이 작품은 건강 R01 CA131990 (BFS 및 RRM)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 라이브 세포 이미징은 Karmanos 암 연구소, 웨인 주립 대학 및 아동 건강 및 개발 국립 연구소의 Perinatology 조사 지점에 의해 NIH 센터 보조금 P30 CA22453 의해 일부 지원 현미경, 이미징 및 Cytometry 자원 코어에서 수행되었다 , 웨인 주립 대학교.

1. 아이스크림 - 기판을 준비한다 <ol><li> 허용 아이스크림 - 기판은 4 ° C.에 50 μl aliquots 및 매장으로, 탈이온수에서 아이스크림-기판의 1 밀리그램 / ML의 재고 솔루션을 준비 열기 튜브 전에 실내 온도에 격차 따뜻하게 동결 건조된 </li></ol> 그것은 ~ 50-5 분, 열이 ° C 분산을 촉진하기위한 초음파 중탕 냄비에서 아이스크림 - 기판을 선동하는 데 필요할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 4에 하룻밤 얼음 해동의 rBM는 ° C; rBM 항상 얼음 다루어 져야합니다. </li><li> 10X 인산염을 만들려면 염분이 (PBS), 80g NaCl을 용해 (1.37 M), 2g KCl (0.027 M), 14.4 g 나 2 HPO 4 (1 M) 및 2.4 g KH 2 PO 4 (0.02 M)에서는 버퍼 800 ML의 ultrapure 물. 1.0 M HCL과 7.4로 PBS 버퍼 용액의 산도를 조정합니다. 볼륨 1리터에 지참, 여과하여 멸균. </li><li> 냉장 콜라겐 전 냉장 10X PBS 1 일부로 8 부품 : 얼음 콜라겐 전 솔루션을 준비합니다. 산도를 조절혼합물의 멸균 0.1 M NaOH를 사용하여 7.2-7.6 있습니다. 산도 스트립과 산도를 확인하고 멸균 물로 10 부분에 최종 볼륨을 조정합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 2.4 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브에 콜라겐 전 용액에 아이스크림 - 콜라겐 봐도 diluting하여 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 전을 준비합니다. </li><li> 각각, 25 μg / ML 및 12-15 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브 rBM에서 아이스크림 - 콜라겐 IV를 (Cultrex 혹은 Matrigel) diluting에 의해 재구성 지하 막 (rBM) 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 IV를 준비합니다. 거품을 만드는 피하기 위해 부드러운 pipetting을 사용하여 얼음에 섞는다. </li></ol> 2. MAME cocultures 준비 cocultures의 개략도 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 장소 35 mm 배양 접시 또는 IbiTreat μ-요리 35-mm를 사용하여이 사각형 플라스틱 coverslips (10 분, 공기 건조를 위해 70 % 알코올로 소독). 여기 오시는 길 우리가 스튜에 사용하는 coverslips 및 μ-요리 모두를위한직립 현미경에 죽는다. 거꾸로 현미경에 대한 연구를 위해, 우리는 μ-접시를 사용합니다. </li><li> 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 I과 섬유아 세포의 원하는 번호를 섞는다. 콜라겐 나는 매트릭스 : 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해서는 미디어의 10 μl 플러스 아이스크림 - 콜라겐 전 60 μl 500 섬유아 세포를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 피펫은 100 μl micropipettor를 사용하고 fibroblast의 70 μl 확산 : 아이스크림 - 콜라겐 I : 콜라겐 I 행렬 각 coverslip의 전체 표면 이상 고체화하기 위해 30 분 동안 CO 2없이 humidified 배양기에서 37 ° C에서 떠나야합니다. </li><li> 양도 35-mm 평형하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. </li><li> 인큐베이터에서 제거하고 그들이 실내 온도에 올 때까지 후드를 35-mm 요리를 둡니다. </li><li> 경화 아이스크림 - 콜라겐 제가 위에 rBM 매트릭스 : 임베디드 섬유아 세포와 콜라겐 I 행렬 아이스크림 - 콜라겐 IV의 60 μl를 추가합니다. 