우리는 RNA 정화 프로토콜을 편집 그들의 도움을 사챠 Reichman 도미니크 Santiard - 남작 감사합니다.

1. 저널 : 외과 블록에서 표본을 복구하는 절차 실험실에서 <ol><li> 급행 선박 회사로부터 수입 계약을 얻는다. </li><li> 연구실 (전화 번호 및 이메일 주소)에서 담당자를 나타내는 실험실 우편 주소 (또는 25) 배송 ​​형태 10를 채우십시오. </li><li> (또는 25) 10 준비 샘플 양식은 10 (또는 25)에 숫자 1. 이러한 양식), 환자의) 익명 ID에 알리기 위해 수술 날짜와 C) 추가 비고란에 의사 추가을 원하십니까 B 전용 공간이 (가) 있습니다. 10 (또는 25) 덧대 진 봉투를 (150 X 210mm) 준비합니다. </li><li> (DEPC) H 2 O (GHCl를) 처리 diethylpyrocarbonate 6 M 구아니딘 클로라이드의 RNase가없는 시약 25 (또는 65) mL를 사용하여 제조. </li><li> 채우기 10 25 GHCl 용액 2.4 ml의 5 ML 멸균 폴리에틸렌 둥근 바닥 튜브를 번호. </li><li> 프레스 TI보다,이 튜브의 상단 부분을 채우기 위해 아르곤 가스를 사용ghtly 수술 캐비닛에 스토리지 몇 년 동안 GHCl 용액의 산화를 방지하기 위해 뚜껑에. </li><li> 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 원뿔 밑바닥 관 나사 모자로 매 5 ML 튜브를 소개합니다. 50 ML 튜브에 10 ML 튜브를 보유하는 깨끗한 종이 조직의 조각을 사용하여 튜브를 닫습니다. </li><li> 패딩 봉투, 운송 양식, 샘플 형태와 골 판지 상자 폴리스티렌 랙과 랙에 50 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 자신의 읽기를 촉진하는 골 판지 상자 뚜껑의 안쪽에 : 지시 사항을 (1.12-1.19 참조) 붙여 넣습니다. </li><li> 병원 담당자에게 우편으로 골판지 상자를 보냅니다. </li></ol> 병원에서 <ol start="11"><li> 수술 방에 수술 장에서 골판지 상자를 가져옵니다. 주의주의 : 절차는 면역 손상 환자를 포함하는 경우, 마분지는 수술 방으로 데려 수 없습니다. </li><li> 수술하는 동안, 망막 specim 배치번호가 5 ML 멸균 폴리 프로필렌에 엉 GHCl 솔루션으로 가득합니다. 단단히 튜브를 닫습니다. </li><li> 간단히 튜브를 반환합니다. </li><li> 10 분 동안 혈액 튜브 로커에 튜브를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 샘플 번호의 양식을 작성하십시오. </li><li> 해당 번호의 50 ML 튜브 위에 식별 번호를보고합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 수술 시편 10 ML 튜브를 소개 티슈를 교체하고 튜브를 고정합니다. </li><li> 첨부 된 패딩 봉투 중 하나 관과 그것으로 채워진 샘플 양식을 소개합니다. 닫습니다. </li><li> 픽업 특급 운송 회사를 호출합니다. </li></ol> 2. RNA 정화 실험실에서 <ol><li> 튜브를 상하로 이동하는 동안 1 분간 균질화와 GHCl 솔루션의 5 ML 튜브 폴리 프로필렌 시료를 균질화. </li><li> 2 M 칼륨 아세테이트 산도 5.0 270 μl를 추가합니다. 그것의 뿌리에 튜브를 삽입하여 10 분 동안 격렬하게 흔들어수평 위치 (420 분 -1). </li><li> 20 ℃에서 5,000 rpm으로 (6,500 XG)에서 10 분 원심 분리 </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 부드럽게 용해 비율을 대기음. </li><li> 14 ML 멸균 튜브에 전송합니다. </li><li> 100 MM 트리스 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %의 5.3 ML를 추가합니다. </li><li> 세슘 클로라이드 (CSCL) 3.2 g을 소용돌이로 교반하여 튜브를 섞는다. </li><li> 멸균 11 ML의 polyallomer 원심 튜브에 CSCL / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 1.8 ML를 추가합니다. </li><li> 10 ㎖ 멸균 파스퇴르 피펫, 밀도 쿠션을 방해하지 않도록 튜브의 가장자리에 천천히 밀어 1.8 ML CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 RNA 솔루션을 전송합니다. </li><li> 회 전자에 튜브를 (망막 필요없이 버퍼를 포함하는 두 번째 튜브) 놓습니다. </li><li> 20 ℃에서 32,000 rpm으로 (225,000 XG)에서 24 시간을 