이 작품은 NSERC 개인 디스커버리 프로그램 NSERC / CIHR 공동 건강 연구 프로그램 (CHRP) 및 NSE​​RC CREATE 캐나다 생물학 교육 프로그램 (CATP)에 의해 재정 지원되었다.

1. QD의 Solubilization 이것은 CdTe에 적합한 방법입니다. 비슷한 방법 등 InP / ZnS 20 CdSe / ZnS 21 등 QDs 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다. <ol><li> 15 μm의 (첫 번째 exciton 피크에서 광학 밀도 = 2.5)에서 톨루엔의 CdTe QDs의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 유리관에이 주식 200 μL를 전송합니다. 플라스틱을 사용하지 마십시오! </li><li> 800 μL 톨루엔, 200 밀리미터 borate 버퍼 (산도 9) 1 ML과 11.5 M mercaptopropionic 산성 (MPA) 2 μL를 추가합니다. </li><li> 병을 모자 30~60초을 위해 적극적으로 잡고 흔들어. </li><li> 수성 및 유기 - 용매 단계는 자발적으로 분리됩니다. 수성 단계 QDs의 색상이 될 것입니다. 톨루엔 층을 방지하려면 그것을 제거하고 그것을 버리고. 그런 다음 깨끗한 유리병에 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 500 μL, 10000 분자량의 컷오프 원심 분리기 필터를 사용하여 네 번 세척 / 필터링하여 solubilized QDs를 정화. 필터는 있어야13분위한 3,000 XG에 불러 냈어요. 최소한 지난 두 세차장 들어, 원하는 최종 버퍼로 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 4 ° C.에 원하는 산도와 가게에서 50 밀리미터 borate 버퍼에서 한물간 QDs을 정지 그들은 1-2 주 동안 안정 될 것입니다. </li><li> 출판 수식 22을 기반으로 농도를 추정하는 흡광도와 발광 스펙트럼을 측정합니다. </li></ol> 대표 결과 : 그림 1은 자외선 램프 조명 아래 CdTe QDs의 이미지를 보여주고, 물의 solubilization 전후 방출 스펙트럼은 캡 교류에서 무시할 변화를 보여주고 있습니다. 크기 값은 전자 현미경으로 측정 코어 직경입니다. 2. 항생제에 대한 QD 활용 프로토콜의이 부분은 ​​대부분의 상용 QDs, 금속 입자 등 19를 포함한 어떠한 부정 - 충전 물 solubilized nanoparticle에 적용됩니다. <ol><li> 모든 분자가 작동 것이다 eith응급실에 부정 - 충전 solubilized QDs에 자기 조립, 또는 그것과 같은 차 아민으로서 복합 될 수 있습니다 반응성 그룹을 가지고 있습니다. 이 예제에서 우리는 긍정적으로 충전과 활용의 시약을위한 필요없이 자체 - 조립되어 polymyxin B (PMB)를 사용하고 있습니다. 60 μm의에서 H 2 O에서 PMB를 해산. (선택된 항생제는 H 2 O를 용해없는 경우 0.1-1 mm의 농도로 DMSO 또는 에탄올에 용해). 이것은 10X 솔루션 (H 2 O) 또는 100x 용액 (용매)을 것입니다. </li><li> 당신은 세균성 독성 실험에 필요한 어느 정도 QD 솔루션을 계산합니다. 0.3 ML 당 잘 quadruplicates에있는 96 - 웰 플레이트의 경우, 200 나노미터 켤레축 0.5 ML이 필요합니다. 50 MM borate 버퍼 1 μm의 양자 도트의 100 μL 담긴 두개의 튜브를 준비합니다. </li><li> 일차 아민에 결합하면 19 밀리그램 / ML (100 ㎜) 1 - 에틸 -3 - [3 - 디메틸]의 솔루션은 H 2 O에 관련 carbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC)를 준비 솔루션 EDC는 안정되지 않습니다, 즉시 사용하고 나머지는 버린다. </li><li> 10X 항생제 용액 (H 2 O) 또는 켤레축 튜브로 100x 용액 (용매에서) 5 μL의 50 μL를 추가합니다. PMB의 경우 : 30:1의 어금니 비율 CdTe 활용은, 60 μm의 제품 PMB 50 μL를 추가합니다. H 2 O 또는 QD 전용 제어 튜브에 솔벤트를 추가합니다. </li><li> 필요한 경우 켤레축 튜브에 EDC 주식 용액 1 μL를 추가합니다. </li><li> 적절한 버퍼 (; 같은 트리스 등 노 아민 함유 버퍼, 그들은 EDC를 억제하므로 borate 버퍼 또는 PBS)로 0.5 ML에 켤레축 볼륨을 가져와. </li><li> 1 시간을위한 nutator 또는 로커에 알루미늄 호일, 장소와 빛과 실드 튜브. 집계가 발생하면 항생제의 낮은 농도와 결합을 반복합니다. 입자가 집계하지 때까지 농도 위쪽 적정하다. </li><li> 적절한 필터를 통과하여 conjugates 씻으십시오. 10,000 분자량의 컷오프 대부분의 항생제에 대한 아니지만 단백질이나 항체에 적용됩니다. </li&gt; <li> 흡광도 또는 형광 분광법, 겔 전기 영동, 또는 푸리에 변환 적외선 분광 (FTIR) : 분자에 따라 다른 방법 QD 당 항생제 분자의 개수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과가 있습니다.이 예제에서는 PMB의 활용은 QD 발광 스펙트럼의 변화에 의해 특징입니다. 그림 2는 PMB 더불어 함께 CdTe QDs의 스펙트럼을 보여줍니다. 3. 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 준비, 항생제 IC에서 50 결정 이것은 적절한 매체를 18 년 재배 거의 모든 박테리아 변종에 적용됩니다. 