이 작품은 K. Teter에 NIH R01 부여 AI073783에 의해 투자되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기위한 subcellular 분별화 프로토콜과 헬렌 Burress의 개발에 도움 박사 쉐인 메시 감사합니다.

1. digitonin의 준비 <ol><li> microcentrifuge 튜브에 100 % 에탄올 500 μL를 추가하고 80 ° C 10 분에 대해 설정된 열 블록에 넣습니다. </li><li> digitonin의 1 % 주식 솔루션을 생산하는 온수 에탄올 250 μL에 dig​​itonin 2.5 MG를 해산. </li><li> 0.04 %의 digitonin의 작업 솔루션을 생성하려면, HCN 버퍼 960 μL (50 MM의 Hepes 산도 7.5, 150 MM NaCl, 2 MM CaCl 2, 10 MM N - ethylmaleimide, 그리고 테아제 억제제에 digitonin 주식 솔루션 40 μL를 추가 칵테일). </li></ol> 2. 휴대폰 중독과 permeabilization 우리 translocation 분석은 독소와 세포 라인의 범위에 적용할 수 있습니다. 아래, 우리는 콜레라 독소 (중부 표준시)의 검출에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 절차의 개요는 그림 1에서 제공됩니다. <ol><li> HELA 세포는 10 % 보충 한 ML DMEM을 포함하는 6 자 접시에 씨앗을 품고 아르 태아 소 혈청과 항생제 - antimycotic1x10 6 세포를 달성하기 위해 / 잘 후에 37 하룻밤 인큐베이션 ° C. 재현성 감지하기에 충분한 cytosolic 독소를 생성하려면, 세중의 위 각 조건이 필요합니다. </li><li> 하룻밤 부화 다음, 1 ML DMEM이 ganglioside GM1의 100 NG / ML을 포함하는으로 배지를 교체하십시오. 중부 표준시의 GM1 수용체가 GM1의 솔루션에 노출된 세포의 플라즈마 막에 사이에 끼어 넣다하므로 이것은, CT에 대한 구속력이있는 사이트의 수를 증가합니다. </li><li> 37 1 시간 보육 후에 ° C, GM1 - 포함된 매체를 제거하고 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻으십시오. 그런 다음, 4 셀 배치 ° C 일 ML DMEM 1 μg / 중부 표준시의 ML을 포함에서 30 분. </li><li> 37, 독소 함유 매체를 제거 DMEM과 함께 두 번 세포를 씻어, 1 ML DMEM으로 세포를 품어 ° 원하는 시간 간격 (S)에 대한 C. </li><li> 각 추적 기간의 끝에, PBS로 세포를 씻어하고 PBS에 0.​​5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 250 μL와 각각 잘 품어. 세포가 10 앉아서 보자<html> 다음 상온에서 분 및 P1000 pipetman로 활발한 분쇄하여 6 잘 플레이트에서 제거합니다. 세포 중 하나를 잘 수집되고 나면 잘 같은 상태에서 두 번째 그리고 셋째로 결합되어 있습니다. 세포기구 또한 세포를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 단일 microcentrifuge 튜브의 세 가지 복제 우물 (750 μL 총 볼륨)에서 결합된 세포 현탁액을 놓고 5000 X G.에서 5 분 탁상 microcentrifuge에 스핀 대략 동등한 크기의 셀 알약은 모든 조건을 획득해야합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 digitonin의 0.04 % 작업 솔루션을 100 μL의 세포 펠렛을 resuspend. 10 분 얼음에 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 탁상 microcentrifuge 10 분 16,000 XG에서 digitonin - permeabilized 세포를 돌린다. 새로운 microcentrifuge 튜브에 cytosol 함유 뜨는 분수를 전송하고, organelle 함유 펠렛 분율을 유지합니다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 3. 샘플 준비 <ol><li> Cytosol 함유 뜨는 분수는 1 ML의 최종 볼륨 HCN 버퍼에 희석 수 있습니다. 최소한 1 ML의 샘플 볼륨은 공기가 주입되기 전에 500 μL 시료 루프에서 정화되도록하기 위해 필요합니다. </li><li> Organelle 함유 펠렛의 분수는 1퍼센트 트리톤 X - 100을 포함하는 HCN 버퍼 1 ML에 resuspended 있습니다. 