피펫 팁, CA와아이스크림 - 콜라겐 나 : 저는 콜라겐 매트릭스 fibroblast를 긁적 피하 골고루 rBM 매트릭스 : refully 아이스크림 - 콜라겐 IV 뿌리 더군요. </li><li> 양도 35-mm 고체화하는 10 분 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. 아이스크림 - 콜라겐 IV 동안 rBM 행렬이 응고되어 trypsinize과 상피 세포를 계산합니다. </li><li> rBM 매트릭스 : coverslips 향해 상피 / 종양 세포 현탁액의 장소 50 μl는 아이스크림 - 콜라겐 IV와 코팅. 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 장소 35-mm 요리. rBM 매트릭스 : 전지 40-60 분 아이스크림 - 콜라겐 IV에 연결하도록 허용합니다. 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해 2500 상피 또는 종양 세포를 사용합니다. </li><li> 각각 35 mm 접시에 2 % rBM를 포함하는 배지 2 ML을 추가합니다. 어떠한 약물 치료를하는 경우, 약물이 시간에 추가되어야합니다. </li><li> 이미징 전에 시간 원하는 기간 동안 품어. 장기 배양의 경우, 미디어마다 3~4일 변경해야합니다. 세포 유지하실 수 있습니다그들의 정상적인 문화 매체 인치 유방암 세포 라인 MAME cocultures 위해 MEGM의 SingleQuots로 보충 상피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간에 (MEBM-PRF)을 사용합니다. </li></ol> 3. 공촛점 현미경으로 살아있는 MAME cocultures의 4D (3D + 시간) 이미징을 수행 <ol><li> 그림 증명 주요 연구 내용은 MAME cocultures 우리의 출판 절차 1에 따라 형광 셀 추적 염료로 분류했다. 이미징 전에 5% CO 2 배양기와 37 ° C에서 PBS로 세척 후 cocultures는 37 ° C 배양기에서 45 분 동안 MEGM 매체에 5 μm의 제품 CellTracker의 오렌지와 incubated했다 PBS로 다시 씻어 30 분 prewarmed MEGMmedium 함께 incubated . </li><li> 이미지 MAME cocultures은 자이스 혈구 LSM-510 메타 공촛점 현미경의 낮은 배율 (10X, 물 마른 렌즈)에 살고 있습니다. </li><li> 광학 부분은 구조의 전체 깊이에 걸쳐 간격으로 캡처됩니다. 우리의 연구에 대해서는 10 광학 부분을 캡처μm의 간격. </li><li> 3D의 이미지를 재구성하기 위해 광학 섹션을 사용합니다. 우리는 3 차원 reconstructions를 생성합니다 Volocity 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 세포 상호 작용과 그 주변 매트릭스와 상호 작용을 시각이 될 수있다 : 구조, 세포 있도록 3D reconstructions의 동영상을 확인하십시오. 우리는 QuikTime 플레이어 7에서 영화를했다. </li></ol> 4. 대표 결과 우리가 개발한 MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 취급하기 쉬운 실험 모델입니다. 여기에 휴대폰 요점을 되풀이하는 MAME 모델의 기능을 설명 : 유방암의 진행 중에, 라이브 세포 이미징의 세포 상호 작용은 시간이 지남에 따라 이러한 상호 작용을 수행합니다. 우리는 이상, preinvasive MCF10.DCIS 인간 유방암 세포주와 인간의 유방 암 관련 fibroblast 라인, WS-12Ti 사이의 이미지 상호 작용에 대한 능력을 보여주는문화의 3 주 이상의 기간. cocultures 3, 16, 23 일 정도 몇 군데 있었다. cocultures의 전체 볼륨을 통해 광학 부분은 그림 2에서 세 timepoints 각각에 대해 표시됩니다 3D 및 대표 예제 년에 복원되었다. 그림 2의 붉은 형광은 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포를 나타냅니다. 두 세포 유형 간의 장기 cocultures에 대한 차별하기 위해, 하나는 문화를 확립하기 전에 형광 단백질에 각각의 셀 유형을 transfect 또는 transduce 수 있습니다. differentially 식별을위한 형광 단백질로 분류되어 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포의 MAME의 coculture는 그림 3과 그림한다. 