녹음을 계속해야 시간의 정확한 길이는 세균의 성장 속도에 따라 달라집니다. 우리 예제에서, 우리는 lysogeny 스프 (LB) 배지에서 자란 대장균을 사용합니다. <ol><li> 적절한 QD 켤레축의 농도를 선택하기 위해서는 그것을 아는 것이 중요항생제의 IC 50 혼자 QDs가 독성이있는 경우 복합하게합니다. 이것은 2 일 활용 실험 전에 시작되어야한다. 저녁에는 신선한 식민지에서 세균 성장​​ 매체의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용합니다. </li><li> 다음날, 1-2 시간 실험을하기 전에, 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL (농도가 특정 변형이 성장 얼마나 빨리 의존하게되며 귀하의 실험실에서 보정해야합니다)와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다. </li><li> 플레이트 판독기에 접시를 넣고 결정 파장 (보통 600 nm의)에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다. 박테리아가 너무 빨리 너무 조밀한 성장하지 않도록 접시를 모니터링합니다. </li><li> 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다. </li><li> 혼자 약물을 추가하고 홀로 QDs적어도 triplicates 서로 다른 농도. &quot;어둠&quot;의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 3에 있습니다. 농도 한 아주 작은 박테리아를 억제 농도, 그리고 그들을 모두 죽이고 하나를 포함하는 광범위한 충분한 범위에 걸쳐해야합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시의 &quot;어둠&quot;의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다. 우리는 2.4 MW 개의 LED (그림 4)와 30-60 분 비추다 만든 사용자 지정 96 자, ​​440 nm의 램프를 사용합니다. 맑은 하의와 검정색 접시는 길 잃은 빛으로부터 unexposed 박테리아를 보호하는 데 도움이됩니다. 빈 컬럼도 노출 및 취소 노출된 양쪽간에 사용할 수 있습니다. </li><li> 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 성장률에 따라 5-12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. 보관 온도 &lt;32 ° C의 문화 건조 회피 할수있다면.에게 </li><li> 성장 곡선을 그리기선택한 시점에서 대 로그 [농도]와 힐 방정식을 사용하는 항생제의 IC 50 결정 : </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> H가 힐 계수이고, y를 최대 성장 (이상 고원에있는)의 가장 높은 지점이며, Y 분 고원에서도 이상적으로, 제로 지점입니다. 그것은 혼자 QDs 사용한 농도에서 세포 독성 정도 표시되지 않을 것이므로 값이 결정되지 않습니다. 대표 결과입니다. 녹음 기간 끝에, 맑은 우물이 완료 세포 죽음을 나타내는 것이고, 세포 밀도 구배는 약물의 농도를 증가를 따라 나타납니다. 박테리아는 S 자형 성장 곡선 (그림 5) 표시한다; 최대 고원의 위치는 변형하기 변형에서 매우 다양하며 온도에 따라 달라집니다 것입니다. 주어진 시점이 될 수 있습니다대표로 선택하고 값을 꾸몄다 대 로그 [항생제] IC에서 50 (그림 5 B에게) 주다. QD 독성을 평가하기 위해, 생존 대 로그 [QD]도 꾸몄다하지만, 혼자 QDs과 상당한 세균 살인을 달성하면 (그림 5 C) 드문 경우가 있습니다. 4. 항생제 / QDs와 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 작성 <ol><li> 실험, 적절한 풍부한 매체로 새로운 식민지에서 문화의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용하기 전에 일. 그것이 매우 불안정하지 않는 QD-항생제 켤레축는이 날에 대비해야합니다. </li><li> 실험 전에 1~2시간은 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다. </li><li> 플레이트 판독기에 접시를 넣고 부 3과 같은 파장에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다.</li><li> 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다. </li><li> 적어도 사통으로 작성된 서로 다른 농도에서 QD conjugates를 추가합니다. &quot;어둠&quot;의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 6에 있습니다. 박테리아는 전용 제어 스트립은 항상 문화, 온도와 케이스의 문제에 포함되어야하는 등 성장 조건에 영향을 미칩니다. 단일 전용 약물의 스트립에만 QD는 또한 이전에 완료 제어 판과 일치하도록 포함되어야합니다. 