세제의 추가는 독소의 멤브레인 - 쌌다는 수영장을 공개하는 것이 필요합니다. </li><li> 100 농도, 10, 1, 0.1 NG / ML에서 독소 기준은 HCN 버퍼에 준비가되어 있습니다. </li><li> cytosolic 및 organelle 분수의 양대 세트 분획화 절차의 충실도를 확인하기 위해 제어 실험을 준비하고 있습니다. 분수는 4X 샘플 버퍼 (cytosolic 분율) 또는 1X 샘플 버퍼 (organelle 분율) 120 μL의 20 μL에 resuspended 아르 제 2에 설명되어 생성. 각 분획의 상응하는 볼륨은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 겔 전기 영동에 의해 해결하고 B를 탐색할 아르Y 서양 얼룩 분석 뜨는 분수에서 cytosolic 단백질의 파티션 및 펠렛 분율 16-19에 용해, 주민 ER 단백질을 설명합니다. </li></ol> 4. SPR 슬라이드 준비 <ol><li> Reichert SR7000 SPR 굴절계는 SPR 실험에 사용됩니다. </li><li> SPR의 악기에 자기 조립 monolayer와 금도금 유리 슬라이드를 설정합니다. 41 μL / 분의 유량 10 분 슬라이드를 통해 0.4 M 및 0.1 M EDC의 보건국의 솔루션 : 센서 슬라이드를 활성화하려면, 1:1 (V V)를 perfuse. 이후의 모든 perfusions 같은 유량을 사용합니다. </li><li> EDC 제거하려면 다음 보건국 활성화 버퍼를, PBS는 0.05 %에게 십대 초반 20 (PBST)을 포함하는 5 분 접시를 씻으십시오. 보건국 솔루션 : 접시는 현재 EDC로 uncapping에 의한 반응 아미드 tethers가 포함되어 있습니다. </li><li> 15 분 20 MM의 아세트산 나트륨 (산도 5.5)에서 1:20,000의 희석에 활성화된 센서 슬라이드를 통해 안티 CTA 항체를 Perfuse. 의 굴절률에 초기 드롭덱스 단위 (RIU)은 산도의 변화로 인해 보여줄 것입니다. 항체가 센서 슬라이드에있는 아미드 반응 tethers 점령므로 이것은 RIU 증가가 뒤따라갈 겁니다. </li><li> 5 분 PBST 세척과 센서 슬라이드에서 언바운드 항체를 제거합니다. 캡처한 항체에 의해 만들어진 RIU 신호 고원과 안정화는 새로운 기준 신호를 제공합니다. </li><li> 5 분 센서 슬라이드를 통해 Perfuse 1 M ethanolamine (산도 8.5). 이 모자와 센서 슬라이드에 남아있는 언바운드 tethers을 inactivates. </li></ol> 5. 샘플 SPR 분석 <ol><li> 5 분 항체 - 코팅 센서를 통해 기본적인 읽기, perfuse의 PBST을 설정합니다. </li><li> 300 초에 대한 센서를 통해 실험 샘플이나 독소 표준을 Perfuse. 또 200 초에 대한 센서를 통해 버퍼와 perfuse의 PBST에서 리간드를 제거합니다. </li><li> 각 재관류 후, 행 독소는 산도 5.0에서 PBST로 100 초 세척하여 센서에서 제거됩니다. 이것은 신호를 반환합니다따라서 다른 샘플이 동일한 센서 처리 수 있도록. 초기 기준 읽기에 </li><li> 새로운 샘플을로드하기 전에, 이전 예제에서 잔여 액을 추방하기 위해 샘플 루프를 통해 공기의 작은 금액을 밀어. 5.2-5.4에서 설명한 절차를 사용하여, 우리는 기준 신호의 실질적 손실없이 슬라이드 12 샘플까지 실행합니다. </li><li> 데이터 분석은 스크러버이 소프트웨어와 함께 수행하고, 이고르 소프트웨어는 그림 준비에 사용됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 백일해 독소 (PT)는 체인 (PTS1)는 cytosol 세, 12를 입력하기 전에 응급실로 세포 표면에서 이동 AB 독소입니다. 그림 2에 표시된 우리 SPR 기반 translocation 분석은 음주 CHO 세포의 cytosol에 PTS1를 검색할 수 있습니다. 신호는 안티 - PTS1 항체는 호스트 cytosol의 구성 요소와 교차 반응하지 않았 확인 unintoxicated 세포의 cytosol에서 생성되지 않았습니다.brefeldin (BfA)의 존재에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 또한 긍정적인 신호를 생성하지 못했습니다. BfA는 ER의 translocation 사이트 6-8, 12, 20-25, 그리고 따라서, cytosol에 체인 전송 독소 전송을 방지합니다. 각 실행의 끝에 행 독소는 센서 슬라이드에서 제거됩니다. 이 허용되는 복수의 샘플은 하나의 센서 슬라이드 상영함으로써 다양한 실험 조건에 얻은 결과 사이에 직접적인 비교를 제공합니다. CT도 다른 AB 형, ER - translocating 독소 4. 그림 3A에서 CTA1는 CT - 치료 HELA 세포에서 cytosolic 분수에서 발견되었다. 