세포 격리 후 전체 프로토콜은 약 2 시간 소요됩니다. 1. 미세 수술 준비 <ol><li> 9,12은 세포가 동물의 동작을 행하는 시간 동안 휴식을 허용하는 표준화 된 프로토콜에 따라 도너 골수 및 절연 모집단의 형광 라벨링에서 줄기 세포 분리를 수행한다. 형광 표지를 위해 우리는 CFDA (카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르)를 추천합니다. </li><li> 케타민 (75 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2.5 ㎎ / ㎏) 20-25 g의 무게 남성 마우스를 마취. (일반적으로 매일 30 ~ 60 분) 필요에 따라 수술 및 실험 프로토콜을 통해, 마취 보조제로 (초기 주입의 10 %, IP)을 유지해야한다. </li><li> 부드럽게 오른쪽 음낭의 앞쪽 측면뿐만 아니라 오른쪽 허벅지와 사타구니를 면도. 모든 적신 면봉으로 머리를 잃을 수집합니다. 플렉시 글라스 시청 무대에서 마우스 복부 측면을 배치하고 수수료를 수정탄력있는 주름을 사용하여 t. 무대는 다리와 음낭 모두 상승의베이스 플레이트의 꼬리 가장자리에베이스 플레이트와 제 2 플레이트로 구성, 맞춤 제작된다. 37 ℃의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 스테이지를 놓고 스테이지에 고정 후, 조작 현미경 동물을 배치하고 (10)를 사용하여 다음의 조작을 수행하는 단계 - 16 배 배율로. </li><li> 사타구니까지 오른쪽 허벅지, 무릎에서 대퇴 혈관의 바로 앞쪽에 피부 가위를 사용하여 초기 절개를합니다. </li><li> 대퇴 동맥을 확인하고 주위 조직에서 동맥을 동원, 근위를 따릅니다. 확인하고 thermocautery 사용하여 왼쪽 고환에 큰 가지를 잘라. 그 후 왼쪽 고환에 표면적으로 숙박 봉합을 배치합니다. 부드러운 견인은 대퇴 동맥의 추가 근위 동원을 용이하게합니다. </li><li> 근위 동원 종료 후, 식별하고 대규모 분기 실행 mediall 컷thermocautery에 의해 허벅지에 y를 입력합니다. 그 후 오른쪽 허벅지의 말단 부분에있는 대퇴 동맥을 결찰. 합자에 부드러운 견인 더 준비를 도움이됩니다. </li><li> 다시 근위 대퇴 동맥에 지금 관심을 뒤집어 근위 가능한 동맥 주위의 봉합을 배치합니다. 매듭을 준비했지만 아직 묶어하지 않습니다. 봉합에 부드러운 견인을 적용하고 동맥 꼬임을 만들 수 있습니다. </li><li> 꼬임을 설정 한 후, 동맥 신중 microscissor을 사용하고 절개. 대퇴 정맥이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 절개를 통해 준비된 microcatheter (내경 0.28 mm)를 삽입합니다. 카테터 (0.9 % 염화 나트륨, 염화나트륨)을 탈기하고 1 ㎖ 주사기 삽입 이전에 연결되어야한다. </li><li> 카테터의 성공적인 삽입 후, 정중 카테터의 통과를 용이하게하기 위하여 꼬임을 풀어. 동맥 혈류량은 카테터 내에 즉시 볼 수 있어야한다. 부드럽게 카테터를 몇 밀리미터를 진행이전 꼬임 이후의. 그 후, 카테터의 고정을위한 준비 합자를 묶어. </li><li> 부드럽게 정확한 위치를 확인하기 위해 카테터 (0.9 % 염화나트륨)과 대기음을 세척하십시오. 추가 작업 단계에 카테터를 확보하기 위해 테이프의 조각을 사용합니다. </li><li> 적절한 고정 후, cremaster 근육의 다음과 같은 준비 단계를 따로 카테터를 넣어. 혈전 형성을 방지하기 위해 정기적 인 세척 및 카테터마다 5 ~ 10 분의 열망을 적용합니다. </li><li> 오른쪽 음낭에 지금 관심을 켜고 오른쪽 음낭의 복부 측면 위의 피부와 근막을 절단하여 절개를합니다. 모든 악기와 기본 조직을 건드리지 않도록주의하십시오. </li><li> 최대 사타구니 배와 꼬리 쪽 음낭의 말단부에 절개를 확장합니다. </li><li> 그것을 건드리지 않고 cremaster 자루 위를 조심스럽게 분리 기본 부드러운 결합 조직. cremaster의 말단부를 식별하고, SL 여기 숙박 봉합을 배치ightly 근육을 확장 할 수 있습니다. 