<p class="jove_content"&gt; 우리는 우수한 동물의 축산에 대한 Nadeshda 울프, 나딘 Eschen와 수잔 Delong 감사드립니다. CW는 Helmholtz 프로그램 &#39;에서 박사 학위 친교에 의해 지원되었다<em&gt; BioInterfaces</em&gt; 국제 대학원 &#39;(BIFIGS). 추가 지원은 CG로 제 7 회 유럽 커뮤니티 프레임 워크 프로그램 (PIRG07-GA-2010-267552) 내에 KIT-RISC 교부금에 의해 및 마리 퀴리 국제 합체 그랜트에 의해 제공되었다. 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (238821) - AHS는 (간, 췌장 개발 및 질병의 생물학) 굵은 의해 지원되었다. UL은 Dopaminet FP7 (일곱 번째 프레임 워크 프로그램) (223744)에 의해 지원되었다.</p&gt;

1. 동물 처리 친 분석 사용 3 dpf의 애벌레는 homozygous 이중 형질 전환 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2와 AB (야생 형) 물고기 사이의 그룹 matings 인한하십시오. 자연 산란에 의해 배아를 수집 29에서 그들을 키울 ° 배양 접시에 E3 중간에 C (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4, 파랑의 0.1 %의 메틸렌, 산도 7.0 equilibrated). 그것은 접시 당 50-70를 초과하지 배아의 밀도를 유지하기 위해 필수적입니다. 2. 유충 정렬 형광 기자의 표현, 자발적인 염증과 적절한 연령 관련 개발을위한 형광 입체경 미만의 모든 애벌레를 확인하십시오. 3. 상영 매체 준비 (항상 신선한를 준비) DMSO (1 % 최종)과 MS222 (0.05 G / L)로 보완 메틸렌 블루없이 E3 매체를 준비합니다. 4. CuSO4준비 (항상 신선한 준비) 첫째 CuSO 4 아웃 무게 (M R = 159.6 g / 몰) DH와 20 밀리미터 주식 솔루션을 준비하는 두 O. E3/DMSO (1 %) / MS-222에서 120 μm의 CuSO 4 작업 솔루션 (20 밀리미터 주식 용액에서) 준비합니다. 빛으로부터 CuSO 4 용액을 보호합니다. 5. 384 잘 플레이트 준비 (Greiner 384 자 Microplate) 역방향 피펫으로 각각 잘으로 E3/DMSO (1 %) / MS-222의 20 μl를 사전에 추가합니다. 증가 피펫 팁을 구멍은 어떤 남긴 상처를 보면서 겁에 질리게하지 않고 신중하게 배아를 처리하는 데 필요한, ​​이것은 보어 2mm로 팁을 절단하여 이루어집니다. 각도 (치료 제어를위한 84 μl)로 매체의 74 μl의 단일 유충을 전송합니다. 필요한 경우, 잘 내에서 수평 위치에 동양의 유충은 유연 Eppendorf Microloader 피펫 팁 (; 5242 956.003 Eppendorf)를 사용합니다. 로봇 액체로 모두 다음과 같은 액체 처리 단계를 실시모든 애벌레의 동시 치료를 보장하기 위해 워크 스테이션을 취급. 6. 약물 치료 아래로 pipetting 및하여 약물 주식 판의 화합물 5 회를 섞습니다. 각도에 7.5X 약물 주식 판 16 μl을 넣고 5 번 섞는다. 애벌레의 부상을 방지하고 10 μl / s의 매체를 하는걸 우물 이내 팁 위치를 조정합니다. 잘 내에서 약물의 동질적인 유통을 보장하기 위해 우물의 중간 4 회를 섞습니다. 7. 잠복 29에서 1 H에 대한 검사 판을 품어 ° C에서 빛으로부터뿐만 CuSO 4와 같은 화합물을 보호하기 위해 알루미늄 호일 있었다. 8. 