이것은 우리의 방법론은 여러 세포 유형에서 작동하고 방지 체인 항체를 사용할 수있는 모든 독소에 적용할 수 있습니다 강조했다. CT - 처리된 세포에서 cytosolic 분수가 안티 CTB 항체 (그림 3B)로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused 때 아무 신호 따라서 그런 CTA1에게 보여주는 감지되지 않았습니다subunit는하지만 셀 바인딩 CTB pentamer는 cytosol를 입력하지 않습니다. 그림 3C는 organelle 분획에서 신호가 cytosolic 분수에서 약한 신호에 비해 오프 규모입니다 보여줍니다. 이것은 차례로 cytosol에 도달할 수있는 독소의 양을 제한 ER translocation 사이트 6, 7에 중부 표준시 교통의 알려진 비효율과 일치했다. 또한, organelle 분율은 중부 표준시의 holotoxin뿐만 아니라 ER -화된 CTA1가 있으므로, organelle 분율에 대한 결과 SPR 신호 holotoxin - 관련 CTB pentamer의 추가 질량에 의해 증가됩니다 포함되어 있습니다. 그러므로, 그것은 같은 sensorgram에 organelle과 cytosolic 분수에서 데이터를 계획하기 위해 실용적되지 않습니다. 우리의 분석은 translocated, cytosolic 독소 (그림 4)의 시간 의존 축적을 모니터링할 수 있습니다. 전지는 4 중부 표준시에 노출되었습니다 ° C, 플라즈마 막에 독소가 구속 수 있지만 휴대 관련된 독소의 내면화를 방지 온도를. remo 후언바운드 독소의 발은, 세포는 37 ° C.에 따뜻하게했다 응급실에 독소 운송 및 cytosol에 체인 translocation 모두는이 온도에서 발생할 수 있습니다. 아무도 독소는 온난 후 37 ° C.에 cytosol 15 분만에 감지되지 않았습니다 이것은 응급실에은 (i) holotoxin 거래에 필요한 지연 시간을 반영하며 응급실에서 (2) A / B의 subunit의 분리 및 cytosol에 (3) 체인 내보낼 수 있습니다. cytosolic 독소의 작은 수영장이 C는 37 ° 30 분 후에 발견되었고, cytosolic 독소 점차적으로 큰 수량은 45 60분 체이스 간격 이후에 발견되었다. cytosolic 독소의 더욱 수준 때문에 호스트 cytosol로 휴대 관련된 독소의 지속, 장기적인 납품을 보여주는, 5시간 추격 간격 17 이후에 발견되었다. 우리의 분석은 또한 cytosol에 독소의 translocation의 억제 (그림 5) 검색할 수 있습니다. 세포 10 % 디메틸 sulfoxide (DMSO), 열 disord을 방지하는 화학 보호자로 치료격리 CTA1 subunit (T. Banerjee와 K. Teter, 관찰되지 않은)의 ering, 치료 제어 세포에 비해 cytosolic CTA1의 낮은 수준을 전시. 독소의 전개 체인은 cytosol 16-18로 translocation을위한 필수 조건이다, CTA1의 DMSO 유발 안정화가 따라 응급실에서 cytosol하기 위해 운동을 방해하므로. SPR 실험에서 계산 협회 속도 상수 (K)는 재관류 버퍼 14, 15, 26 리간드의 농도에 직접 비례합니다. 그러므로, 그것은 그래프에서 cytosolic 독소의 농도를 결정하기 위해 가능한 것을 플롯 K 독소 농도의 함수로 독소 표준 값. 이 절차는 그림 5에 제시 독소의 translocation의 DMSO 유도 블록을 계량하는 데 사용되었습니다 독소 알려진 농도에서 생성된 표준 곡선은 cytosolic CTA1 concentrat를 계산하는 데 사용되었다의 이온 0.3 치료 세포와 DMSO - 대우 전지 0.1 NG / ML (그림 6) NG / ML. DMSO에 의해 전개 CTA1의 억제 따라서 CTA1의 ER - 투 - cytosol translocation의 3 배 감소 생성. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> 그림 1. 프로토콜 개요. (A) 세포 4 AB 독소와 incubated 아르 ° C, 세포 표면에 독소가 구속 수 있지만 독소의 endocytosis을 방지하는 온도. 독소 A와 B subunits는 각각 빨간색과 파란색 동그라미로 표시됩니다. (B) 언바운드 독소가 미디어에서 제거하고, 세포 ° C 응급실에 holotoxin의 endocytosis와 역행 수송을 촉진하기 위해 37 기까지입니다. Holotoxin 분리는 절연 체인 ER 막에 단백질 실시 채널 (S)를 통해 전달하여 cytosol를 입력할 수 응급실에서 발생합니다. (C) 세포 선택적으로 플라즈마를 permeabilize하기 위해 digitonin로 취급됩니다막. (D) 원심 분리는 별도의 cytosolic 및 organelle 분수로 파티션 세포를하는 데 사용됩니다. cytosol은 digitonin 생성 모공을 통해 세포 밖으로 압착하여 뜨는에 위치하고 있습니다. 