우물의 나머지 부분은 좋은 통계를 허용하기 위해 conjugates을 다하고 있습니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시의 &quot;어둠&quot;의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 5~12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. &lt;32 ° C 가능하면 박사를 피하기 위해 온도를 유지문화 잉. </li></ol> 대표 결과입니다. QDs과 항생제의 조합은 혼자 항생제보다 독성이있을 수 있으며, 마찬가지로 독성, 이상 독성. 이것은 성장 곡선과 IC 50 측정을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 그림 7 그 항생제로서 동등하게 독성 혼자, 그리고 더 많은 독성 conjugates의 예를 conjugates의 예를 보여줍니다. 5. 플레이트 카운트 <ol><li> 시리얼 dilutions과 식민지의 계산에 사용되는 치료를 9​​6 - 웰 플레이트 중 하나 이상 우물을 선택합니다. </li><li> PBS 또는 생리 식염수 (0.9 % NaCl)로 선택된 세균 샘플은 각각의 시리얼 희석하십시오. 세균 용액 20 μL를 전송 180 μL 생리 식염수로 희석, 피펫 팁, 믹스를 변경 180 μL 생리 식염수로 희석 세균성 해결책 20 μL를 전송합니다. 6 회 반복합니다. </li><li> 적절한에 각 희석 및 플레이트에서 10 μL을 가지고<html> 고체 미디어 플레이트. 그것이 물건을 살해하는 것이 더 쉽습니다로서 직사각형 요리가 선호되고 있지만 한 샘플의 모든 8 농도는 10cm 원형 배양 접시에 도금 수 있습니다. </li><li> 벌써 15 분 벤치에 말리면. 다음 16시간 동안 세균에 적합한 온도로 품어. </li><li> 에 (# 콜로니의 X 희석 계수) / 볼륨 도금 = CFU / ML. 따라 식민지 백작과 콜로니 형성 단위 (CFU)를 계산 </li></ol> 그림 8은 예제 CFU 플레이트를 보여줍니다. 6. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> 그림 1. CdTe의 QDs. () CdTe QDs의 여덟 준비는 자외선 지팡이 (365 nm의)와 조명. 물 solubilization 전과 후 5 선택한 크기의 (B) 흡광도와 방출 스펙트럼. 점선 라인이 톨루엔의 스펙트럼이며, 고체 라인은 물에있다. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. QD-PMB conjugates의 스펙트럼과 겔 분석. 오렌지 발광 CdTe의 QDs이 예제에 사용되었다; QDs 다른 종류의 효과가 각 실험에 대해 평가해야합니다. () 전형적인 흡광도 (회색 라인) 및 PMB의 활용 및 PMB 160 어금니 등가물의 추가 후 방출 (점선) 이전 QDs의 방출 스펙트럼 (블랙 라인). PMB의 비율과 QD 방출 강도 (사각형)과 피크 파장 위치 (삼각 관계) 사이 (B) 관계. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> 그림 3. 제어 성장 접시 플레이트 레이아웃을 제안했습니다. PMB와 QD 농도의 넓은 범위가 표시됩니다. 판 중 하나는 절반 (파란색 강조 표시) 반구되고, 동일한 절반 빛으로부터 보호됩니다. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>큰 그림을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> 그림 4. 균일한 플레이트 조사하기위한 사용자 지정 96 LED 램프, 외관을 자랑 되겠지요. 일반적인 휴대용 자외선 램프도 사용할 수 있지만 균일하게 전체를 커버 플레이트하지 않습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> 그림 5. 제어 성장 플레이트에 대한 예제 결과입니다. () 다른 약물 농도와 대표 세균 성장​​ 곡선은 0에서 세포 죽음을 완료합니다. 농도가 주어로 열린 기호 PMB에만이므로 단단한 기호 조사없이 CdTe-PMB가, 그리고 절반 채워진 기호 조사와 CdTe-PMB입니다. 조사는 PMB 전용 샘플에 아무런 영향을 미치지 않았다, 이러한 곡선은 명확성을 위해 생략되었다 그래서. QD 비율 : 모든 PMB-CdTe conjugates는 30:1 PMB입니다. (B) 200 분 대 로그 [PMB]의 성장 곡선 값의 음모하고 EQ로 맞출 수 있습니다. (1). cont하기빛의 효과를위한 rol은 곡선은 빛의 노출 30 분과 항생제와 함께 이루어집니다. CdTe QDs를 사용하여 200 분 대 QD 농도,시 (C) 세균의 생존. 일부 독성은 IC 50 값을 결정하는 빛의 노출,하지만 너무 작은과 함께 볼 수있다. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> 그림 6. 켤레축 테스트 플레이트에 대한 레이아웃을 제안했습니다. 접시의 파란색 강조 절반 빛에 노출되어야하고, unhighlighted 절반 보호를받습니다. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> 그림 7. 예를 켤레축 테스트 플레이트에 대한 검색 결과. 200 분의 성장 곡선 값은 PL 있었다otted와 EQ에 적합. (1). () CdTe-PMB의 conjugates 혼자 PMB를 통해 독성을 증가 보여줍니다. (B) 골드 nanoparticle AU-PMB의 conjugates 혼자 PMB 아무런 독성 증가를 보여 없습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> 그림 8. CFU 플레이트의 예. E. 96 - 웰 플레이트에 놓는 대장균은 30 분 조사와 함께 또는없이 QD-PMB로 치료되었다. 다음 4 시간 동안 32 ° C에서 incubated. 