우리는 기술 지원을 위해 Tzlil Rozenblat, 알렉산드라 Bello와 칼 Spuhler 감사드립니다. 이 작품은 대학은 대학 학사 연구 여름 연구소 (URSI), 루시 Maynard 연어 연구 기금과 NASA 수상 # NX09AU90A, 과학 기술의 연구 우수상 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 센터 (NSF-문장) 수상 # 0,630,388 및 NSF에 의해 지원되었다 수상 # 1058385.

1. C. 비디오 분석을위한 elegans 준비 <ol><li> 얇은 플랫 백금 와이어 곡괭이를 사용하여 신선한 NGM 한천이 가득한 페트리 접시에 10-20 gravid 성인 nematodes를 이동합니다. NGM 한천로 가득 페트리 요리 E.의 작은 원형 반점을 포함 대장균 먹을 수 nematodes에 대한 (성장 제한 스트레인, OP50은 최상의 결과를 제공합니다). nematodes은 3-5 시간에 알을 낳기 위해 허용하고 따라서 50-150 nematodes의 작은 발달 - 동기화 문화를 확립, 성인을 제거합니다. nematodes 4-5 일 동안 20 ° C에서 페트리 접시를 잠복기에 의해 초기 성인기로 성장할 수 있습니다. 이러한 문화 방식은 설립 절차 (Stiernagle 2006)을 기반으로합니다. 5 </li><li> 비디오 분석의 일에 따라서 동기화 문화 50-150 웜를 수집, deionized, 증류수 1 ML과 젊은 성인 nematodes의 접시를 플러시. M9 또는 PBS와 같은 완충 용액도 사용하실 수 있습니다. w를 회전 할 microcentrifuge를 사용하여튜브의 하단하거나 15 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있도록 orms. 관에서 물의 대부분을 제거하고 nematodes에서 모든 준수 세균을 씻어하기 위해 deionized, 증류수 1 ML로 교체. </li><li> micropipette를 사용하여 석영 큐벳에 물이나 버퍼에 nematodes을 전송합니다. 한 번에 한 선충류는 레이저로 조명 될 가능성이 있도록이 한 번 또는 더 적은에서 총 5-10 nematodes에 대해, 적은 수의 작업하는 것이 중요합니다. 문화 접시에 nematodes의 숫자가 너무 큰 경우에는 원하는 밀도에 도달 할 때까지 물이나 버퍼에있는 벌레를 희석. 그것은을 씻고 큐벳에 개별 웜을 전송하는 새로운 한천 플레이트에 물이나 버퍼의 한 방울에 개별 nematodes을 선택하는 것도 가능합니다. 우리의 연구에서 우리는 행동을 수영에 대한 물리적 제약의 효과를 조사 할 1mm, 2 mm와 5mm 큐벳 크기를 사용했습니다. </li></ol> 2. 비디오 Analysi에 대한 광학 설정에스 <ol><li> 할 수있는 543 나노 미터 (녹색) 헬륨 - 네온 (HeNe) 레이저, 두 전면 표면 알루미늄 거울, 큐벳 홀더, 프로젝션 스크린, 고속 카메라 (건반 고속 Exilim)를 사용하여 그림 1에 표시된 설정을 수행 ~ 240 FPS에서 촬영. 두 거울은 큐벳을 통해 레이저 빔을 조정하는 데 사용됩니다. 큐벳의 다른 크기는 연구의 특성에 따라 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 수영 주파수 공간 제약의 효과를 표시 할 수 두께 5mm 아르 큐벳를 사용했습니다. 레이저 빔은 오버 샘플링을위한 요구 사항을 충족해야하며. 즉, 조직은 레이저 빔의 더 이상보다 세째을 방해한다. C.에 대한 이 선충류와 상호 작용하는 경우 elegans는 레이저 빔의 직경은 약 2 mm해야합니다. 회절 패턴이 찾을 어려울 수 있기 때문에 레이저 빔 직경 5mm보다 클 수 없습니다. 화면에 diffracting 유기체의 거리보다 훨씬 커야합니다유기체 자체. </li><li> 장소는 큐벳의 맨 위에 parafilm과 물 열에 nematodes를 섞어을 반전. 웜은 큐벳의 상단에 처음하는 일이 없도록 큐벳 홀더에 큐벳를 놓습니다. 거울 사용하여 큐벳의 중심을 통해 레이저 빔을 조종. nematodes은 물보다 밀도가 있기 때문에 같은 시간에 물이 항목에서 수영을하는 동안, 그들은 천천히, 큐벳의 바닥에 떨어질 것입니다. </li><li> 전송 빔이 투영 화면 (그림 2) 충족 투영 화면, 색상에 검은 전송 레이저 빔에 해당하는 곳 분산을 줄일 수 있습니다. 또는 전송 빔이 화면을 통과 할 수 있도록 투영 화면에 구멍을 넣어. 제거하거나 전송 빔의 산란을 줄여하면 전송 빔으로 인해 포화에서 카메라의 CCD 어레이를 유지합니다. </li><li> 회절 패턴의 크기의 측정을 캡처하려면이 줄을 긋다diffracted 빛 이미지 방해없이 전송 레이저 빔 스폿 옆에 투영 화면에 대한 5cm. </li><li> 객실 빛에 따라서 5cm 라인 회절 이미지와 같은 장면에 있다는 것입니다 동안 카메라로 녹화를 시작합니다. 객실 라이트를 켜십시오. 