乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

私の研究室での研究は、乳がん患者の筋肉疲労を促進する根本的なメカニズムを理解することに焦点を当てています。具体的には、乳房組織に局在する腫瘍と末梢骨格筋との間のコミュニケーション、そしてその筋肉内で疲労につながる分子応答を理解したいと考えています。3D細胞培養モデルの開発により、筋肉疲労などの機能的応答を制御された条件下で研究できるハイスループット研究が可能になりました。

機能的な細胞培養実験は並行して行うことができ、同等の動物モデルよりも短時間で済むため、迅速な発見とイノベーションが容易になります。従来の患者由来の異種移植モデルを使用して関連する機能表現型を評価するには、時間とリソースを大量に消費します。このプロトコルは、マウスへのPDXの同時注射を容易にし、研究者は高検出力の動物実験を使用してヒト腫瘍に対する全身反応を研究することができます。

このプロトコルにより、患者由来の乳房腫瘍細胞の同所性注射が既存の方法よりも改善されたスケールで可能になり、1人の研究者による1日あたり最大数十匹のマウスの迅速な注射が容易になります。さらに、腫瘍の解離は、動物間で細胞タイプを均等に分布させる均質な細胞懸濁液を生成します。私の研究室のデータでは、PDXマウスとヒトのがん患者において、乳がんに対する筋分子応答が類似していることが確認されています。

そこで、この前臨床マウスモデルを用いて、乳がん患者の疲労軽減につながる可能性のある候補薬のスクリーニングや治療法の同定につなげたいと考えています。まず、ヒト腫瘍解離キットの酵素H、R、Aを解凍します。200マイクロリットルの酵素H、100マイクロリットルの酵素R、および25マイクロリットルの酵素Aを滅菌チューブC.Cチューブに4.7ミリリットルの滅菌RPMI 1640培地を追加して、最終容量を約5ミリリットルに調整します。

次に、解凍した腫瘍片とそれに付随する凍結培地を、滅菌済みの100mm培養皿の半分に移します。滅菌鉗子を使用して、腫瘍片を滅菌済みの5ミリリットルのマイクロチューブに移し、1〜3ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。滅菌鉗子を使用して、消毒した断片を新しい5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

滅菌PBSで2回目の洗浄を行った後、断片を100mm培養皿の乾燥した半分に移します。滅菌済みの10番メスの刃を2枚使用して、腫瘍組織を完全にミンチにします。細かく刻んだ腫瘍片を1枚のブレードに移し、調製した酵素溶液を含むCチューブに沈着させます。

Cチューブを数回反転させて、酵素溶液内の腫瘍断片が均一に分布するようにします。次に、Cチューブを機械式解離器に入れ、チューブを反転させて、すべての内容物が媒体に沈んでいることを確認します。タッチスクリーンインターフェースから37CHTDK3プログラムを選択します。

解離プログラムが完了したら、チューブの内容物を検査します。適切な解離が達成されたら、Cチューブを200Gで4°Cで5〜8分間遠心分離します。真空吸引またはピペットを使用して、上清を慎重に除去し、RPMI 1640で細胞ペレットを目的の最終注入量の半分に相当する容量に再懸濁します。

2ミリリットルの丸底マイクロ遠心チューブに、RPMI中の希釈細胞懸濁液を同量と同量のマトリゲルと組み合わせます。ピペッティングを繰り返して懸濁液を穏やかに混合し、均一性を確保します。まず、ヒトの乳房腫瘍を単一細胞懸濁液に解離します。

次に、針を取り付けていない1ミリリットルの注射器を使用して、細胞懸濁液を上下に穏やかに吸引し、均一性を確保します。26ゲージの針をシリンジに取り付け、希望の注入量を引き出します。次に、シリンジを軽くたたいたりフリックしたりして、気泡を取り除きます。

脱毛クリームの薄層をマウスの標的注射部位に塗布します。注入部位を清掃した後、うなじと背中で背側の皮膚をしっかりとつかんでマウスをしっかりと拘束し、マウスを仰臥位に置きます。針の長さを調整しながら、脂肪パッドに対して尾側に約0.5〜1センチメートルの股関節を指す45度の角度で針を挿入します。

針を脂肪パッドに進め、制御された方法で、必要な量の細胞懸濁液を注入します。注射後、針を180度回転させ、その位置を短時間維持してからゆっくりと引き抜くことで、注射部位からの細胞損失を最小限に抑えます。