각 세균 시료의 시리얼 dilutions은 생리 식염수와 10 7 X의 dilutions ~ 100 X 10 μL로 만들어진이 한천 조각 위에 도금되었다. 플레이트는 37 ° C와 식민지 16 시간 후에 집계되었다 incubated되었다. 플레이트는 지시와 같은 행을 따라 dilutions를 표시, 컬럼은 다음과 같습니다 (A) 0.06 μm의 PMB + 2 NM CdTe, (B) 0.12 μm의 제품 PMB + 4 nm의 CdTe (C) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe, (D) 0.06 μm의 PMB + 2 NM은 반구 (E) 0.12 μm의 PMB + 4 NM CdTe 반구, (F) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe irra를 CdTediated.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates.">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101 (2011).</li><li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitization+of+CdSe/ZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production.">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li><li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe/ZnS+quantum+dots+in+water:+A+procedure+guided+by+computational+studies.">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li><li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP/ZnS+core-shell+quantum+dots.">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Nanoparticles은 새로운 안티 미생물 대리인의 창조에 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 성장 곡선 분석은 성장 저해 세포에서 적극적으로 재배 세포를 구별 세균 세포 밀도를 모니터링하는 방법입니다. 플레이트 카운트와 결합하면 켤레축의 항생제 가능성에 대한 철저한 분석을 위해 수 있습니다. 96 - 웰 형식은 가벼운 노출과 같은 농도의 상대적으로 높은 처리량 변화 및 ​​기타 조건을 허용하고,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 버퍼 구성 요소에게 # 1 Borate </td><td> 어부 </td><td> 붕산 - 74-1 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼 구성 요소 # 2 Borate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 나트륨 테트라 보 레이트 B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA는 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9322 </td><td> 가능한 다양한 MWCO </td></tr><tr><td> 유리 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 GRowth 매체 (LB) 구성 요소 # 1 </td><td> 어부 </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 성장 매체 (LB) 구성 요소 # 2 </td><td> BD </td><td> Tryptone 211,705 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 성장 매체 (LB)는 구성 요소 # 3 </td><td> BD </td><td> 효모 엑기스 211,929 </td><td></td></tr><tr><td> 빛의 노출을위한 램프 </td><td> 사용자 정의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 삭제 - 하단 96 - 웰 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> 07-200-567 또는 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 분광계 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흡광도 플레이트 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고체 미디어 BactoAgar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시는 높이 들어라 </td><td> 어부 </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> 직사각형 배양 접시 </td><td> 어부 </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilization and bio-conjugation of quantum dots and bacterial toxicity assays by growth curve and plate count