그대로, 멤브레인 바인딩된 organelles은 펠렛 분획에서 발견됩니다. (E) 호스트 cytosol에서 독소 체인의 translocated 수영장를 검색하려면, 뜨는 분수는 안티 - 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> 그림 2. 호스트 cytosol에 PTS1 translocation의 감지. CHO 세포되었습니다 펄스 분류 4 ° 1 μg / 태평양 표준시의 ML 30 분 C. 세포는 다음 37 3 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic fracti로 파티션 세포 추출물에 사용된기능. 안티 PTS1 항체로 코팅된 SPR 센서는 치료 또는 BfA - 처리 세포에서 PTS1의 cytosolic 수영장를 검색하는 데 사용되었다. unintoxicated 세포에서 cytosolic 분율이 대조군으로 센서 슬라이드를 통해 perfused 동안 PTS1 기준은, 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> 그림 3. 호스트 cytosol에 CTA1 translocation의 감지. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 5​​ μg BfA / ML을 (+ BfA 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. digitonin와 플라즈마 막의 Permeabilization은 별도의 organelle과 cytosolic 분수로 파티션 세포 추출물로 사용되었습니다. (A) cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. 알려진unintoxicated 세포의 cytosol가 대조군으로 사용하는 동안 CTA의 수량은 긍정적인 컨트롤로 사용되었습니다. (B) BfA의 부재에서 술에 취한 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTB 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused되었습니다. 정화 CTB pentamer은 긍정적인 제어로 슬라이드를 통해 perfused되었습니다. (C) organelle 분율이 함께 solubilized했습니다 1% 트리톤 X - 100 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 재관류 전에. 비교 목적을 위해, 동일한 세포 추출물 및 CTA 표준에서 cytosolic 분수 (1 ML 최종 볼륨)도 센서를 통해 perfused했다. 모든 패널, 행 예제는 각 실행의 끝에 센서에서 뺏겼어요. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> 그림 4. cytosol에 CTA1 항목의 속도론. HELA 세포 펄스 표시 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML과 C 15, 30, 45 추격, 또는 37 60 분되었습니다 ° C 독소 무료 mediu 4시M. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 표준뿐만 아니라 센서를 통해 perfused했다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> 그림 5. DMSO에 의해 CTA1 translocation의 억제. HELA 세포 펄스 분류 4 ° 1 μg / 중부 표준시의 ML와 C가 37 2 시간에 대한 추격했다 더 추가 (음주) 또는 10% DMSO를 (+ DMSO 음주) 포함하지 ° C에서 독소 무료 매체. 독소의 translocated 수영장를 검색하려면 digitonin - permeabilized 세포에서 cytosolic 분수는 안티 CTA 항체로 코팅된 SPR 센서를 통해 perfused했다. CTA 기준은 (100, 10, 1, 0.1 NG / ML) 긍정적인 컨트롤로 센서를 통해 perfused 있었다, 오직 1과 0.1 NG / ML 표준 확장 목적으로 표시됩니다. unintoxicate에서 cytosolD 세포는 대조군으로 사용되었다. 각 실행의 끝에 행 예제는 센서 슬라이드에서 뺏겼어요. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> 그림 6. cytosolic CTA1의 계산. 그림 5에서 CTA 표준 값 K 독소 농도의 함수로 꾸몄다되었습니다. 그 결과 표준 곡선은 K에 따라 결정하는 데 사용되었다 그림 5, 치료 및 DMSO - 처리 세포에서 cytosolic CTA1의 농도에서 실험 샘플의 값. 치료 cytosol은 열린 광장으로 제시되며, 독소 기준은 채워진 동그라미로 표시되며 DMSO - 대우 cytosol은 오픈 원으로 제공됩니다. 평균 ± 범위 두 개의 독립적인 실험이 표시됩니다.