카메라 화면에 기록 회절 이미지 웜은 레이저 빔을 통과 있습니다. </li></ol> 3. 비디오 데이터 준비 <ol><li> : 비디오 분석 프로그램 (로거 프로 설치 <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/를</a> 컴퓨터에). 비디오 분석 프로그램에 비디오를 가져 오기 </li><li> 전송 레이저 스폿과 일치 할 수있는 근원을 설정합니다. 투영 화면에 5cm 줄을 사용 규모를 설정합니다. </li><li> 비디오 분석 소프트웨어를 사용하여 각 선충류에 의해 형성된 회절 이미지의 각도 변위 (그림 3)을 추적 </li><li> angula를 찾으려면스프레드 시트 (엑셀)로 아크 탄젠트 (Y / X), 복사 및 붙여 넣기 데이터를 복용하고 연속 그래프 (Figure. 4) 생산 모든 부정적인 각도 180 ℃ 일 또는 π를 추가하여 R 변위. </li></ol> 4. 수영 주파수의 실시간 관찰을위한 실시간 데이터 수집 <ol><li> 비디오 분석을위한 동일한 설정을 사용하여 마우스 오른쪽 투영 화면의 앞의 회절 패턴에 중심을 벗어난 작은 영역 (~ 1mm 2)와 포토 다이오드를 (ThorLabs에서 DET10A) 넣습니다. </li><li> USB 포트를 통해 컴퓨터에 연결하는 디지털 오실로스코프 (피코 기술에 의해 만들어진 PicoScope)에 포토 다이오드를 연결합니다. 컴퓨터 화면에서 대패 패턴을 관찰합니다. </li><li> ASCII 또는 텍스트 형식으로 인수 데이터 세트를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 데이터가 치 평방 최소화를 사용하여 피팅 파형 할 수있는 데이터 분석 프로그램에 비디오 나 포토 다이오드를 사용하여 획득 가져 오기. 여기에 사용 된 프로그램은 (출처 <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). 탈곡 주파수를 (도 4 및 5) 결정하는 정현파 곡선을 맞추기. </li><li> 평균 수영장 다양한 샘플의 주파수와 편차를 결정합니다. 본 연구의 경우, 데이터는 통계적으로 Bonferroni 다중 비교 테스트에 이어 단일 요소 ANOVA를 사용하여 분석 하였다. &lt;0.05의 P-값은 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다. </li></ol> 6. 예를 들어 Mathematica를 사용하여 모델 회절 패턴 참고 : 회절 패턴은 여러 가지 계산 도구를 사용하여 모델링 할 수 있습니다. 이 절차는 MATLAB, 엑셀 등 다양한 전산 도구, 원산지 등에 다를 수 있습니다 <ol><li> 이미지 만들기 : 전통 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드에 nematodes의 이미지를보십시오. </li><li> 이미지를 Binarize : 가져 오기 웜 이미지 &#39;웜&#39;전Mathematica로 이미지를 드래그하여 n 인물 Mathematica. 흑백 이미지 (binarize)로 이미지를 변환합니다. 이 작업은 Mathematica의 &#39;Binarize&#39;명령으로 달성 될 수있다 : BlackandWhiteImage = Binarize [웜]. 이미지가 흑백 이미지로 볼 수 있습니다. EdgeDetect [웜, 6.0,0.035] 두 후행 숫자가 결과 가장자리의 거침을 제어 : 또는 BlackandWhiteImage을 만들 수있는 &#39;EdgeDetect&#39;명령을 사용합니다. </li><li> 0과 사랑하는 사람들의 행렬로 이미지를 변환 :이은 Mathematica의 &#39;ImageData&#39;명령으로 달성 될 수있다 : 매트릭스 = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> 푸리에 변환 매트릭스 : 지정된 FourierParameters를 사용하여 행렬을 변환 푸리에에 Mathematica의 &#39;푸리에&#39;명령을 사용하여 FTransform = 푸리에 [매트릭스, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> 매트릭스의 광장 계수는 회절 매트릭스를 얻을 및 이미지 대비를 개선하는 방법은 다음과 같습니다 절대 광장매트릭스의 값과 원본 이미지에 해당하는 회절 패턴입니다 결과 이​​미지를 볼 수 있습니다. 또한, 이미지의 대비를 확장 할 수있는 &#39;로그&#39;기능을 사용 ImageContrast = 이미지 [로그 [1 + (ABS [FTransform]) ^ 2] / 0.5]. </li><li> 쉽게 볼 이미지 크기 조정 내기 : 중앙 회절 패턴을하고 원하는대로 조정될 크기 : ImageResize [ImageContrast [Y, 100], 500]. </li><li> 자유롭게 헤엄 웜에서 얻은 회절 패턴과 모델을 회절 패턴을 비교합니다. (그림 6) </li></ol>