통합 기판으로,이 경우 아이스크림 - 콜라겐에 MAME cocultures로, 우리는 침략 표현형으로의 전환과 관련된 proteolysis의 시간이지나면서 변화를 평가하고 계량하실 수 있습니다. 우리는 형광 절단 제품을 quantifying위한 메소드를 설립했습니다 그 결과아이스크림 - 콜라겐 저하 2,3에서. 우리는 레이블링 및 세포 핵을 세어 당 셀 단위로 MAME cocultures의 전체 3D 볼륨에 걸쳐 저하 제품을 정상화. 더욱이, 우리는 세포와 세포 내 구획에 저하를 집중하고 우리가 이전에이 설명한 것처럼 총 세포내 및 세포외 저하 제품을 계량하실 수 있습니다. 그림 2와 3의 녹색 형광은 두 개의 아이스크림 - 콜라겐 기판 절단 제품을 나타냅니다. 이때 differentially-라벨이 콜라겐은 우리가 유형 나 콜라겐 유형 IV는 콜라겐과 열화의 저하를 구분할 수 있겠 사용할 수 없습니다. MAME cocultures의 상호 작용은 동적이고 시간이 지남에 따라 변경할 수 있습니다. 현세와 동적 정보를 얻으려면,보기 같은 분야는 주 분부터 일정 기간 동안 반복해서 볼륨의 전체 표본을 통해 찍은 몇 군데와 광학 섹션 수따라서 4-D에 데이터를 수집. 그림 2에서는 23 일 동안에 발생할 오히려 극적인 변화를 보여주는 : 휴대폰 번호의 변화, 세포 마이 그 레이션 및 세포 상호 작용, 구조 볼륨, 구조 모양, 구형의 구조의 편차, 침략 outgrowths과 proteolysis합니다. 또한, 우리는 또한 인한 MAME cocultures로 볼륨의 전반적인 변화를 보여주는 굴욕적인 그들의이 기간 동안 세포외 기질을 둘러싼. 그림 2A에서 그림과 같이 삼일에서 볼륨 110000 μm의 3. 반면, 16 23일에서 MAME cocultures의 볼륨은 그림 2B와 C로 그림에만 46250 μm의 3입니다 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" /> 1 그림. MAME cocultures.의 개략도는 플라스틱 coverslip는 아이스크림 - 콜라겐 I 및 섬유아 세포 (마젠타)를 포함하는, 콜라겐 나는 코팅됩니다. 아이스크림 - 열을 포함하는 재구성 지하 막의 두번째 레이어 (rBM)lagen IV가 추가됩니다. 종양 세포 (적색)은 위에 도금과 문화 미디어의 2 % rBM는 오버레이 (흰색 도트) 미디어의 모든 변화가있는가 있습니다. 녹색은 아이스크림 - 콜라겐 I와 IV의 형광 절단 제품을 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" /> 그림 2. MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 MAME cocultures. 섬유아 세포는 콜라겐 아이스크림 - 콜라겐 IV를 포함 rBM와 I / 아이스크림 - 콜라겐 I 및 오버레이에 박혀 있었다. DCIS 세포 그런 다음 2 % rBM을 포함 매체와 rBM 및 오버레이에 놓는되었다. cocultures의 볼륨의 감소에 표시된대로 여기에 그림 coculture에서 23 일 동안 세포 증식, 아이스크림 - 콜라겐 IV와 (녹색)과 콜라겐 매트릭스의 저하가 발생했습니다. 세포 이미징 (적색)하기 전에 원래의 장소에 CellTracker의 오렌지와 레이블링에 의해 현지되었다. 같은 라이브 cocultures는 C로 촬영한 이미지를 23 일 동안 관찰되었다coculture 3, 16, 23 일 정도 onfocal 현미경. 그 결과 광학 조각은 Volocity 소프트웨어로 3D 년에 복원되었다. 배율, 10X. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" /> 그림 3. MAME 16일의 MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 cocultures 그 각각 명시 RFP (적색)와 YFP (흰색). Cocultures 설립과 그림 2에서와 같이 분석했다. 여기에 표시된 두 세포 유형은 그러나 differentially 그들은 서로 구분할 수 있도록 분류 하였다. 이 그림에서 높은 배율 이미지, 그림 2에서 이들에 비해, DCIS 세포 및 섬유아 세포 근처 분야에서 아이스크림 - 콜라겐 내의 확산 proteolysis의 표면에서 아이스크림 - 콜라겐 IV의 proteolysis를 보여줍니다. 배율, 20X.