원심 분리기 </li><li> 멸균 파스퇴르 피펫 솔루션의 우수한 부분을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 을 확인하면서 서서히 제거DNA가 (점성) 두 번째 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡입하고, 그것을 폐기되어 순간. </li><li> 제 멸균 파스퇴르 피펫과 RNA 펠렛을 풀어 않도록주의하면서 남아있는 용액을 제거. </li><li> 와 튜브의 섹션 하단 메스 화염 멸균 후 거꾸로 멸균 시선 튜브의 나머지 부분을 넣어. </li><li> 튜브를 반대로 GHCl 160 μL로 섬세하게 헹구십시오. </li><li> 10 분 동안 펠릿 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 150 μL (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)에서 펠렛을 resuspend을. </li><li> 2 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에 솔루션을 전송 한 후 30 ㎕의 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)과 잔류 펠렛을 수확. </li><li> 150 μl를 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 MM 트리스 산도 7.5)을 추가합니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.0, 소용돌이 관의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 에탄올 100 % (-20 ° C), 소용돌이 관 900 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 놓습니다. </li><li> CEN4에서 15,000 rpm으로 튜브 30 분 ° C.를 trifuge </li><li> 미묘 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 μL 70 % 에탄올 (RT), 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4 15,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 펠렛 공기가 건조 보자. </li><li> 50 μL DEPC 처리 된 H 2 O의 펠렛을 resuspend을 </li><li> 로 소용돌이 적극적으로 섞는다. </li><li> 물을 욕조에 45에서 15 분 ° C를 품어. </li></ol> 3. 젤 전기 영동으로 RNA 분석 <ol><li> 화학 후드 내부의 아가로 오스 젤을 붓는다. </li><li> 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 분석 할 수있는 RNA의 2 μL 및 샘플 준비 버퍼의 6.4 μl를 추가합니다. </li><li> 두 번째 1.5 ML 튜브에 RNA 표준의 3 μL 및 샘플 준비 버퍼의 9.6 μl를 추가합니다. </li><li> 65 튜브 15 분을 가열 ° C얼음에 넣어. </li><li> RNA 샘플 튜브와 RNA 표준 관 염료로 1 μL EB로드 버퍼에 염료없이 1 μL ethidium의 브로마이드 (EB) 로딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 염료 중 하나 (브롬 페놀 블루) 젤 아래의 2 / 3를 도달 할 때까지 버퍼를 실행에있는 화학 후드 안쪽에 100 V, - 80 이하 젤을 실행합니다. </li><li> 젤 250 ML 데 DEPC 처리 2X SSC로 두 번 15 분을 씻어. </li><li> UV 조명 아래에서 디지털화 된 이미지를 가져 가라. </li><li> 위 밴드 (23S rRNA의)과 낮은 대역 (16 초 rRNA의) 사이의 비율을 계산합니다. </li></ol> 4. RNA의 최종 정화 <ol><li> DEPC 처리 된 H 2 O (필요한 경우) 100 μL로 RNA 샘플의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 100 페놀 산 μL (1 ML 페놀 나트륨 아세테이트, 산도 5.2의 50 mm의 DEPC 처리 된 H 2 O + 130 μL에서 포화) 적극적으로 소용돌이. 