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	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 실시간 운동의 측정과 현미경의 사용을 필요로하지 않습니다 nematodes 같은 미세한 미생물에서 간단한 locomotory 행동에 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 8이 방법 론적 접근 방법도 protists 같은 수많은 미세한 미생물을 연구에 활용 될 수 있습니다. 이 방법은 사용 빛의 파장에 의해 제한됩니다. 조직은 빛의 파장보다 작은이 아니어야합니다. 필요한 장비의 비용 절감과 휴대뿐만 아니라,이 접근법의 하나 장점은 현미경 이미지 비행기의 좁은 제약없이 실시간으로 세 차원의 행동을 측정 할 수있는 능력입니다. 이 기술은 현미경 기반의 접근 방식을 사용하여 공부 할 수없는 행동에 중력의 힘이나 여러 다른 조건의 영향을 조사하기 위해 함께도 가능합니다. 9 따라서, 우리는 미생물 자연 locomotory beha의 더 나은 이해를 얻을 수 있습니다현미경 슬라이드 방울 또는 전문 마이크로 유체 챔버 (파크 외, 2008)의 굴레에서 해방 viors 10. 회절 패턴의 위상 정보의 부족 원방 회절 패턴이 푸리에 변환의 절대 값의 제곱에 비례하기 때문에 diffracting 객체에 해당하는 이미지의 직접 검색을 허용하지 않습니다. 그들이 자유롭게 헤엄 nematodes (그림 6)의 회절 패턴과 일치 할 수 있도록 따라서 웜 이미지에서 회절 패턴을 계산합니다. 이 방법은 진정으로 자유롭게 C. 수영에 대한 결과가 생긴 elegans와 어떤 미세한 종에 적용 할 수있는 물이나 여러 가지 이온 솔루션과 같은 광학 투명 환경에서 연습. 기존 현미경은 마이크로 미터의 순서에 초점 깊이 연구 만 할 수 있습니다. 11이 제한된 때문입니다빛을 초점 피사계 심도 : <img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> 이 회절 방법은 확실히 기존의 현미경을 대체 아니지만 N은 짧은 초점 길이가 큰 C와 연결되어 있으므로 혼동 (C)의 원과 상호 관계를 맺고 F-번호입니다. 12,13, 그건 할 수있는 곳 그렇게 빨리 종 더 적은 비용으로 실시간으로 조작 할 수 양적 결과를 제공합니다. 회절 패턴은 어떤 레이저 포인터를 얻을 수 있습니다. 회절 패턴은 일반 디지털 카메라를 사용하여 감소 시간적 해상도로 촬영 할 수 있습니다. 사용자가 쉽게 사용할 수있는 현미경이나 광 다이오드가없는 수 있지만, 이러한 탈곡 주파수를 측정하고 회절 패턴을 평가하는 등이 실험의 핵심 부품은 매우 적은 비용으로 완료 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 543 nm의 HeNe 레이저 </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> 이하 5 MW로 보이는 범위에 포함되지 않는 모든 레이저가 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 이 전면 표면 알루미늄 거울 </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> 고속 Exilim 카메라 </td><td> 건반 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 석영 큐벳 </td><td> Starna 셀 </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (소프트웨어) </td><td> 버니어 </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> 볼프람 </td><td></td><tD&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