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

기존의 방법론 비교 우리 SPR 기반 translocation 분석은 호스트 cytosol에 독소 전송을 감지하는 빠른, 민감한, 그리고 양적 방법을 나타냅니다. 기술 radiolabeling이나 독소에 다른 수정을 요구하지 않으며, 그것은 체인 항체를 사용할 수있는 해독제에 대한 독소를 적용할 수 있습니다. cytosol에 독소 통로를 모니터링하는 기존 방법은 별도의 cytosol과 막 분수 11, 23, 27, 28으로 파?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> 시그마 </td><td> D141 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> 시그마 </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> 시그마 </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> 목록 </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N - Hydroxysuccinimide) </td><td> 찌르다 </td><td> 24,500 </td></tr><tr><td> EDC (1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide) </td><td> 써모 과학 </td><td> 22,981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> 시GMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> 안티 CTA 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td> 안티 CTB 항체 </td><td> Calbiochem </td><td> 227,040 </td></tr><tr><td> 안티 PTS1 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR 센서는 슬라이드 </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 콜 팔머 </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB의 독소 subunit 효소와 세포 결합의 B subunit 1로 구성되어 있습니다. 이러한 독소는 세포 환경으로 분비하지만, 그들은 진핵세포 cytosol 내의 대상에 따라 행동하고 있습니다. 세포 표면에서 cytosol 2-4 들어가기 전에 endoplasmic reticulum (ER)에 소포 항공사에 의해 일부 AB 독소 여행. 응급실에서 독소와 이동의 나머지 부분에서 단백질 실시 채널을 통해 촉매 체인 dissociates은 cytosolic 목표 5에 도달합니다. 응급실에 독소 거래가 매우 비효율적 프로세스이기 때문에 translocated, cytosolic 체인은 감지하기가 어렵습니다 : 대부분의 내면 독소는 잠돌군 Zz 장치 및 ER 6에 도달 표면 바운드 독소의 작은 파편 때문에 전용 저하에 대한 lysosomes로 라우팅됩니다 -12. 응급실에서 교양 세포의 cytosol에 독소의 translocation을 모니터하기 위해, 우리는 highl과 subcellular 분획화 프로토콜을 결합표면 plasmon 공명 (SPR) 13-15의 Y 민감한 검출 방법. 독소 - 치료 세포의 플라즈마 막은 선택 후 해독제 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused하는 cytosolic 분수의 컬렉션을 수 있도록 digitonin와 permeabilized 있습니다. 항체 - 코팅 센서 cytosolic 독소의 PG / ML 수량을 캡처하여 검색할 수 있습니다. 이 프로토콜로, 그것은 cytosol에 독소 항목의 속도론를 수행하고 translocation 이벤트에 대한 억제 효과를 특성화 수 있습니다. cytosolic 독소의 농도는 또한 센서를 통해 perfused되었습니다 체인 표준의 알려진 수량과 생성된 표준 곡선으로부터 계산하실 수 있습니다. 우리의 방법은 radiolabeling 또는 대상 독소 다른 수정을 요구하지 않는 빠른, 민감한, 그리고 양적 탐지 시스템을 나타냅니다.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K 조회수.  University of Central Florida. 이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