부드럽게 꼬리 쪽과 앞쪽 근육을 당겨 근육 자루 아래에 지금 남아있는 연부 조직을 절제. </li><li> 결합 조직에서 완전히 분리 한 후, 가위를 사용하여 두개골 가장자리에 한 지점에서 cremaster의 자루를 엽니 다. 근육의 선단이 개방 아래에서 절개를 확장합니다. </li><li> 그 후 가위를 사용하여 근육과 고환 사이의 나머지 연결을 절단, thermocautery 사용하여 고환과 cremaster를 연결하는 작은 용기를 밀봉. </li><li> 현미경 필드 중에 고환을 옆으로 누워. </li><li> 열린 cremaster 이제 무대에 평평. cremaster 근육 조직을 확산하기 위해 조직의 가장자리에 네 6-0 Prolene으로 숙박 봉합을 배치하고 탄력있는 주름으로 수정합니다. 지금부터 연속적으로 1 ㎖ 주사기 (도 1)를 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 조직을 적실. </li><li> 지금 15 분 동안 휴식을 준비 할 수 있습니다. 그 후 주입미세 혈관의 콘트라스트 향상을위한 좌측 대퇴 동맥을 통해 1 % 로다 민 - 덱스 트란의 0.05 ~ 0.1 ML. 어떤 케모카인이나 염증성 에이전트가 응용 프로그램에 대한 계획하는 경우, 당신은 지금 화제로 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 시약과 근육을 습하게한다. 대조 실험의 경우, PBS로 가습 계속. </li></ol> 2. 의 intravital 현미경 <ol><li> 가동 스테이지 상에 고정 된 마우스를 유지하고 에피 조명용 변성 및 CCD (전하 결합 소자) 비디오 카메라에 접속 형광 현미경으로 움직인다. 대퇴 동맥 카테터를 탈구하지 않도록 특별한주의를 기울입니다. </li><li> 침수 목표를 사용하여 실험을 실시하고 있습니다. </li><li> cremaster의 미세 혈관의 충분한 시각화 및 세포 주입하기 전에 목표를 조정 한 후, 확률 적으로 회사의 줄기 세포 부착 이후 분석을 위해 여섯 후 모세관 세정맥을 정의합니다. </li><li> 형광 표지 된 줄기 세포를 관리,대퇴 동맥 카테터를 이용하여 다섯 경기를 연속으로 주사의 총과 1 ML의 주사기와 주입 당 0.4 × 10 6 세포에 200 ㎕의 PBS에 용해. 에 앞서 첫 번째 주사로 세포 샘플을 흔들어. </li><li> 기록 줄기 세포함으로써 일반적인 세​​포와 함께 내피 안감을 따라 셀 속도의 50 % 이상 감소로 &quot;만들기&quot;를 정의, 세포 주입 후 즉시 롤링 &quot;스틱 및 해제&quot;운동을. 롤링 줄기 세포의 카운팅과 매 사출 다음 관찰 한 분 동안 미리 정의 세정맥 거리를 통과하는 모든 줄기 세포를 수행한다. 줄기 세포 말기의 양은 모두 전달 세포의 백분율로서 표현된다. 롤링 세포로 무작위 간단한 테 더링 현상을 보이는 세포를 계산하지 않습니다. </li><li> 마지막 셀 사출 카운트함으로써 단단히 부착 줄기 세포의 수를 결정하고 번째의 계산 내피 표면 관계로 양을 표현 다음전자 사전 정의 된 6 개의 작은 정맥 (직경 x 길이 x π) 부착 세포 / mm 2로. 어떤 세포의 움직임이 30 초 동안 감지 할 수 없을 때 회사 접착 간주됩니다. </li><li> 의 intravital 현미경을 완료 한 후 신중하게 cremaster 근육을 제거하고 나중에 분석 (면역 조직 화학이나 분자 생물학)에 대응하여 저장합니다. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 줄기 세포 압연 회사 내피 부착뿐만 아니라, 적혈구 속도 (mm / 초), 선박 길이 (μm의), 혈관 직경 (μm의), 벽의 공유 속도와 같은 미세 혈관 혈류 역학의 정량의 intravital 현미경 기록의 분석 (초 -1), 이미지 처리 소프트웨어를 이용하여 각 실험 조직 치료 멀게 조사자에 의해 오프라인으로 수행되어야한다. </li></ol>