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	<li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteolysis:+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis.">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protease+activity+in+living+cells:+from+two+dimensions+to+four+dimensions.">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li><li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ.">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells.">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li><li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer.">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis.">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li><li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix.">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li><li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microvasculature+and+microenvironment:+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models.">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

보여준 바와 같이, MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징에 사용될 수 있습니다. 저희 연구실에서는 지속적인 연구에서 우리는 proteolytic DCIS의 침략 ductal 암종으로의 전환과 연관된 경로뿐만 아니라 같은 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자의 통로로서 이런 변화에 참여 proteolytic 경로와 다른 경로 간의 상호 작용을 확인?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 재구성 지하 막 (Cultrex) </td><td> Trevigen </td><td> 3445-005-01 </td><td> Matrigel (BD Biosciences)과 비교 </td></tr><tr><td> 콜라겐 전 </td><td> 응집 연구소 </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> 아이스크림 - 기판 (콜라겐 I, IV) </td><td> Invitrogen </td><td> 아이스크림 - 열 I-D12060 아이스크림 - 열 IV D12052 </td><td></td></tr><tr><td> 22-mm 플라스틱 coverslips </td><td> 피셔 과학 (주) </td><td> 12-547 </td><td> 10 분하고 사용 전 공기 건조를 위해 70 %의 에탄올에두고 반으로 잘라. </td></tr><tr><td> 세포 배양 배지 </td><td> Lonza </td><td> MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 </td><td> 붉은 무료로 페놀 </td></tr><tr><td> μ-접시를 ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80,136 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> 버전 5.5 </td><td> 이미징 소프트웨어의 다른 브랜드는 3D reconstructions 및 동영상을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. </td></tr></tbody></table>

mame models for 4d live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression

세포 상호 작용 : 우리는 용어 MAME (M ammary rchitecture 및 M icroenvironment 전자 ngineering), 그리고이 세포의 실시간 라이브 세포 이미징을 위해 그들을 이용하는 3D coculture 모델을 개발했습니다. 우리의 전반적인 목표는 침입 표현형 자신의 진행을 공부하는 preinvasive 유방 병변의 구조를 요점을 되풀이 모델을 개발하는 것이었습니다. 특히, 우리는 침략 ductal carcinomas에 preinvasive 유방 상피 세포의 진행을 강화하거나 감소에 연루되어 종양 microenvironment의 사전 악성 유방 상피 세포 변형 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 분석하는 모델을 개발했습니다. 다른 세포 유형의 최신 연구는 myoepithelial 세포, 섬유아 세포, macrophages과 혈액 및 림프의 microvascular 내피 세포 수 있습니다. 동안 유방 내에서 세포 상호 작용 요점을 되풀이하도록 설계되었습니다 MAME 모델 외에도암 진행, 우리는 전립선 암의 진행에 대해 비교 가능한 모델을 개발했습니다. 여기에서 라이브 세포 이미징 및 현장에서 유방 ductal 암종 (DCIS) 시간이 지남에 침입 표현형에 대한 세포 및 섬유아 세포의 cocultures의 전환을 수행하는 기능 proteolysis 분석의 사용과 함께 3D cocultures 설립을위한 절차를 설명 문화 이십삼일 이상이 경우. MAME cocultures은 여러 개의 레이어로 구성되어 있습니다. 섬유아 세포는 종류 나 콜라겐의 맨 아래 레이어에 포함됩니다. 그 문제는 DCIS 세포가 놓는이되는 재구성 지하 막 (rBM)의 레이어를 배치됩니다. 2 % rBM의 최종 상위 계층이 포함되어 있으며 미디어의 모든 변화 보충함있다. 침입 표현형에 진행과 관련된 영상 proteolysis에, 우리는 (아이스크림) 염료 침묵 형광등 매트릭스 단백질 (아이스크림 - 콜라겐 나 RB의 중간 계층과 혼합 콜라겐 I과 아이스크림 - 콜라겐 IV의 레이어와 혼합을 사​​용하여M)하고 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 문화를 관찰합니다. 광학 부분은 캡처 처리 및 Volocity 시각화 소프트웨어와 3D 년에 복원되었습니다. MAME cocultures 23 일 과정 동안, DCIS 전지는 분아 따위에 의해 중식 대형 침략 구조로 뭉쳤다. 섬유아 세포는 마이 그 레이션하고 이러한 침략적 구조에 포함된다. 콜라겐의 형광등 proteolytic 조각 DCIS 구조의 표면으로 협회에서 발견되며, intracellularly, 또한 주변의 매트릭스에 걸쳐 분산. 대상 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로 또는 cocultures의 세포 성분의 개조가 MAME 모델 소설 치료적 접근에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수있는 제안, invasiveness을 줄일 수있는 약물.