토양 및 수생 미세한 미생물들은 살고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 미세 유기체의 행동의 대부분은 연구 반면, 우리는 실시간 분석을 제공하는 새로운 분석 방법을 제시 좁은 거의 2 차원 초점 필드에 움직임과 행동을 제한 현미경 기반의 접근 방법 1.를 사용하여 수행되었습니다 자유롭게 C. 수영 현미경 기반의 장비에 의존하지 않고 큐벳에서 elegans. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다. 우리는 자유롭게 수영을 nematodes에 대한 진동 주파수를 측정합니다. 원방 회절 패턴 분석 nematodes의 파형에 대한 단서를 드러내고있다. 회절은 개체 주위에 절곡 빛의 과정입니다. 이 경우에는 빛이 생물에 의해 diffracted입니다. 빛 파도가 방해 및 광고 게재를 형성 할 수iffraction 패턴. 화면에 객체 거리가 diffracting 객체보다 훨씬 큰 경우 멀리 필드, 또는 Fraunhofer, 회절 패턴이 형성된다. 이 경우 회절 패턴은 푸리에 변환을 사용하여 (모델화) 계산 될 수있다. 2 C. elegans의 세 차원에서 탐색 무료 생활 토양 - 사는 nematodes 있습니다. 그들은 크롤링라는 정현파 locomotory 패턴과 수영라는 다른 패턴의 액체에서 흙이나 한천 같은 고체 매트릭스에 모두 이동합니다. 3 역할은 mechanosensory, chemosensory 및 locomotory에 플라스틱 변경 사항을 적용 thermosensory 세포에 의해 제공 감각 정보에 의해 연주 패턴에 패턴 및 스위치는 elucidated 수하기 시작합니다. 우리는 현미경을 필요로하지 않습니다 그리고 우리가 다른 공동에서 선충류의 운동의 복잡성을 탐험하기 시작 할 수있게 될 것 가로, 세로, 높이로 선충류의 운동을 측정하는 광학 방식을 설명 4nditions.