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A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

연구

화학

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

생화학

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.

A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.

단백질 분석을위한 지속적인 인식 패턴을 생성하는 전자 혀

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

생체공학

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

신경과학

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

면역학 및 감염병학

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

생물학

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance (SPR) Technology

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining blood types, and detecting food adulteration, among other biomolecular detections. This technology allows for the rapid identification of potential binding between biomolecules, facilitating fast and user-friendly, non-invasive screening of various indicators without the need for labeling. Additionally, SPR technology facilitates real-time detection for high-throughput drug screening. In this program, the application field and basic principles of SPR technology are briefly introduced. The operation process is outlined in detail, starting with instrument calibration and basic system operation, followed by ligand capture and multi-cycle analysis of the analyte. The real-time curve and experimental results of binding quercetin and calycosin to KCNJ2 protein were elaborated upon. Overall, SPR technology provides a highly specific, simple, sensitive, and rapid method for drug screening, real-time detection of related pharmacokinetics, virus detection, and environmental and food safety identification.

Real-Time Detection of Dynamic Affinity between Biomolecules Using Surface Plasmon Resonance SPR Technology

The present study aims to elucidate the principle and methodology of surface plasmon resonance (SPR) technology, which finds versatile applications across multiple domains. This article describes SPR technology, its operational simplicity, and its remarkable efficacy, with the goal of fostering broader awareness and adoption of this technology among readers.

Surface plasmon resonance (SPR) technology is a sensitive precise method for detecting viruses, pathogenic molecular proteins, and receptors, determining ...

의학

Surface Plasmon Resonance (SPR)

