된 항-CD11b를 적어도 7 가지 희석액을 사용하여 안티 CD11b를위한 최적의 작업 희석을 설정했습니다. , 여기 파장에서 알렉사 546 2) 신호가 532 nm의 1) 눈에 보이는 신호 Cy5에있는 여기 파장 646 nm에서 : 그 결과, 1:30,000 유일한 희석 달성하는 것을 선택하고있다. 이러한 방법으로, 알렉사 546 형광 신호를 선택적으로 CD68의 발현과 연관되어 있습니다. 안티는 CD11b 및 안티 CD68 항체에 대한 최적의 희석은 조직의 유형에 따라 다를 수 있으며, 공동 라벨 프로토콜을 시작하기 전에 정의해야합니다. <ol><li> PBS로 두 번 뇌 저온부을 씻으십시오. </li><li> 에O 2 (형광 증폭 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 스트렙 타비 딘-HRP와 함께 배양을해야하므로 필요한 단계는 단계 1.12 참조) 1 % H 2를 포함하는 PBS에서 5 분 cubate 저온부. </li><li> 세척 저온부 PBS로 2 배. </li><li> 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> PBS는 기본 AB 쥐 안티 CD11b를 [1:30,000], 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어. </li><li> 세척 PBS로 2 배 (5 분) 저온부. </li><li> 바이오틴 차 반대로 쥐 AB [1:200] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 2 배. </li><li> TNT (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20 트리스 - 염산, 염화나트륨, 트윈)와 저온부을 씻으십시오. </li><li> TNB에서 1​​.5 시간 동안 저온부를 품어 (버퍼 트리스 - 염산 - 염화나트륨 블로킹 : 0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 적절한 키트에서 0.5 % 차단 시약 (시약의 표 참조)). </li><li> 씻어내는섹션은 TNT와 시간을 3 배. </li><li> 스트렙 타비 딘-HRP [1:100]을 포함 TNB의 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부는 TNT와 3 배. </li><li> 시아닌 5 Tyramide [1:300]을 포함 증폭 희석제 8 분 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 10 % NGS 0.1 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> PBS는 기본 AB 쥐 항 CD68 [1:200], 3 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> fluorconjugated 차 AB 알렉사 546 안티 쥐 [1:500] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 헥스 1 ㎍ / ㎖의를 포함하는 PBS에서 10 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 머리말 골드에서 저온부를 탑재합니다. </li></ol> 2. 공 초점 현미경으로 3 차원 영상의 획득 <ol><li> 흥분되는 형광 염료의 파장에 따라 여기 레이저를 선택 (Cy5에, CD11b를위한 그는 네브라스카 레드, Alexa546, CD68 및 훽스트, 핵에 대한 UV 다이오드 그는 네브라스카 녹색). </li><li> 빛 신호 수집을위한 최적의 다이크로 익 미러의​​ 조합을 선택합니다. </li><li> 800 x 600 픽셀의 최소 이미지 해상도를 설정합니다. </li><li> 에피 형광을 사용하여 점진적으로 40X 목적으로 배율을 증가하여 관심의 영역을 식별합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 양상으로 전환합니다. </li><li> 광전자 증 배관 (PMT) 및 각 채널의 게인을 조정하는 반복적 인 검사를 실행합니다. 레이저는 셋업을 용이하게하기 위해 개별적으로 설정 될 수있다. 원치 않는 비특이적 신호를 피하기 위해 가능한 한 낮은 이득을 유지한다. </li><li> REPE로titive 검사 실행, z 축 (총 z 축 길이 = 10 ㎛)의 하부 및 상부 극단을 정의하는 초점 제어를 이동합니다. </li><li> 반복적 인 검사를 중지합니다. </li><li> 스텝 크기를 정의합니다. 이는 Z-축 위에 표준 1시 1분 크기 비율을 구하기 픽셀 크기 (0.225 μM)에 가능한 한 가까워 야한다. </li><li> 칼만 필터에게 최소한 2 회를​​ 활성화합니다. </li><li> 비쳐 효과를 피하기 위하여 순차 주사 모드를 활성화. </li><li> 반쯤 Z-축을 따라 이동하여 XY 연속 스캔을 실행합니다. PMT의 설정 및 게인 (좋은 신호 / 노이즈 비율)을 확인합니다. 만족스럽지 않은 경우, 단계를 반복합니다 2.6. </li><li> XYZ 인수를 실행합니다. </li><li> multitiff 파일로 데이터를 내 보냅니다. 각 multitiff 파일은 일반적으로 3 색 채널 (파랑, 녹색, 빨강), 44 초점 비행기가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. 공 촛점 취득 및 입체 렌더링의 3 차원보기 Imaris 소프트웨어 multitiff 파일을 업로드하고 다음을 처리 : <ol><li>공개 소프트웨어. </li><li> 능가보기를 선택합니다. </li><li> multitiff 파일을 업로드합니다. </li><li> 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다. </li><li> 디스플레이 조정 패널 최소값을 증가시킴으로써 배경으로부터 노이즈를 제거한다. 개별적으로 각 채널을 조정합니다. </li><li> 섹션보기로 이동합니다. 공동 현지화 (노란색 픽셀)을 찾고 Z-축을 따라 이동합니다. </li><li> colocalization을가 z 축 (즉, 고체 개체에 속하는)을 따라 존재 여부를 확인하기 위해 노란색 영역을 클릭합니다. Z-축 돌기는 그림의 오른쪽 아래 부분에 볼 수 있습니다. </li><li> 스냅 샷을 가져 가라. </li><li> 보기를 능가로 이동. </li><li> 셀 또는 셀 클러스터를 분리하는 3D를 자릅니다. </li><li> 화면 조정 패널에 하나의 채널을 선택합니다. </li><li> 능가 / 표면 알고리즘 빌더를 선택합니다. 알고리즘 단계 : <ol><li> 채널을 선택합니다. </li><li> 임계 값을 정의 (t에서 동일한 최소 값을 사용그는) 조정 패널을 표시합니다. </li><li> 크기 조정 정의합니다. </li><li> (최고의 = 0.200) 스무딩 정의합니다. </li><li> 색상의 외관을 정의합니다. </li><li> 알고리즘을 종료합니다. </li></ol></li><li> 각 채널에 대해 단계 3.12를 반복합니다. </li><li> 화면 조정 패널에 형광 채널을 모두 취소하고 모든 세 개의면을 선택합니다. </li><li> 최고의 전망을 찾기 위해 볼륨을 이동합니다. </li><li> 스냅 샷을 가져 가라. </li></ol>