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MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

mame-models-for-4d-live-cell-imaging-tumor-microenvironment

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

14.4K 조회수.  Wayne State University. 우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

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Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

연구

의학

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, depending on the cancer type. To reduce the brain metastatic tumor burden, gaps in basic and translational knowledge need to be addressed. Major challenges include a paucity of reproducible preclinical models and associated tools. Three-dimensional models of brain metastasis can yield the relevant molecular and phenotypic data used to address these needs when combined with dedicated analysis tools. Moreover, compared to murine models, organ-on-a-chip models of patient tumor cells traversing the blood brain barrier into the brain microenvironment generate results rapidly and are more interpretable with quantitative methods, thus amenable to high throughput testing. Here we describe and demonstrate the use of a novel 3D microfluidic blood brain niche (&#181;mBBN) platform where multiple elements of the niche can be cultured for an extended period (several days), fluorescently imaged by confocal microscopy, and the images reconstructed using an innovative confocal tomography technique; all aimed to understand the development of micro-metastasis and changes to the tumor micro-environment (TME) in a repeatable and quantitative manner. We demonstrate how to fabricate, seed, image, and analyze the cancer cells and TME cellular and humoral components, using this platform. Moreover, we show how artificial intelligence (AI) is used to identify the intrinsic phenotypic differences of cancer cells that are capable of transit through a model &#181;mBBN and to assign them an objective index of brain metastatic potential. The data sets generated by this method can be used to answer basic and translational questions about metastasis, the efficacy of therapeutic strategies, and the role of the TME in both.

Here, we present a protocol for preparing and culturing a blood brain barrier metastatic tumor micro-environment and then quantifying its state using confocal imaging and artificial intelligence (machine learning).

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

암 연구학

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using three-dimensional (3D) cell-based invasion and migration assays. In this study, we have optimized these 3D assays for live-cell immunocytochemistry. An Antibody Labeling Reagent was used to detect in real-time the expression of the adhesion molecule CD44, on the plasma membrane of migrating and invading cells of a DMG H3K27M primary patient-derived cell line. CD44 is associated with cancer stem cell phenotype and tumor cell migration and invasion and is involved in the direct interactions with the central nervous system (CNS) extracellular matrix. Neurospheres (NS) from the DMG H3K27M cell line were embedded into the basal membrane matrix (BMM) or placed onto a thin coating layer of BMM, in the presence of an anti-CD44 antibody in conjunction with the antibody labeling reagent (ALR). The live-3D-cell immunocytochemistry image analysis was performed on a live-cell analysis instrument to quantitatively measure the overall CD44 expression, specifically on the migrating and invading cells. The method also allows visualizing in real-time the intermittent expression of CD44 on the plasma membrane of migrating and invading cells. Moreover, the assay also provided new insights into the potential role of CD44 in the mesenchymal to amoeboid transition in DMG H3K27M cells.

This study presents a protocol of live-3D-cell immunocytochemistry applied to a pediatric diffuse midline glioma cell line, useful to study in real-time the expression of proteins on the plasma membrane during dynamic processes like 3D cell invasion and migration.

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

면역학 및 감염병학

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, where success depends on the distribution of specific immune cell subpopulations. Over the past decade, multiple sophisticated technologies have been introduced to achieve detailed resolution of the TME using two-dimensional sections from either formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) or fixed-frozen tissues. While these thin sections are easier to procure and analyze, they lack the three-dimensional architecture needed to reliably and comprehensively characterize a tumor. To address this limitation, a tissue mounting and imaging technique was developed to enable the three-dimensional analysis of tumor lesions in their native in vivo state. This protocol outlines the procurement of human tumor tissue, the mounting of samples on custom-printed platforms, and staining procedures for post-fixation samples. The multiplexed immunofluorescence technique, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), was adapted to characterize the three-dimensional TME with up to 15 markers for tumor, immune, and stromal cells using commercially available antibodies. Imaging depths of up to 100 &#181;m were achieved using an inverted white-light laser confocal microscope with a custom-printed imaging adaptor and commercial glass-bottom dishes to ensure optimal tissue orientation. This protocol highlights the potential of the IBEX method to expand multiplexed immunofluorescence studies, providing a more comprehensive understanding of TME composition.

This article describes a protocol for multiplex immunofluorescence optimized to characterize the three-dimensional architecture of peritoneal metastases.

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

요약

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모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

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장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

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