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration of biomolecules. In SPR, biomolecular interactions occur on a biosensor made of a thin layer of metal on a prism. Real-time interactions of biomolecules can be monitored by measuring the changes of light reflected off the underside of the metal.
This video describes the basic concepts of SPR and how it is used to analyze and visualize biomolecular interactions. This is followed by a sample preparation and experimental protocol for investigating binding rates using SPR. In the applications section, SPR imaging, localized SPR, and quantum dot enhanced SPR are explored.
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Surface plasmon resonance, or SPR, is the underlying phenomenon behind certain label-free biosensors for evaluating binding and adsorption interactions of biomolecules. Binding assays that require labeling, such as ELISA, can be a time-consuming process, and may alter the functionality of the analyte. In SPR, biomolecular interactions occur on a special sensor made of a thin layer of metal on one face of a prism. By monitoring the changes in light reflected off of the underside of the metal, SPR instruments visualize these interactions in real-time without the use of labels. This video will introduce the principles of SPR, a general procedure for SPR imaging, and some applications of in biochemistry.
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An SPR sensor is usually made of a thin layer of a noble metal atop the face of a prism. To take readings from the sensor, light is reflected off of the prism-metal interface into a photodetector. The reflected light will have a high intensity except at a certain angle, related to the electronic properties of the metal surface, known as the &#34;surface plasmon resonance angle&#34;.
As molecules bind to the surface, the electronic properties of the metal change, which in turn adjusts the angle. As new proteins attach, forming complexes, the angle will shift further. By measuring relative changes in the SPR angle, interactions like these can be monitored in real-time.
Another technique called localized, or &#34;L&#34;SPR, uses metal nanoparticles as the sensor surface. The properties that affect the SPR angle are highly localized to each nanoparticle, which improves sensitivity and signal resolution.
When investigating binding interactions with standard SPR, the sensor is generally mounted in a platform that becomes the floor of a flow cell in the instrument. The biomolecules of interest are carried through the flow cell by buffer solution. The sensor surface is often first coated with a substrate that has a high affinity for the metal. This ensures that a significant amount of ligand, which in turn binds to the analyte of interest, will be immobilized onto the sensor and reduces the likelihood that the ligand will dissociate during the procedure.
Once the ligand is immobilized on the sensor, the analyte is flowed over the sensor in buffer. By monitoring the change in the SPR angle over time as the analyte binds to the ligand, the binding rate and other kinetic information can be calculated.
The reflectance data can also be used for SPR imaging, or SPRi, by directing the reflected light to a CCD detector. This produces a high-contrast, high-resolution image of the entire sensor surface. Using SPR and the related techniques, questions can be answered about molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration.
Now that you understand what is being measured in an SPR experiment, let&#39;s look at a procedure for investigating binding rates.
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Before beginning the procedure, the running and sample buffers must be prepared. The running buffer is used to deposit the ligand onto the sensor, and the sample buffer is used to deposit the analyte. The sensor chip is carefully cleaned and loaded into a sheath. Then, the device is placed into the instrument, where it becomes the bottom of the flow cell. The instrument software is set up for the experiment and subsequent analysis. If necessary, the sensor surface is primed with a substrate to capture the ligand. The ligand is flowed over the sensor surface in the running buffer, where it is captured by the substrate on the sensor surface.
Then, the analyte in the sample buffer is run through the flow cell, where it selectively binds to the immobilized ligand. The change in reflectance is plotted and compared against controls to determine rate constants and other reaction kinetics data for the investigated reaction.
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Now that you understand how an SPR experiment is performed, let&#39;s look at a few other applications of SPR in biochemistry.
Here, SPR imaging was used to evaluate proteins with an array of eleven receptors on a sensor. 3D graphs of reflectivity versus time and receptor concentration were prepared from the reflectivity data for each protein. These &#34;profiles&#34; are characteristic to each protein, and thus could subsequently be used for protein identification.
In this experiment, cell secretions were studied using a custom-made LSPR sensor. The sensor was also compatible with SPRi and fluorescence microscopy. Upon depositing the cell on the sensor, the interaction of cell secretions with the nanoparticle array could be measured with high spatial resolution.
Here, the use of quantum dots, nanoscale semiconductors, as an SPR signal enhancement agent mixed with the analyte was investigated. This enhanced &#34;nano-SPRi&#34; method was compared to assays by standard SPRi and the ELISA method. The nano-SPRi method significantly improved the sensitivity and limit of detection while still being less time-consuming than the ELISA method.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on surface plasmon resonance. This phenomenon is used to monitor and image biomolecular interactions without the use of labels. This video introduced the principles of SPR, a typical protocol for performing an SPR experiment, and a few applications of SPR in biochemistry.
Thanks for watching!
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Surface Plasmon Resonance SPR: Label-Free Detection

표면 플라스몬 공명 (SPR)

Surface plasmon resonance (SPR) is the underlying optical phenomenon behind label-free biosensors to evaluate the molecular affinity, kinetics, ...

교육

JoVE Science Education

Surface Plasmon Resonance to Study Biomolecular Interactions Using a Sensor Chip

Source: Maier, I. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63541">Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or SPR, technique for studying the interaction between two molecules using a sensor chip. The change in resonance angle and the intensity of the reflected light are detected as a function of the association and dissociation of two molecules, and this provides information about the interactions between the two molecules.

센서 칩을 사용한 생체 분자 상호 작용을 연구하기 위한 표면 플라즈몬 공명

Source: Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (2022)
This video describes the surface plasmon resonance, or ...