<html> 예를 들어, 우리는 C.을 공부 다양한 석영 큐벳 1cm, 두께 5mm와 4cm 높이 큐벳에서 elegans. 비디오 분석을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 5mm 두께의 큐벳에서 비디오 분석에서 얻은 평균 수영 주파수는 2.5 Hz에서 (그림 4)입니다. 마찬가지로, 실시간 데이터 수집 방법을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 우리는 2.7에 대한 Hz에서 (그림 5)의 수영장 주파수를 얻을 디지털 오실로스코프 (PicoScope)를 사용합니다.이 절차는 많은 벌레 반복 할 수 있습니다. 자유롭게 헤엄 웜에 대한 자세한 연구가 5mm 큐벳에 2.37 Hz의 평균 수영장 주파수를 공개했다. 6 예상대로, 수영 주파수는 크롤링 웜 (~ 0.8 Hz에서)에 대한보다 높은 것입니다. 3이 회절 방법을 사용하여 C.의 평균 수영 주파수 현미경 슬라이드에 국한되어있다 elegans은 2 Hz의 이전에 다음 ID로 출판 값과 일치하는 것으로 확인되었습니다. 1,7 ve_content는 &quot;&gt; 다음 절차 3.) 후 6). 기존의 현미경으로 얻은 웜 이미지의 도움으로 회절 패턴을 수영의 모델링 할 수 있습니다. 모델화 회절 패턴은 C. elegans의 수영주기를 (시뮬레이션하는 데 사용됩니다 그림 6). 성공적인 모델은 수영 주파수를 일치 물리적으로 가능한 연속 수영 패턴으로 구성되어 있습니다.이 수영 사이클의 처음과 같이 웜은 수영주기의 끝 부분에 동일한 모양에 있어야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> 그림 1. 녹색 HeNe 레이저 라이브 C.를 사용하여 동적 회절 패턴을 생성하는 데 사용 된 elegans. 이 회절 패턴은 240 프레임으로 촬영했습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> 그림 2. 드라<html> 날개는 검은 색 점은 전송 빔의 흡수를 증가시킵니다. 분산 된 광으로 인해 카메라의 채도가 감소하고 회절 패턴은 표시되고 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> 그림 3은. 추적하는 웜 회절 패턴과의 영상 분석 소프트웨어의 스크린 샷 (로거 프로). <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> 그림 4. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 비디오 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.5 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다. &quot;/&gt; 그림 5. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 실시간 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.7 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> 그림 6. 상단 행은 실제 회절 패턴을 나타내며 아래쪽 행에있는 모델을 회절 패턴을 일치합니다. 모델을 회절 패턴은 현미경 슬라이드 (중간 행)에 웜을 사용하여 제작되었다.

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물<em&gt; C. elegans</em&gt; 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고<em&gt; C. elegans</em&gt; 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K 조회수.  Vassar College. 자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물 C. elegans 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고 C. elegans 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

연구

생물학

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

단일 파장 그림자 영상<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 로코 모션을 포함하여 강제 추정

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

공학

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

생체공학

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

제어 합성 및 매우 균일 한 폴리 형광 추적 (<em&gt; N</em&gt; 이소 프로필 아크릴 아미드) 미크로 겔

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

화학

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

생화학

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

면역학 및 감염병학

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of techniques have been developed to better visualize these phase objects; phase contrast and DIC are among the most popular methods for enhancing contrast. However, recording position and shape in the out-of-imaging-plane direction remains challenging. This report introduces a simple experimental method to accurately determine the location and geometry of objects in three dimensions, using digital inline holographic microscopy (DIHM). Broadly speaking, the accessible sample volume is defined by the camera sensor size in the lateral direction, and the illumination coherence in the axial direction. Typical sample volumes range from 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m&#160;x 200 &#181;m using LED illumination, to 5 mm&#160;x 5 mm&#160;x 5 mm or larger using laser illumination. This illumination light is configured so that plane waves are incident on the sample. Objects in the sample volume then scatter light, which interferes with the unscattered light to form interference patterns perpendicular to the illumination direction. This image (the hologram) contains the depth information required for three-dimensional reconstruction, and can be captured on a standard imaging device such as a CMOS or CCD camera. The Rayleigh-Sommerfeld back propagation method is employed to numerically refocus microscope images, and a simple imaging heuristic based on the Gouy phase anomaly is used to identify scattering objects within the reconstructed volume. This simple but robust method results in an unambiguous, model-free measurement of the location and shape of objects in microscopic samples.

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

The three-dimensional locations of weakly-scattering objects can be uniquely identified using digital inline holographic microscopy (DIHM), which involves a minor modification to a standard microscope. Our software uses a simple imaging heuristic coupled with Rayleigh-Sommerfeld back-propagation to yield the three-dimensional position and geometry of a microscopic phase object.

약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

단일 파장 그림자 영상

의 주문형 정량 분석을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis

제어 합성 및 매우 균일 한 폴리 형광 추적 (

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

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