화학 남긴 상처 부정적인 컨트롤 믹스 4 배까지를 제외하고 각 잘 ~ 120 μm의 CuSO 4 작업 용액 10 μl를 추가 29에서 1 H에 다시 품어 ° C. 9. 세정 나 80 μl를 제거하고 교환<html> 각각의 dium 잘 회 (20 μl 단계에서) 화합물을 제거하고 CuSO 4. 10. 이미지 수집 90 분이면 초기 구리 치료 : 거꾸로 자동화된 현미경 (올림푸스 스캔 ^ R IE)에서 이미지 수집을 시작합니다. 좌우 측면 후부 라인 neuromasts가 표시되도록 초기 Z-레벨을 설정합니다. 이미지가 각각 잘 한 채널 brightfield에서 시간당 4 초점 비행기 (50 μm의 거리)에 Cy3와 GFP는 4X 목적 (NA가 = 0.13)을 사용합니다. 이미지 및 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 요청시 가능합니다. 11. 이미지 처리 1. 정렬 데이터 RAW 이미지는 우리의 정의 LabView 소프트웨어 스크립트로 처리됩니다. 영상 처리 파이프라인의 첫 번째 작업은 채널, 잘하고 시간이 지점 정보에 의해 현미경 생성된 데이터 폴더에서 원시 이미지 정렬됩니다. ove_step &quot;&gt; 2. 확장 초점 이후 소프트웨어 채널의 각 4 초점 비행기에서 연장 초점 이미지를 생성합니다. 3. RGB-오버레이 마지막 단계에서는 3 채널의 확장된 초점 이미지는 최종 RGB-오버레이 이미지에 결과로 병합됩니다. 4. 자동 neuromast 검출 패턴 인식 도구 (LabView 래피드 아이오와 프로토 타이핑 도구)는 RGB 오버레이 이미지 내에서 neuromasts를 식별하고 neuromasts 주위의 관심 경험적으로 정의된 영역을 만듭니다. 5. 부량 부상당한 neuromasts 주변 관심 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes는 (빨강 픽셀로 반영) 난 eukocytes (Paol)에 의해 ccupied P ercent 정말이에요 O의 기본 판독 결과 채점됩니다. 평균 95.27 ± 2.11 % (FDA1) 및 95.12 ±에우물 (애벌레)의 1.56 % (FDA2)을 제대로 감지하고 있으며 이후 추가로 데이터 처리를 받게되었습니다. 원시 데이터 출력 (각 감지 neuromast 대한 Paol) txt 파일에 저장하고 추가로 원시 데이터를 처리하는 MATLAB 스크립트를위한 데이터 입력으로 제공됩니다. 12. 데이터 처리 1. iMaps 색상 코드에서 원시 데이터 출력 Paol의 그래픽 시각화에 의한 개별 실험의 성공 여부를 평가하는 것은 소위 염증지도 (iMaps) (그림 2)로 실현될 수 있습니다. 밝은 초록색은 높은 초기 염증 지수를 반영, 블랙은 염증을 나타냅니다. 이것은 간략하게 다음 추가 데이터 분석에서 제외됩니다 실패한 실험의 신속한 식별을 허용합니다. 2. 컨트롤의 평균 각 실험 음식을 반영하는 320 화합물이 포함되어 있습니다단일 데이터는 각각 화합물 및 시간 - 포인트뿐만 아니라 32 긍정적이고 부정적인 통제에 따라 지적한다. 32 제어 복제는 평균과 표준 편차를 계산합니다. 컨트롤의 2 표준 편차 이내에만 데이터 포인트가 포함되어 있습니다. 3. 표준화 정상화는 스프레드 시트 분석을 통해 이루어집니다. 부정적인 제어되는 DMSO의 평균 값은, 0으로 설정되고 구리 컨트롤에 대한 높은 평균 Paol은 긍정적이고 부정적인 통제 사이의 최대 차이가 1로 설정되어 있도록 1로 설정됩니다. 각 화합물의 Paol는 선형적으로 보정이나 실험용 접시에 각각의 컨트롤로 추정된다. 4. 