양자 점 (QDs)은 파장의 폭넓은 선택에 의해 흥분하게 크기에 의존 방출 스펙트럼과 형광 반도체 nanoparticles입니다. QDs는 이미징, 진단 및 그들의 밝고 안정된 형광 1,2 3,4,5으로 인해 치료에 대해 많은 관심을 받고있다. QDs는 박테리아와 포유 동물 세포를 6으로 바인딩을위한 생체 활성 분자의 다양한 복합 될 수 있습니다. QDs도 널리 박테리아 타겟으로 살인에 대한 세포 독성 대리인으로 조사되고있다. 번식 방지 박테리아 변종의 출현은 급속히 특히 그람 음성 병원균 7의 경우, 공중 보건의 위기가되고있다. 때문에 특히 특정 nanomaterials, AG의 잘 알려진 항균 효과, 세균 8 nanoparticles의 독성을 조사 연구 수백가 없습니다. 박테리아 연구 espec뿐만 반도체 nanoparticles 다른 유형으로 수행되었습니다ially 티오이 9,10-11뿐만 아니라, ZnO 12 CuO 13를 포함하여 다른 사람. 박테리아 변종의 일부 비교는 주로 그람 양성과 그람 부정적인 변형을 비교,이 연구에서 수행되었습니다. 입자 또는 산화 독성을 일으킬 수 금속 이온의 직접적인 릴리스에 의한 반응성 산소 종의 photogeneration (ROS) 중 이러한 입자 모두 함께 독성의 메커니즘은 산화에 기인한다. 비록 이러한 자료와 함께, 다른 연구 결과는 크게 다릅니다. 일부 연구에서 그람 양성 시험 변형율은 그람 음성 10 개 보도에 더 민감, 다른 사람에 그것은 반대로 14입니다. 이러한 연구가 잘 15 검토되었습니다. 모든 nanoparticle 연구에서는 입자 성분, 크기, 표면 화학, 샘플 노화 / 고장과 파장, 전력, 가벼운 노출의 기간은 모두 극적으로 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, synthesi에게 있음님의 부산물 및 용제는 16 17로 간주되어야합니다. 하이 스루풋 스크리닝 기술은 효과적인 새로운 nanomedicine 에이전트를 개발 할 수있는 능력이 필요합니다. CdTe의 QDs는 안티 미생물의 효과가 혼자 18 항생제와 함께 있습니다. 이전 연구에서 우리는 CdTe 위해 항생제의 커플링 것은 19 conjugates에서 반응성 산소 종의 감소 생산으로 인해, 박테리아에 독성을 증가하지만, 포유 동물 세포에 독성을 줄일 수있는 것으로 나타났다. 그것이 카드뮴 함유 화합물은 인체에 사용하기 위해 승인되지 않을 수도 있지만, 그러한 준비가 표면이나 물이 살균의 살균에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 mercaptopropionic 산성 (MPA)와 CdTe QDs을 solubilizing에 직접적인 접근 방식을 제공합니다. QDs는 시간 내에 사용할 수 있습니다. 그러면 항균 대리인에게 커플링 보여줍니다. 프로토콜의 두 번째 부분복합 및 unconjugated QDs를 사용하여 96 - 웰 세균 억제 분석을 보여줍니다. 광학 밀도 QD 이외 및 복구 기간이 지나면뿐만 아니라 즉시 평가될 수 있도록 빛의 노출 효과를 허용, 많은 시간 동안 읽을 수 있습니다. 또한 세균의 생존을 quantifying위한 식민지 수를 보여줍니다.

