このプロトコルにより、同期した出芽酵母細胞におけるS期持続時間を正確に決定することができます。これは、迅速、簡単、再現可能な方法です。さらに、従来のプロトコルでは検出されない軽度の合成欠陥を検出するのに十分な感度があります。
この方法は、出芽酵母の細胞周期調節に取り組んでいる多くの研究者にとって有用であろう。このプロトコルを実演するのは、上級研究員のニコラス・タラレクと、研究室の博士課程の学生であるフアン・デ・ディオス・バルバ・テナです。サッカロミセス・セレビシエ細胞を10ミリリットルのSC培地に低細胞濃度で接種し、摂氏30度で一晩培養し、毎分130回転の軌道攪拌を行います。
翌日、細胞を20ミリリットルの新鮮なSC培地で、1ミリリットルあたり10〜6細胞の2〜3倍の最終濃度で希釈する。水で希釈した1ミリリットルあたり1ミリグラムの40マイクロリットルでアルファ因子。次に、細胞を摂氏30度で培養し、毎分130回転で1時間軌道攪拌します。
この手順を一度繰り返します。光学顕微鏡で細胞を可視化し、G1停止を監視します。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた未突起のセルである場合は続行します。
サンプルを1, 500 Gで3分間遠心分離し、上清を真空ピペットで捨て、細胞を20ミリリットルのSC培地に再懸濁します。この手順を一度繰り返します。5分ごとに2回1ミリリットルの細胞を採取し、EDUラベリングに進みます。
リリースの30分後に400マイクロリットルのアルファファクターを追加します。1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルの10ミリモルEDUを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、転倒によりよく混合する。Pi EDUバイバリアントファクト上のEDU陽性細胞とEDU陰性細胞を区別するには、さらに1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルのDMSOを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。
振とう水浴中で攪拌しながら摂氏30度で3〜5分間インキュベートする。100マイクロリットルの100%エタノールを加えて反応を停止します。細胞を微量遠心機で10, 000 Gで2分間ペレット化します。
真空ピペットを使用して上清を除去します。細胞ペレットを500マイクロリットルの70%エタノールに再懸濁し、ボルテックスによりよく混合する。サンプルを室温で、可変速ロッカーで毎分20回の傾斜で少なくとも1時間放置し、細胞を透過させます。
細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。500マイクロリットルの10%エタノールとPBSで細胞を2回洗浄します。細胞をマイクロフュージで10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。
RNase AとプロテイナーゼKを含む200マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁し、摂氏50度で1〜2時間、または摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで廃棄します。細胞を500マイクロリットルのPBSで洗浄します。
次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。細胞ペレットを1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。
次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄し、1%BSAを含む300マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。細胞を2本の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分配します。最初のチューブはクリック反応用の200マイクロリットルの細胞培養物で構成され、2番目のチューブにはsytox緑色染色用の100マイクロリットルの細胞培養物が含まれている必要があります。
次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。sytox緑色染色の場合は、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次いで、細胞濃度に応じて、300マイクロリットルのsytox緑色混合物を含むフローサイトメーターチューブに10〜30マイクロリットルを移す。
40〜50%の振幅で2秒間サンプルを2回超音波処理フローサイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いておきます。クリック反応では、新たに調製したアジド色素バッファー40マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。暗所で室温で60分間インキュベートします。
細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。次に、PBS中の300マイクロリットルの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。次に、細胞を1ミリリットル当たり50マイクログラムのヨウ化プロピジウム100マイクロリットルにPBSに再懸濁し、暗所に10分間放置する。
細胞濃度に応じて、10〜30マイクロリットルの細胞懸濁液を、300マイクロリットルの50ミリモルトリスHCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。40〜50の振幅で2秒間2回超音波処理します。サンプルをサイトメーターで処理するまで、暗所に置いておきます。
488ナノメートルの励起青色レーザーと530 x 30バンドパスフィルターを使用して、sytoxグリーンサンプルを読み取ります。Pi X軸に488ナノメートルの励起青色レーザーと615 x 20バンドパスフィルターを使用し、Y軸に640ナノメートルの赤色励起レーザー、660 x 20バンドパスフィルターを使用して、ドットプロット上のバイエルンPi EDUサンプルを読み取ります。3つの細胞集団がバイ変量EDU Piサイトメーター分析で観察された。
摂氏25度では、細胞集団の約27%がG1期、29%がS期、約44%がG2プラスM期でした。同期細胞では、S期の持続時間は、sytoxグリーンフローサイトメータープロファイル上でDNA含有量が1つのCから2つのCに変化した時間に基づいて約25分であり得る。EDUパルスラベリングは、Sフェーズ期間を正確に決定しました。
放出の15分後、EDU陽性細胞の一部が検出され、S期の開始が示されました。S期を通る進行は、バイエルン円周率EDUグラフの細胞雲が上向きおよび右向きに移動することによって見られました。最後に、放出から35分で、細胞の一部はEDU陰性でしたが、2倍の量のDNAがあり、S期が終了し、細胞がG2プラスM期であったことを示しています。
高い同期性が観察されたにもかかわらず、一部の細胞は放出後60分でS期を終了し、S期は放出後約65分で全集団で完了しました。完全な同期を行い、細胞が第2S期に入るのを防ぐことが重要です。細胞は、核DNA複製の先見性を監視および定量できる顕微鏡で画像化できます。
この手法は、軽度のS期欠損を有する見落とし変異体、および細胞周期持続時間欠損を有する変異体を特定するのに役立つ。