최종 읽기 아웃 : 염증성 지수 충분한 복제 실험 (즉 15)이 실시되고 나면, 복제 실험에서 표준 원시 데이터 읽기 아웃 최종 결과, 평균값이된다 - 염증색인. 구리 컨트롤의 초기 염증 지수는 시간이 포인트 제로를위한 100 % 시작과 이미지 수집 시작 시간 (90분 초기 구리 치료 후)에 연결합니다. 5. Monotonic 지수 회귀 피팅 시간의 경과에 염증 해상도로 인해 우리가 사용하여 초기 염증 향해 monotonic 지수 비선형 회귀 피팅을 수행 <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="등식 1" /> - 0 t = 0에서 초기 대응을위한 조치이며, 1 시간에 따른 규모의 슬로프와 관련되어 있습니다. 6. 2-D 기능 공간 계획 (그림 4) 기능 공간을 생성하려면 비선형 회귀가 적용되고 클러스터 분석은 따라서 다른 면역 - modulatory 카테​​고리에서 재미있는 후보자의 자동 식별 (안티 inflammat 수 있도록, 특색있는 지역으로 기능 공간을 분할ory, 안티 해상도, 프로 - 염증, 프로 해상도). 모든 화합물은 매개 변수가 0과 1을 바탕으로 2 차원 플롯에 표시됩니다. 13. 데이터 처리 및 저장 우리의 데이터는 루틴과 같이 &#39;결과뿐만 아니라, 사용자가 10 요청 상세한 전망을 처리 빠르게 이미지의 개요 및 데이터를 제공하는 등 마약 화면을 시각화하고 표현하는 웹 페이지를 만드는 처리. 기타 관련 이종 생물 학적 및 화학적 데이터베이스에 대한 소프트 링크는 비교과 소설 연구 11 귀중한 자원을 제공하기 위해뿐만 아니라 통합되었습니다. 이러한 루틴으로, 적절한 데이터 표준 및 metainformation이 데이터의 장기 보관을 위해 설정됩니다. 14. 대표 결과 파일럿 화면에서 우리는 640로 구성된 라이브러리를 분석 FDA는 granul의 개시, 진행이나 ​​해상도에 대한 영향에 대해 알려진 bioactive 화합물을 승인ocytic 염증 반응. 우리는 행동 다른 모드는 지표가 될 수 있습니다 면역 modulatory의 phenotypes의 4 가지 유형 분류 관찰된 효과를 바탕으로 : 안티 - 염증성를 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) 어느 monotonic 비선형 회귀 피팅 (E AO + alx -)에서 발생하는 매개 변수가 0과 1로 표현할 수있는 초기 염증 큰 기여를했다. 1 곡선의 기울기를 특징 때문에 염증 해상도를 설명 반면 0 염증 반응의 정도를 나타냅니다. 2-D 기능 공간 줄거리 (0 대 1)에있는 모든 성분을 표시하는 것은 다른 면역 modulatory 카테고리에서 충돌 후보자 (그림 3)의 자동 식별을 허용합니다. 640 화합물의 밖으로 45 50 % 이하로 초기 염증성 인덱스를 줄임으로써 상당한 안티 - 염증성 효과를 진력. 생 이내의 범주 우리는 6 화합물 우리 접근법의 유효성을 확인하는 비 steroidal 안티 - 염증성 약물 (NSAIDs)의 pharmacological 클래스에 속하는 발견. 그러나, NSAIDs는 가장 강력한 항정 염증성 약물끼리 위를 기록했다. 이외 NSAIDs에서 우리는 이러한 예제 안지오텐신 수용체 차단제 (ARBs), 항생제 및 프로톤 펌프 억제제에 대한 같은 몇 가지 추가 pharmacological 약물 클래스를 발견. 7 화합물은 잠재적 프로 해상도 의약품에 대한 경험적으로 정의된 임계값 기준을 만났습니다. 18 마약 긍정적인 컨트롤에 비해 부상 neuromasts로 과장 백혈구 모집 결과, 프로 - 염증 효과를 진력. 오직 두 화합물은 염증 반응의 적시 해상도를 못했습니다. 