추가 </li><li> 상온에서 13,000 rpm으로 (15,000 XG)에서 10 분 원심 분리기. </li><li> Recove연구는 새로운 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 수성 단계 (상층)을 신중하게 전송할 수 있습니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 에탄올 250 μL 100 % (-20 ° C)의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 알을 품다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 30 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 주의 깊게 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 70 % 에탄올 μL (실내 온도)와 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 공기가 10 분 동안 펠렛을 건조 할 수 있습니다. </li><li> DEPC 처리 된 H 2 O 50 μL로 펠렛을 resuspend을 </li><li> 다음 45 관 15 분 ° C.를 품다 </li><li> RNA 샘플 2 μL에 260 nm의 280 nm에서 흡광도 (ABS)을 측정한다. 비율 Abs260/Abs280을 계산 하였다. </li> &lt;리&gt; 스토어 -80에서 RNA 샘플 ° C (몇 년 동안 안정적). </li></ol> 5. 솔루션 및 청소 절차 <ol><li> 칼륨 아세테이트 2 M, pH를 5.0 : DEPC 처리 된 H 2 O의 70 ML에 19.6 g 칼륨 아세테이트 용해 DEPC 처리 된 H 2 O 5 개의 린스 다음, 15 분간 1M NaOH를 가진에 몸을 담글으로 ph-미터 프로브를 청소 아세트산과 pH를 5.0으로 조정 후 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 </li><li> 트리스 - 염산 100 밀리미터, 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %는 0.5 M 트리스 - 기본 산도 8.0 40 ML에 N-Lauroylsarcosine 2 g의 (후드) 용해. ) DEPC 처리 된 H 2 O로 200 ML에 볼륨을 조정 CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 50 ML 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 7.5 CSCL의 96g 압력솥과 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 pH가 &lt;7.5을 확인합니다. </li><li> 아가로 오스 겔 1 %는 : 62 ML DEPC 처리 된 H 2 O의 아가 약 1 g을 넣어 전자 레인지에서 가열한다. 12.3 M의 18 ML을 추가합니다포름 알데히드, 배 MOPS 20 ㎖. 화학 후드 안쪽에 붓는다. </li><li> 시료 전처리 버퍼 : 준비 즉흥적 수 있습니다. 배 MOPS, 12.3 M 포름 알데히드 및​​ 포름 아미드 40 μL의 16 μL의 화학 후드 8 μL 내부 섞는다. </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료없이) : 준비 즉흥적 수 있습니다. DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 80 % 글리세롤의 20 μL로 4 μl를 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료) : 준비 즉흥적 수 있습니다. 0.25 % xylen cyanol, DEPC 처리 된 H 2 O 0.25 % 브롬 페놀 블루를 포함하는 80 % 글리세롤의 10 μL에 2 μL 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> 버퍼 실행 : 60 ML 배 MOPS로, 12.3 M 포름 알데히드의 54 ML과 DEPC 처리 된 H 2 O 186 ML를 추가 </li><li> 교반하면서 37 2 시간 동안 0.1 % v / V를 diethylpyrocarbonate에 품어 증류수 ° C : H 2 O를 DEPC - 처리. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 균질 청소 : 1 L로 세척 용액의 25 ML (RBS)를 추가 DEPC-H 2 O를 처리하고, 교반 축이 1 분 immerge 일. 60 2 시간을 품어 ° C. 알루미늄에 DEPC 처리 된 H 2 O 랩 계기로 완전히 헹구고 장비 상자에 넣어. 상자를 포장. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 전기 장치를 청소 : 장치, 트레이 15 우물 빗을 씻으십시오. 3 % 과산화수소에 15 분 알을 품다. 100 % 에탄올로 한 번 씻어. 건조한 공기. </li><li> 유리 접시를 청소하는 : 모든 밤 유리 접시에게 RBS 2 %를 청소 한 후 200 ℃에서 살균하기 전에 증류수로 씻어 </li></ol>