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	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+stroke:+therapeutic+targets.">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li><li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma.">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li><li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment.">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373 (2007).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943 (2011).</li><li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages.">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li><li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury.">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최?...

급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히​​ 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 9-10에 관련된. 두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vectors Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 confocal microscope </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris software 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software packages GraphPad Prism version 4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury

뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다. 구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.

라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분...

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K 조회수.  IRCCS - Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri.  뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다. 

비디오: Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

연구

의학

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

신경과학

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

면역학 및 감염병학

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응의 시스템 분석

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

A Preclinical Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Hemorrhage Contusion and Neuroinflammation

Cerebral contusion is a severe medical problem affecting millions of people worldwide each year. There is an urgent need to understand the pathophysiological mechanism and to develop effective therapeutic strategy for this devastating neurological disorder. Intraparenchymal hemorrhage and post-traumatic inflammatory response induced by initial physical impact can aggravate microglia/macrophage activation and neuroinflammation which subsequently worsen brain pathology. We provide here a controlled cortical impact (CCI) protocol that can reproduce experimental cortical contusion in mice by using a pneumatic impactor system to deliver mechanical force with controllable magnitude and velocity onto the dural surface. This preclinical model allows researchers to induce moderately severe focal cerebral contusion in mice and to investigate a wide range of post-traumatic pathological progressions including hemorrhage contusion, microglia/macrophage activation, iron toxicity, axonal injury, as well as short-term and long-term neurobehavioral deficits. The present protocol can be useful for exploring the long-term effects of and potential interventions for cerebral contusion.

<meta charset="utf8"></head><body>외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

Intraparenchymal hemorrhage and neuroinflammation accompanied by cerebral contusion can trigger severe secondary brain injury. This protocol details a mouse controlled cortical impact (CCI) model allowing researchers to study hemorrhage contusion and post-traumatic immune responses and explore potential therapeutics.

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

Cerebral contusion is a severe medical problem affecting millions of people worldwide each year. There is an urgent need to understand the ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응의 시스템 분석

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델