파일럿 화면 coul에서 여러 히트 후보자의 안티 - 염증성 효과 (위에서 언급한 pharmacological 약물 클래스에서 모범적인 후보자)D는 이후 보조 턱 assays (데이터가 표시되지 않음)에 복용 종속적인 방식으로 확인됩니다. 기본 화면에 진력으로 4 잠재적인 프로 해상도 의약품의 Retesting 행동의 지정된 모드를 확인하지 않았다. 약물 2는 높은 농도 (20 μm의)에서 약간의 안티 - 염증성 잠재력을했다. 20 μm의 - 세번째 약물은 5에서부터 약물 농도에 한계가 아닌 선량 종속 항 염증 효과를 전시. 네 번째 약물 테스트 농도에서 염증 반응에 아무런 영향을 미치지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> 1 그림. 친 분석의 워크플로우. 개별 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 애벌레 (3 dpf)을 수동으로 384 잘 microtiter 접시에 배포됩니다. 약물이 잘 제퍼 컴팩트 액체 처리 워크 스테이션을 사용하여 각에 동시에 추가됩니다. 검정 접시 그러면 29에서 1 H 위해 incubated있다 ° C. CuSO 4 치료 </sub&gt; - 1 H가 남긴 상처를 고행과 급성 염증 반응을 시작을위한 솔루션 (10 μm의 최종 농도). 마지막으로, 구리 솔루션과 약물은 씻어되고 자동화된 이미지 수집가 (초기 구리 치료 후 90 분) 시작됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> 그림 2. . 채널을 각각 Cy3 (왼쪽)와 GFP (오른쪽)이 50 μm의의 거리에서 - 개요 RAW 이미지의 그림은 그림 4 초점 비행기 (3 Z = 0)의 RAW 이미지를 보여줍니다. 화살표 (Z = 1,2) neuromasts 주변 클러스터된 leukocytes의 모범 neuromasts, 화살촉 (Z = 1,2) 지점을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> 그림 3. 염증지도 (iMaps) 각 실험의 성공은 색상 코드의 염증성 반응 (원시 데이터) 반영 iMaps로 평가하실 수 있습니다. 밝은 녹색은 높은 초기 infla을 반영<html> mmatory 반응, 블랙이 더 염증을 나타냅니다 timepoint 0 (왼쪽)와 시간 - 포인트 5 (오른쪽)에서 iMaps 분명 실험이 추가로 데이터 처리에 포함해야하는지 여부를 보여줍니다.. DMSO 제어 우물 (행 1, 12) 녹색의 어두운 또는 검은색에 나타나는 반면 구리 컨트롤 (행 13, 24), 녹색의 음영 변화에 표시됩니다. 시간 - 포인트 5, 염증이 거의 지금 녹색 또는 검은색의 어두운 그늘에 나타나, 구리 컨트롤에서 해결되었습니다. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> 4 그림. FDA는 320 화합물의 2 차원 기능 공간 줄거리는 라이브러리 및 각각의 컨트롤을 승인했습니다. 모든 화합물 우물은 비선형에서 발생하는 매개 변수를 0과 1을 기반으로 2 차원 기능 공간 계획에 표시할 수 있습니다 회귀 피팅 (d/4203/4203eq1.jpg &quot;고도 =&quot;초기 염증을 향해 / 수식 1 &quot;&gt;가).이 기능은 공간 줄거리는 마약을 나타내는 수도 있습니다 다음 4 면역 - modulatory 범주 중 하나에 속하는 흥미로운 후보자의 자동 식별을 허용 행동 &#39;모드 :. 안티 염증성 (1), 안티 해상도 (2), 프로 - 염증 (3) 및 프로 해상도 (4) <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