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Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

이러한 반도체 양자 점 (QDs)와 같은 Nanoparticles은 안티 미생물이나 안티 암 어플 리케이션을위한 photoactivatable 요원을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 방법 보여줍 물 solubilize 항생제로 활용하다, 그리고 성장 곡선 및 플레이트 카운트를 기반으로 세균 억제 분석을 수행, 카드뮴 텔라이드에 (CdTe) QDs합니다.

성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K 조회수.  McGill University, Montreal, QC Canada. 이러한 반도체 양자 점 (QDs)와 같은 Nanoparticles은 안티 미생물이나 안티 암 어플 리케이션을위한 photoactivatable 요원을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 방법 보여줍 물 solubilize 항생제로 활용하다, 그리고 성장 곡선 및 플레이트 카운트를 기반으로 세균 억제 분석을 수행, 카드뮴 텔라이드에 (CdTe) QDs합니다.

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A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

A whole cell bioreporter assay with Burkholderia sartisoli RP037-mChe was developed to detect fractions of an organic contaminant (i.e., fluorene) available for bacterial degradation after active transport by mycelia bridging air-filled pores in a water unsaturated model system.

전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

연구

환경과학

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

생체공학

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

생산 및 일가 양자점 타겟팅

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

면역학 및 감염병학

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been explored previously in clinical and environmental settings and in consumable food products. However, a lack of consistency in the experimental methods and materials used has culminated in conflicting results, even amongst studies of the same nanostructure types and bacterial species. For researchers who wish to employ nanostructures as an additive or coating in a product design, these conflicting data limit their utilization in clinical settings. 
To confront this dilemma, in this article, we present four different methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, and discuss their applicability in different scenarios. Adapting consistent methods is expected to lead to reproducible data that can be compared across studies and implemented for different nanostructure types and microbial species. We introduce two methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and two methods for the antimicrobial activities of nanostructured surfaces. 
For nanoparticles, the direct co-culture method can be used to determine the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of nanoparticles, and the direct exposure culture method can be used to assess real-time bacteriostatic versus bactericidal activity resulting from nanoparticle exposure. For nanostructured surfaces, the direct culture method is used to determine the viability of bacteria indirectly and directly in contact with nanostructured surfaces, and the focused-contact exposure method is used to examine antimicrobial activity on a specific area of a nanostructured surface. We discuss key experimental variables to consider for in vitro study design when determining the antimicrobial properties of nanoparticles and nanostructured surfaces. All these methods are relatively low cost, employ techniques that are relatively easy to master and repeatable for consistency, and are applicable to a broad range of nanostructure types and microbial species.

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduce four methods to evaluate the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces using in vitro techniques. These methods can be adapted to study the interactions of different nanoparticles and nanostructured surfaces with a broad range of microbial species.

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials

Ultrahigh molecular weight polyethylene (UHMWPE) is widely used in total joint arthroplasties as a load-bearing surface. Periprosthetic joint infections, the majority of which occur shortly after joint replacement, constitute almost 25% of total knee revision surgeries, and the complete eradication of bacterial infection poses a major challenge. A promising way to tackle this problem is to ensure the local sustained delivery of antibiotic concentrations sufficient to inhibit the bacteria to support routine systemic antibiotic prophylaxis. There is increased research into the development of efficient local drug delivery devices. Although established antibacterial testing methods for drugs can be used to test the antibacterial efficacy of drug-eluting materials, they are lacking in terms of providing real-time and longitudinal antibacterial efficacy data that can be correlated to the elution profiles of antibiotics from these devices. Here, we report a direct and versatile methodology to determine the antibacterial efficacy of antibiotic-eluting UHMWPE implants. This methodology can be used as a platform to avoid bacterial culture at each time point of a lengthy experiment and can also be adapted to other local drug delivery devices.

Here, we present a protocol to evaluate the antibacterial efficacy of an antibiotic-eluting polymer to simulate prophylactic clinical application by using a commercially available real-time ATP-based luminescent microbial viability assay. This method enables the monitoring of the longitudinal activity of drug-eluting materials and can be widely adapted to test anti-microbial drug delivery platforms.

약물 용출 물질의 종방향 항균 활성을 측정하는 새로운 방법

Ultrahigh molecular weight polyethylene (UHMWPE) is widely used in total joint arthroplasties as a load-bearing surface. Periprosthetic joint infections, ...