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	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

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수술 블록의 조직 복구를위한 절차의 개발은 망막 박리의 사체 분석에 필수적이다. 하나는 수술이 유형의 비상 사태와 안과 운영들이 조작 할 때 생물학 연구 프로그램에 참여하려면 약간의 시간을 가지고 연습을 통지해야한다. 이 retinectomy는 통계 수치에 도달하는 쉬운 방법은 네트워크에서 작동하는 것입니다, 그래서 각 서비스에 확률 론적으로 수행됩니다. 이러한 네트워크, 조직 컬렉션의 표...

망막 박리의 주요 치료 목표 (RD)은 망막 색소 상피 세포에서 광 수용체의 분리로 인한 광 수용체 세포의 손상과 망막 염증을 제한하는 방법을 찾을 수 있습니다. RD 동안 RPE 세포는 dedifferentiate, 마이그레이션, 활성화되고, 합병증으로 이어지는 수축 힘을 발휘, 분리 된 망막의 표면에 확산. RD의 전사 체학 분석 RD 수술과 함께있는 최종 시력 예후를 향상시킬 수 있습니다 따라서 향후 치료 분자에 따라 수정 된 표정으로 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 그것은 잘 디옥시리보 핵산 (DNA)이 그대로 리보 핵산 (RNA)이 안정되지 알려진 유전 연구에 광범위하게 사용되는 후자의 안정성은 2 세 이상의 30,000 년 생물학적 샘플에서 네안데르탈 인 게놈의 시퀀싱을 허용했다. 메신저 RNA에 게놈에서 유전자의 DNA의 전사입니다주요 유전자 발현 과정 및 발현는 신호를 구성하기 위해 불안정한입니다. RNA를이 신호를 종료 RNase의 효소에 의해 매우 빠르게 분해합니다. 식을 연구 실험실에서 연구되기 전에 조직이 유기체에서 고립되면, RNA를 매우 자주 저하됩니다. 성능이 저하 된 RNA 분석을 유전자 발현에 적합하지 않습니다. 실험실 직원이 수술에 참여할 수 없기 때문에, 우리는 쉬운 절차를 개발하고 만 의사가 적절한 RNase가없는 솔루션으로 조직을 복구해야합니다. 조직의 RNA가 안정이 솔루션 실온에서 72 시간 후 분해의 부호없이 분석 할 수 있습니다. 시료에서 RNA를가 실험실 3에 전송 된 후 세슘 클로라이드 그라디언트 원심을 포함하는 표준화 된 방법에 의해 정제된다. 다음의 RNA 품질 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 및 RT-PCR에 의해 평가된다. RNA 정화 프로토콜을 가지고DNA와 RNA에 따라 다릅니다 및 RNA는 유전자 발현 연구에서 인공적인 신호를 생성하는 DNA 분자에 의해 오염되지 않도록 보장 그 밀도에 따라 분자를 분리 장점. 또한, 정량적으로 세포 내에서 가장 풍부한 RNA있는 전송 RNA를 (tRNAs를가), 리보솜 RNA (rRNAs)와 메신저 RNAs (mRNA가)되고 두 최근에서 같은 물리적 특성에 따라 분리 정제 공정의 제품을 끝낸다. 마이크로 어레이 분석 프로토콜의 대부분은 tRNA의 4-6 저해하는 역전사와 RNA 중합 효소의 사용을 포함 이후 준비에서의 tRNA의 제거에 유용합니다. 수술 표본에서 정제 된 RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 레이블 및 마이크로 어레이 칩을 교배 그 결과는 두 개의 보완적인 방법으로, 거짓 발견 속도 방법을 사용하여 상호 정보 visuali에 따라 새로운 방법을 사용하여 분석하는웹 기반 서버 Retinobase 7,8에 데이빗.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Aventi J-E</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JS-5.3</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>LE 80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW41</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Biorad</td><td>Pac 3000</td><td></td></tr><tr><td>PolytronTM</td><td>Kinematica</td><td>PT 2100</td><td>Supplied with PT-DA 2105:2</td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis device</td><td>Biorad</td><td>MiniGel Cell GT</td><td></td></tr><tr><td>Imaging System </td><td>Biorad</td><td>GelDoc-It Imager</td><td></td></tr><tr><td>5 ml sterile polyethylene tube</td><td>Greiner</td><td>115261</td><td></td></tr><tr><td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Chemical reagents</td><td>Sigma</td><td></td><td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td></tr><tr><td>Cleaning Solution </td><td>VWR</td><td>RBS</td><td></td></tr><tr><td>Microarray chip</td><td>Affymetrix</td><td>Human U133 plus 2 array</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

망막 박리 (RD)은 망막 색소 상피 (RPE)에서 감각 신경 망막의 분리를 설명합니다. RPE는 빛에 민감한 뉴런, 광 수용체의 정상적인 기능에 필수적입니다. RPE에서 망막 박리 세포 외액으로 가득 물리적 차이를 만듭니다. RD는 감각 신경 망막 이온과 대사 산물의 생리적 교환이 심각하게 교란되기 때문에 RPE 모두에 영향을 세포 및 분자 불리한 이벤트를 시작합니다. 비전에 대한 결과는 비전 1의 복원의 두 조직 결과의 신속한 reapposition 이후 박리의 기간에 관련되어 있습니다. RD의 치료는 단독으로 수술이다. 유리체 겔 (유리체 절제술)의 제거는 망막 박리를 선호하는 분리 된 주변 망막의 제거에 필수적이지 않은 부분옵니다. 제거 된 망막 표본은 고해상도 nullius (1 개)이며, 따라서 일반적으로 버려.이러한 수술 표본에서 RNA를 복구하려면, 우리는 실험실 수술 블록 전송하는 동안 RNA 보존 할 수있는 절차 일기를 개발했다. 우리는 또한 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜은 정제 된 RNA를 글로벌 유전자 발현 분석에 적합하다는 것을 보증한다. RNA의 품질은 모두 RT-PCR과 마이크로 어레이 분석에 의해 확인되었다. 데이터의 분석은 RD 동안 염증과 시세포 변성의 동시 참여를 보여줍니다.

프로 저널 (그림 1)는 우리가 정제 된 RNA에 수술 블록에서 망막의 표본을 복구하고, 망막 박리의 사체를 분석 할 수 있습니다. 단핵구 화학 주성 MCP1 유전자 CCL2의 상향 조절과 유전자 GNAT1, 단파 콘 옵신 OPN1SW 및 homeogene CRX (그림 2) transducing에로드 광 수용체의 발현 감소 망막 박리가 발생합니다. GNAT1, OPN1SW 및 CRX의 감소를 동반는 시?...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.