<p class="jove_content"&gt; 여기에서 우리는 전체 동물의 컨텍스트에서 면역 - modulatory 화합물의 식별을 가능하게하는 완전 자동화된 높은 처리량 검사 전략을 제시한다. 급성 염증 반응에 따라서 허용 모니터링<em&gt; 생체내에서</em&gt; 실시간 인치</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 상처로 백혈구 모집에 대한 약물 효과가 완전히 작동 타고난 면역 체계의 맥락에서 상대적으로 쉽게 공부 할 수 있기 때문에, 약물 발견이나 약물 repurposing 노력에 대한 가치있는 모델 생물로 zebrafish를 적용하는 프로토콜을 제공합니다. 우리의 접근 방식의 독특한 장점은 화학 남긴 상처로 이렇게 높은 처리량 형식으로 자동화 및 심사 허용, 수동 애벌레 조작 오래된을 렌더링한다는 사실입니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또한 불리한이나 독성 약물 효과뿐만 아니라 강력한 오프 타겟 효과는 쉽게 설정 제안된으로 평가 할 수 있습니다. FDA 승인된 라이브러리 그러나 주어진 심사 농도에서 어떠한 독성 화합물을 포함하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 우리는 테스트 라이브러리에서 동일한 pharmacological 물질 클래스 선물의 구성원 사이에 사용 가능한 데이터 세트 (예 : 면역 modulatory의 표현형, 약물 농도)를 비교하는 명백한 독성 물질에 대해 제안합니다. 필요가있을 경우 별도로 유망 면역 modulatory의 표현형을 미치는 약물 가족의 유독성 회원, 낮은 농도에서 retested 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 그들의 진력 면역 - modulatory 효과에 따라 자동으로 분류하는 의약품의 가능성을 증명하고있다. 안티 - 염증성 화합물의 범주에 속하는 약물은 독립적인 실험, 복용량에 의존 방식으로 그들의 효과를 exerting 화합물의 대부분에서 확인 수있다. 잠재적인 프로 해상도 약물로 식별 포 화합물은 지금까지와 같은 확인되지 않았습니다. 전적 해상도에 영향을 미치는 어떤 약품이 지금까지 문헌에서 설명되지 않은 이후로 그것은 또한,이 특정 면역 modulatory 분류는 설명하기 어렵다는 것을 나타냅니다. 그러나 4 retested 의약품의 3 높은 어금니 농도에서 안티 염증성 경향을 보여주었다. 경험적으로 정의된 임계값 기준을 최적화하면 거짓 - 반응의 수를 줄이기 위해 도움이 될 것입니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또한, 제시된 기법 백혈구 철새 행동에 영향을 미치는 유전자 변이의 식별을 위해 활용하기위한 가능성을 제공합니다<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 결론, 제안된 방법은 촉진 및 약물 내성, 독성, 투약뿐만 아니라 잠재적인 오프 타겟 효과에 쉽게 이용할 수있는 정보와 함께 잠재적인 새로운 단서 구조를 항복하여 노력을 repurposing 약물 발견이나 약물을 가속하실 수 있습니다. 그러므로, 약물 개발의 초기 단계에서 간단한 비용 및 시간 절약 전략으로 봉사.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulphoxide </td><td> 칼 로스 게엠베하 &amp; 주식 KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> 구리 (II) 황산염 무수 </td><td> 칼 로스 게엠베하 &amp; 주식 KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA는 약물 라이브러리를 승인 </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microwell 플레이트 구속력, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781,906 </td><td> 검정 </td></tr><tr><td> 올림푸스 스캔 ^ R </td><td> 올림포스 산 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 제퍼 컴팩트 액체 처리 워크 스테이션 </td><td> 캘리퍼스 </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Zebrafish의 애벌레는 작은 크기와 조작과 관찰의 상대적 용이성뿐만 아니라 시행 때 화합물은 단순히 입욕 물에 추가할 수 있으며, 쉽게 흡수되고있다는 사실로 인해 작은 분자 스크린 1,2 전체 동물에 특히 의무가 있습니다 &lt;1 % DMSO 솔루션입니다. zebrafish 애벌레와 leukocytes에 형광 단백질을 표현 형질 전환 라인의 가용성의 광학 선명도 때문에 zebrafish는 생체내에 급성 염증 반응을 모니터링의 독특한 장점을 제공합니다. 