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이 원고를 실시 모든 동물 실험은 지역 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

<html> 의 intravital 형광 현미경 직접 시각화 및 줄기 세포 내피 세포 상호 작용의 정량 분석​​을 할 수 있습니다. 노광 및 미세 수술 기술의 intravital 시각화가 잘 백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 다양한 화학 성분에 대한 연구 중에 선택적 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수있는 확립 된 이후 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다. 인해 움직임 아티팩트 심한 화상 노이즈의 부재로,?...

본 문서의 목적은 주변의 골수 줄기 세포 이동의 직접 관찰 및 분석을위한 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술 (IVM)를 설명하는 것입니다. 줄기 세포의 현재 개념 기반의 조직 및 장기 재생은 손상된 조직 1 골수 유래 줄기 세포의 원점을 포함한다. 성공적인 줄기 세포의 이동을위한 중요한 단계는 내피 마이그레이션 결국 장기 생착 2 다음에 부상 기관 내에서 지방의 내피 세포와 세포의 상호 작용을 줄기가 포함되어 있습니다. 이러한 줄기 세포의 intravital 분석 - 내피 세포 상호 작용은 생체 내에서 서로 다른 병태 생리 학적 설정에서 줄기 세포 기반 재생 반응의 정량화를위한 ​​이상적인 매개 변수를 형성한다. 게다가 생각할 보인다, 미래에 특정 줄기 세포 (P)의 이동성 용량의 intravital 분석표준화 된 미세 순환 환경 내 opulations는 이전에 추가 임상 시험에이 인구를 전진 적용 할 수 있습니다. 의 intravital 현미경 초기 염증 연구 3의 분야에서 생체 내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 관찰 및 정량화를 위해 개발되었다. 의 intravital 현미경 연구의 첫 번째 성공 기록은 광학 현미경 4에서 개구리 &#39;방언과 mesenteries을 공부하고, 19 세기에 이미 Cohnheim에 의해보고되었다. 처음 사용 IVM은 엄청난 기술 개발과 오늘을받은 이후 특정 필수 구성 요소는 양적 IVM을 수행하기 위해 전제 조건을 형성 : (I) 조직 광 액세스를 허용 준비, (ⅱ) 현미경으로 검출 할 수있다 분자 프로브, (ⅲ ) 검출 시스템 및 화상 데이터로부터 그 파라미터를 추출 할 수있다 (iv) 컴퓨터 기반 분석 시스템에 연결된 현미경4를 설정합니다. 조직 준비의 다양한 mesenteries 및 마우스와 쥐 5, 마우스, 6, 햄스터, 토끼 귀 및 이름에 햄스터 뺨 주머니의 등쪽 피하 지방 챔버의 간을 포함 IVM의 연구에 도입되었습니다. 그러나, 준비 및 시각화가 잘 표준화 된 수술로 가능으로 다음에 우리의 intravital 관찰을위한 이상적인 조직을 나타내는 마우스 cremaster 근육에 초점을 맞출 것이다, 그리고 일반적으로 운동의 유물 아무런 문제가 발생하지 않습니다. 오픈 cremaster 근육 준비는 바에즈에 의해 1970 년대에 처음 실시와 동료 7되었다. 원래 쥐에 대해 기재된, 그것은 마우스 (8)에 성공적으로 채택되었다. 이전의 연구는 주로 혈관 벽 백혈구의 상호 작용에 초점을 맞추고 난 후에, 우리 자신의 그룹은 최근에를 증명하는 등의 마우스 cremaster 근육 준비를 도입직접 시각화 및 정의 미세 구 내에서 줄기 세포 - 내피 세포 상호 작용의 정량적 분석을위한 상상력 도구입니다. 각종 줄기 세포 모집단은 뮤린 C-KIT + 골수 줄기 세포 및 중간 엽 줄기 세포뿐만 아니라 인간의 CD (133) + 골수 줄기 세포 10-12 등이 모델을 이용하여 연구되었다. 기증자의 골수 및 시각화를위한 형광 표지로부터 세포 격리 다음, 줄기 세포를 선택적으로함으로써 원격 장기 내의 세포 포획을 회피 대퇴 동맥을 통해 동맥 주입을 이용하는 cremaster 미세 혈관에 적용된다. 잠재적으로 각각 설정 내의 로컬 줄기 세포의 이동을 매개 각종 케모카인이 국소 superfusion 간단한 기술에 의해 표적 조직에 적용 할 수 있기 때문에 한층 cremaster 근육 모델은 특히 유용하다.