저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K 조회수.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. 우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.

비디오: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular choroid layer. Different regions of the retina are anatomically and molecularly distinct, facilitating unique functions and demonstrating differential susceptibility to disease. Proteomic analysis of each of these regions and layers can provide vital insights into the molecular process of many diseases, including Age-Related Macular Degeneration (AMD), diabetes mellitus, and glaucoma. However, separation of retinal regions and layers is essential before quantitative proteomic analysis can be accomplished. Here, we describe a method for dissection and collection of the foveal, macular, and peripheral retinal regions and underlying RPE-choroid complex, involving regional punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye.One-dimensional SDS-PAGE as well as downstream proteomic analysis, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), can be used to identify proteins in each dissected retinal layer, revealing molecular biomarkers for retinal disease.

The human retina is composed of functionally and molecularly distinct regions, including the fovea, macula, and peripheral retina. Here, we describe a method using punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye to dissect and collect these distinct retinal regions for downstream proteomic analysis.

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

연구

생화학

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the retrieval of ocular tissues, especially cornea, by cutting it separate from the ocular globe. Evisceration is the process of removing the internal organs referred here as retina. The ocular globe consists of the cornea, the sclera, the vitreous body, the lens, the iris, the retina, the choroid, muscles etc (Suppl. Figure 1). When a patient is suffering from corneal damage, the cornea needs to be removed and a healthy one must be transplanted by keratoplastic surgeries. Genetic disorders or defects in retinal function can compromise vision. Human ocular globes can be used for various surgical procedures such as eye banking, transplantation of human cornea or sclera and research on ocular tissues. However, there is little information available on human corneal and retinal excision, probably due to the limited accessibility to human tissues. Most of the studies describing similar procedures are performed on animal models. Research scientists rely on the availability of properly dissected and well-conserved ocular tissues in order to extend the knowledge on human eye development, homeostasis and function. As we receive high amount of ocular globes out of which approximately 40% (Table 1) of them are used for research purposes, we are able to perform huge amount of experiments on these tissues, defining techniques to excise and preserve them regularly.
The cornea is an avascular tissue which enables the transmission of light onto the retina and for this purpose should always maintain a good degree of transparency. Within the cornea, the limbus region, which is a reservoir of the stem cells, helps the reconstruction of epithelial cells and restricts the overgrowth of the conjunctiva maintaining corneal transparency and clarity. The size and thickness of the cornea are critical for clear vision, as changes in either of them could lead to distracted, unclear vision. The cornea comprises of 5 layers; a) epithelium, b) Bowman's layer, c) stroma, d) Descemet's membrane and e) endothelium. All layers should function properly to ensure clear vision4,5,6. The choroid is the intermediate tunic between the sclera and retina, bounded on the interior by the Bruch's membrane and is responsible for blood flow in the eye. The choroid also helps to regulate the temperature and supplies nourishment to the outer layers of the retina5,6. The retina is a layer of nervous tissue that covers the back of the ocular globe (Suppl. Figure 1) and consists of two parts: a photoreceptive part and a non-receptive part. The retina helps to receive the light from the cornea and lens and converts it into the chemical energy eventually transmitted to the brain with help of the optic nerve5,6.
The aim of this paper is to provide a protocol for the dissection of corneal and retinal tissues from human ocular globes. Avoiding cross-contamination with adjacent tissues and preserving RNA integrity is of fundamental importance as such tissues are indispensable for research purposes aimed at (i) characterizing the transcriptome of the ocular tissues, (ii) isolating stem cells for regenerative medicine projects, and (iii) evaluating histological differences between tissues from normal/affected subjects. In this paper we describe the technique we currently use to remove the cornea, the choroid and retinal tissues from an ocular globe. Here we provide a detailed protocol for the dissection of the human ocular globe and the excision of corneal and retinal tissues. The accompanying video will help researchers to learn an appropriate technique for the retrieval of precious human tissues which are difficult to find regularly.

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

The paper describes a simplified technique to excise corneal and to eviscerate retinal tissues from the ocular globe of human cadaveric donors. The technique described here will help to excise good quality tissues to be used for transplantation, surgical or research purposes without damaging other tissues of the ocular globe.

위한 간편한 기법<em&gt; 현장에서</em인간 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 내장 적출의&gt; 절단

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

의학

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

신경과학

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

생물학

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...