따라서, 높은 처리량과 면역 - modulatory 화합물의 식별을 목표로 우수한 컨텐츠 작은 분자 화면에 대한 zebrafish을 활용하면, 염증 유도 시나리오 지느러미 조직에서화된 닉스를 예의 노른자 표면으로 이동 레이저 손상을 제안, 3-6 제안되었습니다 배아 7 tailfin 절단 3,5,6. 이러한 방법의 주요 단점은 있지만였다수동 유충 조작의 요구하므로 높은 처리량 검사를 방지할 남긴 상처를 유발합니다. 화학적으로 유도된 염증 (친) 분석 8 도입은 이러한 장애물을 제거. 남긴 상처를 입은 있기 때문에 화학적으로 동시에 치료할 수 배아의 개수는 거의 제한이 없습니다. 구리 황산과 zebrafish 애벌레의 임시 치료 선택 측면 라인 시스템 및 부상 neuromasts에 대한 신속한 과립 모집 결과의 세포에서 세포 죽음을 유도합니다. 염증성 반응은 화합물 유전자 변형 cldnB :: GFP / lysC :: neuromast 세포뿐만 아니라 빨간 형광 단백질 상표 granulocytes에 녹색 형광 단백질을 표현 DsRED2 6,9 zebrafish 애벌레를 사용하여 실시간으로 따라 할 수 있습니다. 모두 높은 컨텐츠와 높은 처리량 분석을 허용 심사 전략을 고안하기 위하여 우리는 로봇 액체 핸들링과 결합된 자동 micr을 도입사용자 정의 개발 소프트웨어 스크립트 oscopy. 이 스크립트는 부상 녹색 형광 neuromasts를 둘러싼 경험적으로 정의된 영역 내에 빨간색 형광 leukocytes에 의해 점령 %의 영역을 채점하여 염증 반응의 자동 부량 수 있습니다. 또한, 자동 데이터 처리, 처리, 시각화, 스토리지는 MATLAB과 파이썬 스크립트를 개발 정의에 기초. 간단한에서는 granulocytic 염증 반응의 개시, 진행이나 ​​해상도에 미치는 영향에 대한 화학적 화합물의 테스트를 허용 자동 HC / HT 화면을 소개합니다. 이 프로토콜은 타고난 면역 반응의 오케스트 레이션에 관련된 약물 메커니​​즘과 경로보다 심층적인 분석을위한 좋은 출발점을 제공합니다. 앞으로, 그것은 약물 발견의 초기 단계에서 참을 독성이나 오프 타겟 효과를 식별하는 데 도움함으로써 약물 개발을위한 절차적 위험과 비용을 절감할 수 있습니다.

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K 조회수.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. 여기 면역 - modulatory의 bioactives의 식별을 목표로 소설 높은 콘텐츠를 화학적으로 유도된 염증 분석을 설명합니다. 우리는 성공적으로 염증 반응뿐만 아니라 추가로 데이터 처리, 분석, 마이닝, 그리고 저장 장치의 자동 부량을 활성화하는 사용자 정의 개발 소프트웨어의 스크립트와 자동화된 현미경을 결합했습니다.

비디오: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

연구

암 연구학

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

면역학 및 감염병학

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

신경과학

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

생물학

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

의학

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

제브라피시 배아의 독성 평가를 위한 Startle 분석

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

저자 스포트라이트: Zebrafish Embryo Startle Response Assay를 사용한 고처리량 독성 스크리닝

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

요약

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제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Zebrafish 배아를 이용한 화학 화합물의 독성에 대한 신속한 평가

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가

제브라피시 진동 놀람 반응 스크리닝 시스템을 사용한 화학물질의 독성 평가