<table><tbody><tr><td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Germany</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

회생 세포 치료의 맥락에서 혈관 세포 애플리케이션 프로토콜의 시대에서, 조직 nonmarrow 줄기 세포 이동의 기본 메커니즘은 완전히 명확하지 않았다. 우리는 여기에서 생체 내에서 주변의 골수 줄기 세포 이동의 분석을 위해 마우스 cremaster의 미세 혈관에 적용의 intravital 현미경의 기술을 설명합니다. M.의 cremaster의 현미경의 intravital 이전 혈관 내피 세포와 백혈구 작용의 직접적인 관찰에 염증 연구 분야에 도입되었다. 충분한 주변 줄기 및 전구 세포의 이동은 내피와 intravasculary 관리 줄기 세포의 상호 작용의 관찰과 정량 M.의 cremaster 모델을 적용하기 위해 생각할 수있다 안감 내피에 따라 확고한 접착 롤링 유사한 초기 단계를 포함하기 때문에. 각종 화학 성분을 선택적으로 표적 t에 적용될 수있는 바와 같이superfusion 간단한 기술에 의해 문제는 그것이 골수 변두리 살아있는 유기체에서 일어나는 초기 줄기 세포 모집위한 필수적인 전제 조건의 미세 환경을 확립하는 것이 가능하다.

일반적으로, 직접적으로 상호 작용이 cremaster 근육 미세 혈관 내에서 혈관 내피 세포와 줄기 또는 전구 세포를 주입하는 것은 드문 경우이며, 후 모세관 세정맥 (직경 : 30 ~ 80 μm의)에 독점적으로 발생합니다. 때문에 형광 라벨 압연에 단단히 부착 줄기 세포는 명확하게 (그림 2) 관찰 세정맥에서 내생 백혈구 순환에서 분리 정량화 할 수있다. 혈액 유속 및 벽 전단 ...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K 조회수.  University Rostock.  마우스 M.의 cremaster 미소 순환의 intravital 현미경은 독특하고 주변 골수 줄기 세포 이동의 분석을위한 생체 모델에서 잘 표준화을 제공합니다. 

비디오: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

연구

생물학

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

신경과학

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

면역학 및 감염병학

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

의학

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

엑기스의 Intravital 형광 이미징을위한 Microiontophoresis 및 미세 조작

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...